Observación de la función sistólica de aurículas derechas aisladas de cobayas

Resumen

El presente protocolo describe un método eficaz para el cribado de fármacos que aumentan la contractilidad miocárdica utilizando aurículas derechas aisladas de cobayas.

Resumen

La insuficiencia cardíaca crónica (ICC) común se caracteriza por un deterioro del llenado ventricular y/o de la función de eyección, lo que conduce a un gasto cardíaco insaciable y a un aumento de la incidencia. El deterioro de la función sistólica cardíaca es un factor clave en la patogénesis de la ICC. La función sistólica es simplemente el llenado de sangre oxigenada en el ventrículo izquierdo, seguido de la sangre que se bombea a todo el cuerpo durante un latido del corazón. Un corazón débil y la incapacidad del ventrículo izquierdo para contraerse adecuadamente a medida que el corazón late indica una función sistólica deficiente. Se han sugerido muchas hierbas tradicionales para fortalecer la función sistólica del corazón en los pacientes. Sin embargo, en el proceso de investigación de la medicina étnica aún faltan métodos experimentales estables y eficientes para el cribado de compuestos que aumentan la contractilidad miocárdica. Aquí, tomando la digoxina como ejemplo, se proporciona un protocolo sistemático y estandarizado para el cribado de compuestos que mejoran la contractilidad miocárdica mediante el uso de aurículas derechas aisladas de cobayas. Los resultados mostraron que la digoxina podría mejorar notablemente la contractilidad de la aurícula derecha. Este protocolo sistemático y estandarizado pretende servir de referencia metodológica para el cribado de los principios activos de los medicamentos étnicos en el tratamiento de la ICC.

Introducción

La insuficiencia cardíaca es causada por infarto de miocardio, miocardiopatía, sobrecarga hemodinámica, inflamación y otras causas de lesiones miocárdicas, que modifican la anatomía y la actividad miocárdica y, en última instancia, conducen a una falla en el bombeo o llenado ventricular. Las palpitaciones, el cansancio y la retención de líquidos son los principales síntomas clínicos primarios¹. La ICC es una enfermedad crónica de insuficiencia cardíaca que puede mantenerse, deteriorarse o mostrar descompensación con el tiempo, y su incidencia y prevalencia aumentan con los² años de edad. La disminución de la función sistólica cardíaca es un factor clave en la patogénesis de la ICC³. El tratamiento médico actual de la enfermedad consiste principalmente en el uso de fármacos antihipertensivos como los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, los receptores β-adrenérgicos (que inhiben la activación excesiva del sistema neurohormonal, es decir, el sistema simpático y el sistema renina-angiotensina-aldosterona) o los diuréticos (que reducen la congestión)⁴. Sin embargo, los signos clínicos de la insuficiencia cardíaca causada por la reducción del gasto y la reserva cardíaca no se abordan a menudo en los estudios que examinan el impacto de estos tratamientos médicos⁵.

Los fármacos inotrópicos positivos están diseñados para aumentar la contractilidad miocárdica. Los glucósidos cardíacos, los inhibidores de la fosfodiesterasa y los agonistas del receptor β-adrenérgico se utilizan como fármacos inotrópicos positivos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Los glucósidos cardíacos son principalmente derivados de los digitálicos ; un ejemplo es la digoxina, que es el derivado de Digitalis más utilizado y se deriva de Digitalis lanata (dedalera blanca)⁶. Se unen selectivamente a la Na⁺/K⁺-ATPasa en la membrana celular para aumentar la concentración de calcio intracelular y, por lo tanto, mejorar la contractilidad cardíaca y el volumen sistólico sin elevar la ingesta de oxígeno, mejorando así la eficiencia cardíaca⁷. Además de los glucósidos cardíacos, la mayoría de los fármacos inotrópicos positivos, como los inhibidores de la fosfodiesterasa y los agonistas del receptor β-adrenérgico, aumentan la frecuencia cardíaca y el consumo de oxígeno miocárdico, al tiempo que aumentan la carga de calcio en las células miocárdicas para mejorar la contractilidad miocárdica, lo que puede dar lugar a arritmias e hipotensión clínicamente graves y, por lo tanto, a un aumento de la mortalidad⁸. Por lo tanto, la aplicación clínica de estos fármacos inotrópicos es limitada. Con el fin de evitar complicaciones causadas por niveles elevados de calcio intracelular, es necesario desarrollar moduladores inotrópicos más seguros y altamente efectivos para el tratamiento de la ICC (Figura 1).

En las últimas décadas, se han realizado muchos estudios para generar y analizar compuestos que puedan apoyar las propiedades inotrópicas positivas de la hemodinámica cardíaca. Muchas medicinas tradicionales chinas (MTC), como Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth., Apocynum venetum L. y Sophora alopecuroides L., entre otros, pueden potenciar la contractilidad miocárdica ^9,10,11. Los estudios han demostrado que la medicina tradicional china y sus monómeros activos pueden ejercer efectos inotrópicos positivos a través de diferentes mecanismos en comparación con los fármacos inotrópicos. Por ejemplo, el liguzinodiol, una forma de ligustrazina metilada en C₂ y C₅ (un ingrediente activo del rizoma de apio de Szechwan), que mejora significativamente la contractilidad de corazones de rata aislados al aumentar los transitorios de calcio del retículo sarcoplásmico sin aumentar la frecuencia cardíaca, puede tener menos efectos secundarios y ser un mejor tratamiento para la ICC¹². Además, la matrina es un alcaloide extraído de la planta de MTC Sophora flavescens Ait. La matrina puede inhibir la regulación al alza de la expresión de la proteína_3-AR β y disminuir la expresión de eNOS en ratas modelo de insuficiencia cardíaca, mejorando así su contractilidad miocárdica¹³. Sin embargo, en la investigación en medicina étnica, hay una falta de métodos experimentales estables y eficientes para el cribado de compuestos que puedan mejorar la contractilidad miocárdica.

Es comúnmente conocido que, en comparación con otros roedores, los conejillos de indias tienen características electrofisiológicas y de manejo de calcio que son más similares a las de los humanos¹⁴. Por un lado, el electrocardiograma de los conejillos de indias es suficientemente similar al de los humanos, y su manejo latido a latido de Ca²⁺ es más similar a la fisiología humana que al de ratas o ratones^15,16. Por otro lado, los modelos computacionales de cardiomiocitos de conejillos de indias han sido objeto de una amplia investigación e incluyen subsistemas celulares cruciales, incluyendo la energía y el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno¹⁷. Por lo tanto, las aurículas derechas aisladas de cobayas se utilizan ampliamente para detectar compuestos que mejoran la contractilidad miocárdica. Aquí, tomamos la digoxina como ejemplo para proporcionar un protocolo sistemático y estandarizado para el cribado de compuestos que mejoran la contractilidad miocárdica mediante el uso de aurículas derechas aisladas de conejillos de indias. Por lo tanto, este trabajo proporciona una referencia metodológica para el cribado de los principios activos de los medicamentos étnicos en el tratamiento de la ICC.

Protocolo

El protocolo experimental se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos del Comité de Uso de Animales de Laboratorio y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Ningxia. Para el presente estudio se utilizaron cobayas Dunkin-Hartley machos con un peso de 300-450 g. El efecto de la digoxina sobre la contractilidad se observó en aurículas derechas aisladas de los cobayos (Figura 2).

1. Preparación de la oxigenación de las aurículas derechas aisladas de cobayas

1. Preparar los instrumentos experimentales, incluyendo un sistema de adquisición y procesamiento de señales biológicas, un transductor de fuerza muscular JH-2, un baño Magnus, un gancho de ventilación en forma de L, tijeras gruesas, una placa de Petri, parafina, etc. (ver Tabla de Materiales).
2. Prepare 1.000 ml de solución de Krebs-Henseleit (solución K-H) añadiendo 7,02 g de NaCl (120,0 mM), 2,10 g de NaHCO₃ (25,0 mM), 0,30 g de KCl (4,0 mM), 0,07 g de MgSO₄ (0,6 mM), 0,07 g de NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,28 g de CaCl₂ (2,5 mM) y 1,98 g de glucosa (11,0 mM) en 1.000 mL de agua bidestilada, y enjuague el baño Magnus dos o tres veces (consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales).
   NOTA: Mantenga la temperatura de la solución K-H a 37 °C ± 1 °C.
3. Prepare 100 mL de solución K-H baja en calcio agregando 0,70 g de NaCl (120,0 mM), 0,21 g de NaHCO₃ (25,0 mM), 0,03 g de KCl (4,0 mM), 0,01 g de MgSO₄ (0,6 mM), 0,01 g de NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,01 g de CaCl₂ (0,8 mM) y 0,20 g de glucosa (11,0 mM) en 100 mL de agua bidestilada (ver Tabla 1 y Tabla de Materiales).
4. Coloque aproximadamente 20 mL de la solución K-H a 37 °C en el recipiente de operación (consulte la Tabla de Materiales).
5. Extienda 5 mm de parafina espesa sobre el fondo de la placa de Petri y luego llene la placa de Petri con la solución K-H a 37 °C (consulte la Tabla de materiales).
6. Instale el gancho de ventilación en forma de L en el extremo del tubo de látex de la vejiga, colóquelo en la placa de Petri y ajuste a 1-2 burbujas/s (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Ajuste lentamente las burbujas; Si la acción es demasiado rápida, es posible que el oxígeno se agote pronto.

2. Preparación de aurículas derechas aisladas de cobayas

1. Pesa los conejillos de indias en una báscula (ver Tabla de Materiales).
2. Induzca la anestesia utilizando una caja de inducción con 5% de isoflurano en oxígeno al 100%, y luego cambie a un cono de nariz con 1,5%-3% de isoflurano para el mantenimiento (ver Tabla de Materiales).
3. Cortar la arteria carótida con unas tijeras ásperas e inducir la exanguinación antes de colocarla en un plato. Luego, con unas tijeras, abra el tórax (comenzando con la apófisis xifoides y separando completamente los lados para exponer el corazón) y retire el pericardio.
   1. Sostenga el corazón con la mano izquierda, use la mano derecha para cortar el corazón de la raíz de la aorta y colóquelo rápidamente en el recipiente quirúrgico con la solución K-H. Finalmente, presione suavemente el ventrículo con la mano dos o tres veces, exprima la sangre ventricular y coloque el corazón en la placa de Petri.
      NOTA: La acción debe ser enérgica y completarse en 2-5 minutos, y la temperatura debe controlarse a 35 °C. La temperatura de la solución K-H debe controlarse a 37 °C.
4. Fije la punta del corazón a la placa de Petri recubierta de parafina con una aguja mientras proporciona oxígeno (60 burbujas/min).
5. Identifica la aurícula derecha.
   NOTA: En los conejillos de indias, las aurículas están separadas en su superficie ventral por la arteria pulmonar y dorsalmente por la aorta. Tanto la aurícula izquierda como la derecha están unidas a los ventrículos como un "triángulo invertido", y la aurícula derecha es ligeramente más pequeña que la aurícula izquierda y tiene bordes desiguales. El miocardio del ventrículo derecho es delgado y el extremo superior del colapso es la aurícula derecha; el ventrículo izquierdo está más hinchado y la distribución de los vasos coronarios es rica¹⁸ (Figura 3).
6. Levante suavemente el borde de la aurícula derecha con pinzas oftálmicas y corte a lo largo de la unión auriculoventricular (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Evite dañar el nódulo sinoauricular y trate de cortar más cerca del ventrículo mientras corta a lo largo de la unión auriculoventricular. En este paso se puede observar una contracción rítmica automática de la aurícula derecha.
7. Use suturas quirúrgicas 4-0 (ver Tabla de Materiales) para ligar la parte superior e inferior de la aurícula derecha, respectivamente (ambos extremos de la "línea diagonal"), con un extremo en bucle y el otro extremo izquierdo con un extremo de rosca largo que también esté en bucle.
   NOTA: Trate de ligar la menor cantidad posible de tejidos al ligar ambos extremos de la "línea diagonal" de las aurículas.

3. Medición y registro de la función sistólica de aurículas derechas aisladas de cobayas

1. Encienda la computadora e ingrese al sistema de adquisición y procesamiento de señales biológicas (consulte la tabla de materiales). Ajuste la ganancia (50 mV), la constante de tiempo (CC), el filtro (20 Hz) y la velocidad de escaneo (1,00 s/div) después de determinar el canal de conexión (primer canal, tensión).
2. Cuelgue un extremo del espécimen en el gancho de ventilación en forma de L con la placa de Petri y el oxígeno al lado del baño Magnus. Cuelgue el otro extremo de la muestra en el transductor de fuerza muscular JH-2 (consulte la tabla de materiales).
3. Observe la curva sistólica auricular, ajuste la precarga a 0,5-1,0 g y espere a que se estabilice (unos 30 min).
   NOTA: Cambie la solución K-H cada 20 min. Cuando sea normal, tome la curva observada como estándar y marque como "normal". Si la pantalla se escanea un poco rápido, esto debe ralentizarse.
4. Administre 0,2 mL de solución K-H baja en calcio y observe durante 5 min hasta que la curva ya no descienda.
5. Administre 0,2 mL de digoxina al 5% (ver Tabla de Materiales), observe durante 5 min, lave tres veces y luego vuelva a la normalidad.
   NOTA: Marque la administración. Cuando el efecto sea obvio, escanee la pantalla más rápido. Cuando la curva ya no sube, es decir, cuando la amplitud de la contracción ya no aumenta, lavar tres veces rápidamente; De lo contrario, se producirá una arritmia, que afectará a los resultados de los experimentos farmacológicos posteriores.
6. Recopile los datos y guárdelos en un disquete.

Resultados

La disminución de la contractilidad miocárdica provoca un gasto cardíaco insuficiente, lo que conduce a la ICC (Figura 1). Este protocolo permitió el registro de los efectos de diferentes fármacos sobre la función sistólica de aurículas derechas aisladas de cuyes y luego el cribado rápido de compuestos de fármacos étnicos que potencian la contractilidad miocárdica. Después de conectar la aurícula derecha, el transductor de fuerza muscular JH-2 y el sistema de adquisición y procesamiento de s...

Discusión

La actividad rítmica normal del corazón requiere un entorno físico y químico adecuado, al igual que la actividad de las aurículas derechas aisladas. Las aurículas derechas aisladas se aíslan de la inervación del cuerpo y se observa la influencia directa de factores humorales sistémicos, lo que significa que se pueden observar cambios en la actividad de las aurículas derechas al cambiar los fármacos a los que están expuestas. Las causas fundamentales de la actividad bioeléctrica en las cé...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-0 sutura quirúrgica	Yangzhou   Fuda  Médico  Dispositivos Co.,
5% Digoxin (soluble en dimetilsulfóxido)	TCI Shanghai	D1828	CAS: 20830-75-5; Pureza: >96.0%
BL-420N sistema de procesamiento y adquisición de señales biológicas	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS: 10043-52-4; Pureza: 96%
Glucosa	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS: 50-99-7; Pureza: 99%
Isoflurano	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2 transductor de fuerza muscular	Instituto de Ingeniería Médica Aeroespacial, Pekín, China
KCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS: 7447-40-7; Pureza: 99.5%
Baño Magnus	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS: 7487-88-9; Pureza: 98%
NaCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS: 7647-14-5; Pureza: 99.5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS: 7558-80-7; Pureza: 99%
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS: 144-55-8; Pureza: 99.8%
Cuenca de operación	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Pinza oftálmica	Suzhou   Shuanglu  Médico  Instrumento Co.,
Ltd Tijera de operación oftálmica	Suzhou  Shuanglu  Médico  Instrumento Co.,
Ltd Parafina	Leica Biosystems
Placa de Petri	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Máquina de anestesia para roedores	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		Tipo ABS (un solo canal)
Escala	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Placa quirúrgica	Zhengzhou   Ketai  Experimento  Equipo Co.,		21 cm x 31 cm
Tijera de pañuelo	Suzhou  Shuanglu  Médico  Instrumento Co.,  Ltd	SL0023