Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.
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Artículo de método
Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala
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Resumen
Resumen
Las redes de genes sintéticos proporcionan una plataforma para que los científicos e ingenieros diseñen y construyan sistemas novedosos con funcionalidad codificada a nivel genético. Si bien el paradigma dominante para el despliegue de redes de genes se encuentra dentro de un chasis celular, las redes de genes sintéticos también pueden desplegarse en entornos libres de células. Entre las aplicaciones prometedoras de las redes de genes libres de células se encuentran los biosensores, ya que se ha demostrado que estos dispositivos se encuentran contra objetivos bióticos (virus del Ébola, Zika y SARS-CoV-2) y abióticos (metales pesados, sulfuros, pesticidas y otros contaminantes orgánicos). Los sistemas libres de células generalmente se implementan en forma líquida dentro de un recipiente de reacción. Sin embargo, ser capaz de incrustar tales reacciones en una matriz física puede facilitar su aplicación más amplia en un conjunto más amplio de entornos. Con este fin, se han desarrollado métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en una variedad de matrices de hidrogel. Una de las propiedades clave de los hidrogeles que conducen a este trabajo es la alta capacidad de reconstitución en agua de los materiales de hidrogel. Además, los hidrogeles poseen características físicas y químicas que son funcionalmente beneficiosas. Los hidrogeles se pueden liofilizar para su almacenamiento y rehidratarse para su uso posterior. Se presentan dos protocolos paso a paso para la inclusión y el ensayo de reacciones de CFPS en hidrogeles. En primer lugar, se puede incorporar un sistema CFPS a un hidrogel mediante rehidratación con un lisado celular. El sistema dentro del hidrogel puede ser inducido o expresado constitutivamente para una expresión completa de proteínas a través del hidrogel. En segundo lugar, el lisado celular se puede introducir en un hidrogel en el punto de polimerización, y todo el sistema se puede liofilizar y rehidratar en un punto posterior con una solución acuosa que contiene el inductor del sistema de expresión codificado dentro del hidrogel. Estos métodos tienen el potencial de permitir redes de genes libres de células que confieren capacidades sensoriales a los materiales de hidrogel, con el potencial de ser desplegados más allá del laboratorio.
Introducción
La biología sintética integra diversas disciplinas de ingeniería para diseñar y diseñar piezas, dispositivos y sistemas de base biológica que puedan realizar funciones que no se encuentran en la naturaleza. La mayoría de los enfoques de biología sintética todavía están ligados a células vivas. Por el contrario, los sistemas de biología sintética libres de células facilitan niveles sin precedentes de control y libertad en el diseño, lo que permite una mayor flexibilidad y un tiempo más corto para la ingeniería de sistemas biológicos, al tiempo que elimina muchas de las limitaciones de los métodos tradicionales de expresión génica basados en célu....
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Protocolo
1. Tampón de lisado celular y preparación de medios
- Preparación de 2x agar YT+P y medio
- Prepare 2 agar YT+P midiendo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1M KH2PO4 y 15 g/L de agar. Para el caldo 2x YT+P, siga la composición anterior pero omita el agar.
- Esterilice esterilizando en autoclave el 2x YT+P.
- Preparación del tampón S30A
- Preparar el tampón S30A con 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato y 25 mL/L de 2 M de Tris, ajustado a pH 7,7 con ácido acético.
- Guarde el t....
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Resultados
Este protocolo detalla dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel, con la Figura 1 presentando una descripción general esquemática de los dos enfoques. Ambos métodos son susceptibles de liofilización y almacenamiento a largo plazo. El método A es la metodología más utilizada por dos razones. En primer lugar, se ha demostrado que es el método más aplicable para trabajar con una variedad de materiales de hidrogel11. En segundo lugar, el Método.......
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Discusión
A continuación se describen dos protocolos para la incorporación de reacciones de CFPS basadas en lisado de células de E. coli en hidrogeles de agarosa. Estos métodos permiten la expresión génica simultánea en todo el material. El protocolo se puede adaptar a otros sistemas de CFPS y se ha llevado a cabo con éxito con kits de CFPS disponibles en el mercado, además de los lisados celulares preparados en laboratorio que se detallan aquí. Es importante destacar que el protocolo permite la expresión génica en ausenc.......
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Agradecimientos
Los autores agradecen enormemente el apoyo de los premios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) y BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), y del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas - Laboratorios de Ciencia y Tecnología de Defensa EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Los datos que respaldan esta publicación están disponibles en abierto en: 10.25405/data.ncl.22232452. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuerte | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Ácido acético | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarosa | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Kit de muestreo de aminoácidos | VWR | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzima A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Ácido folínico | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamato | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lisozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamato | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Kit de concentración de proteínas | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Espermidina | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Triptona | Thermo Fisher Scientific 211705 | ||
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| ARNt | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Extracto de levadura | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL tubos de microcentrífuga | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K Casetes de diálisis MWCO | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Frascos de centrífuga de 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Frascos de centrífuga de 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus Liofilizador | Christ | N.º de pieza 101521, 101522, 101527 | |
| Centrífuga de sobremesa | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Negro Placas de microtitulación de 384 pocillos | Fischer Scientific | 66 | |
| Cubetas | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Microcentrífuga Elga | ##### | |
| Eppendorf 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| Centrífuga de alta velocidad | Beckman Coulter | B34183 | |
| Licencia JMP Agitador | SAS Institute | 15 | |
| Fischer Scientific | 15353518 | ||
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Fotoespectrómetro (Biofotómetro) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipetas y puntas | Gilson | ##### | |
| Balanza de precisión | Fluorímetro Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Incubadora de agitación | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Desmembrador sónico (sonicador) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Incubadora estática | Sanyo | MIR-162 | |
| Jeringas y agujas | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Incubadora agitadora) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux Lector de placas | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° c metro | VWR | 662-1657 |
Referencias
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbo....
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Reimpresiones y permisos
