El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender los comportamientos normales y aberrantes de las células in vivo es necesario para desarrollar intervenciones clínicas que frustren el inicio y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es fundamental optimizar los enfoques de imagen que faciliten la observación de la dinámica celular in situ, donde la estructura y la composición de los tejidos permanecen inalteradas. La epidermis es la barrera más externa del cuerpo, así como la fuente de los cánceres humanos más prevalentes, a saber, los carcinomas cutáneos de piel. La accesibilidad del tejido cutáneo presenta una oportunidad única para monitorizar el comportamiento de las células epiteliales y dérmicas en animales intactos mediante microscopía intravital no invasiva. Sin embargo, este sofisticado enfoque de imagen se ha logrado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales, que representan una barrera de entrada significativa para la mayoría de los investigadores. Este estudio presenta un inserto de platina de microscopio impreso en 3D diseñado a medida y adecuado para su uso con microscopios confocales invertidos, lo que agiliza la obtención de imágenes intravitales a largo plazo de la piel del oído en ratones transgénicos vivos. Creemos que esta versátil invención, que puede personalizarse para adaptarse a la marca y el modelo de microscopio invertido de elección y adaptarse a la obtención de imágenes de sistemas de órganos adicionales, resultará invaluable para la comunidad de investigación científica en general al mejorar significativamente la accesibilidad de la microscopía intravital. Este avance tecnológico es fundamental para reforzar nuestra comprensión de la dinámica de las células vivas en contextos normales y de enfermedad.
Introducción
La microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite el monitoreo de los comportamientos celulares en sus ambientes in vivo no perturbados. Este método único ha proporcionado información clave sobre el funcionamiento interno de los complejos sistemas de órganos de los mamíferos, incluidos el pulmón1, el cerebro2, el hígado3, la glándula mamaria4, el intestino5 y la piel6. Además, este enfoque ha revelado alteraciones del comportamiento celular durante el desarrollo tumoral7, la cicatrización de heridas8,9, la inflamación10 y otras patologías diversas in situ. En este estudio, nos centramos en mejorar la accesibilidad de la microscopía intravital para obtener imágenes de la dinámica epitelial y estromal en vivo en la piel intacta del ratón. La comprensión del comportamiento celular en la piel de mamíferos es de gran importancia clínica debido a la notable capacidad regenerativa y tumorigénica de este tejido.
La obtención de imágenes intravitales en ratones se ha realizado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales debido a su capacidad para proporcionar imágenes de alta resolución a profundidades tisulares >100 μm11,12. Sin embargo, estos instrumentos carecen de la versatilidad y la accesibilidad más general de los microscopios confocales invertidos, que son más fáciles de usar y rentables, proporcionan la capacidad de obtener imágenes de células cultivadas, no requieren oscuridad completa durante la adquisición de imágenes y, en general, son más seguros, entre otras ventajas notables13,14. En este estudio, presentamos una nueva herramienta que mejora significativamente la accesibilidad a las imágenes intravitales mediante la adaptación de este enfoque para microscopios confocales invertidos.
Aquí, presentamos un diseño de inserto de platina personalizado impreso en 3D que incorpora varias características clave para facilitar la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de la piel del oído de ratón en un microscopio confocal invertido (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5). Estas características especializadas incluyen un orificio de objetivo desplazado que permite que todo el cuerpo de un ratón adulto quede completamente plano durante la obtención de imágenes. Esto minimiza la interferencia vibratoria de los movimientos del cuerpo del ratón en las imágenes y elimina la necesidad de administrar ketamina y xilacina para amortiguar la respiración, una práctica que a menudo se combina con las imágenes intravitales6. Además, los soportes de las esquinas del inserto colocan correctamente un cono de nariz de isoflurano para alinearlo con la cara del ratón, un clip metálico para la oreja inmoviliza la oreja del ratón a un disco de cubreobjetos hecho a medida, y una placa térmica de biorretroalimentación de circuito cerrado desmontable opcional se encuentra al ras del inserto para soportar la temperatura corporal del ratón durante las largas sesiones de imágenes. El disco de cubreobjetos personalizado, que proporciona una superficie plana esencial para que la cabeza y la oreja del ratón queden planas, se generó en un taller mecánico quitando las paredes de una placa de cultivo celular genérica que contenía cubreobjetos. El uso de una lente de inmersión en aceite de silicona de 40x (apertura numérica de 1,25 [N.A.], distancia de trabajo de 0,3 mm) junto con el disco de cubreobjetos y el inserto de platina personalizado proporciona imágenes de alta resolución a >50 μm de profundidad en la dermis del oído.
Para probar la funcionalidad de este nuevo inserto de platina de microscopio invertido, capturamos pilas z que abarcan todas las capas epiteliales epidérmicas durante un curso de tiempo de 3 h en el oído de un ratón adulto transgénico vivo K14-H2B-mCherry15 (los núcleos epiteliales de esta línea de ratones contienen una etiqueta fluorescente roja) (Figura 6A-A'). También capturamos pilas z que abarcan varias capas de fibroblastos dentro de la dermis de la piel durante un curso de tiempo de 3 h en el oído de un Pdgfra-rtTA16 transgénico vivo; Ratón adulto pTRE-H2B-GFP17 (los núcleos de fibroblastos de esta línea de ratones contienen una etiqueta fluorescente verde tras la inducción de doxiciclina) (Figura 6B-D'). Nuestros datos de alta resolución demuestran una estabilidad constante por falta de deriva en los planos x, y y z, lo que demuestra la eficacia de esta nueva herramienta de imágenes intravitales para su uso en microscopios invertidos. Es importante destacar que las dimensiones de este inserto de platina impreso en 3D se pueden ajustar, como se describe en el Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2 y el Archivo Suplementario 3, para adaptarse a cualquier microscopio invertido, y la posición de la abertura del objetivo se puede mover a ubicaciones alternativas dentro del inserto para adaptarse mejor a la obtención de imágenes de un tejido particular y/o modelo animal de interés. Por lo tanto, esta invención puede capacitar a los laboratorios individuales, o a los investigadores con acceso confocal a las instalaciones básicas, para adaptar esta herramienta a sus necesidades únicas de imágenes intravitales, agilizando así la evaluación de la biología celular in vivo diversa.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Esta investigación se realizó de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales de la Universidad de Emory y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Atlanta y ha sido aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
1. Instalación del inserto de imágenes en vivo en la platina del microscopio invertido
- Construya la inserción utilizando archivos .stl (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3) especificando las dimensiones y el diseño 3D (consulte la Figura 1 y la Figura 2A), una impresora 3D y ácido poliláctico (PLA).
- Coloque con cuidado el inserto (Figura 2B, C) en la ranura de la platina grande del microscopio (Figura 2C y Figura 3A). Utilice tornillos para asegurar el inserto a través de cuatro orificios para tornillos ubicados en cada esquina del inserto (Figura 2B-C).
NOTA: El inserto es bidireccional y se puede girar 180° dependiendo de la orientación de la platina del microscopio y del aparato de anestesia. - Deslice la placa calefactora en el tapón de inserción con el lado hacia abajo (Figura 2D) de modo que la unidad quede encima de las ranuras de inserción inferiores con el puerto de enchufe pasando por debajo de la platina (Figura 3B).
- Alinee la abertura circular ranurada en el inserto con un objetivo de inmersión en aceite de silicona 40x (Figura 3C) y aplique aceite de silicona en el centro del objetivo.
- Si toma imágenes durante períodos de tiempo más largos (>1 h), aplique una generosa cucharada de aceite que persistirá en la interfaz cubreobjetos/objetivo durante la toma de imágenes. No permita que el aceite se derrame sobre los bordes de la lente.
- Use una jeringa para aplicar una pequeña cantidad de grasa de vacío a lo largo de la abertura circular ranurada y coloque el disco de cubreobjetos encima para sellar el inserto (Figura 3D).
NOTA: El disco de cubreobjetos se crea quitando las paredes de una placa de cultivo celular con fondo de vidrio de 35 mm x 10 mm (realizada por un taller mecánico). - Levante el objetivo 40x hasta que el aceite bese el fondo del cubreobjetos de vidrio.
2. Configuración del isoflurano y preparación del ratón
- Coloque los componentes del vaporizador electrónico de bajo flujo (cámara de anestesia, tubo, vaporizador, recipiente de carbón) para permitir que el cono de la nariz y el tubo adjunto lleguen al inserto (Figura 3A).
PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico inhalatorio y debe manipularse con cuidado para evitar derrames y minimizar la exposición humana. - Mida el peso del frasco de isoflurano antes de usarlo y regístrese. Coloque la tapa del vaporizador electrónico en la botella de isoflurano.
- Conecte el cable de alimentación al vaporizador electrónico. Cierre las pinzas azules del cono de la nariz y abra las pinzas blancas de la cámara de inducción para permitir el flujo de aire a través de la cámara hacia el recipiente de carbón. Retire la tapa roja de aire ambiente del lado izquierdo de la máquina para permitir el flujo de aire.
- Deje que el sistema se caliente durante 5 minutos a 200 ml/min (flujo bajo) e isoflurano al 2%.
NOTA: Aunque se selecciona la configuración del cono de la nariz, la línea del cono de la nariz azul debe permanecer cerrada y la línea blanca de la cámara de inducción debe permanecer abierta. - Una vez que el sistema esté correctamente equilibrado, purgue las líneas para eliminar el isoflurano restante de la cámara.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción y seleccione High Flow. Complete toda la preparación del ratón (es decir, depilación, administración tópica de medicamentos, aplicación de ungüento para los ojos, etc.) antes de colocar el cuerpo del animal sobre el inserto. Confirme que el ratón está completamente anestesiado utilizando el método del reflejo de pellizco de los dedos de los pies.
- Con la pierna extendida, use una uña para pellizcar firmemente el dedo del pie sin causar daño físico. Si el ratón muestra una reacción positiva al estímulo (es decir, retracción de las patas, contracción de los pies, etc.), continúe administrando anestésico dentro de la cámara hasta que no se observe ninguna reacción. Una vez anestesiado adecuadamente, la frecuencia respiratoria del ratón debe disminuir a ~55-65 respiraciones por minuto18.
- Cuando el ratón esté completamente anestesiado, vuelva a seleccionar High Flow para detener la administración de isoflurano. Purgue la cámara antes de abrirla y ajuste los clips (azul: abierto; blanco: cerrado) para administrar isoflurano a través del cono de la nariz. Seleccione Low Flow (Flujo bajo) mientras el cono de la nariz está conectado al mouse para continuar con la administración de isoflurano.
- Pase el tubo de isoflurano con el cono de la nariz adjunto a través del soporte del tubo de esquina en el inserto (Figura 3A y Figura 5).
3. Colocación del ratón en el inserto para la obtención de imágenes intravitales
- Conecte la placa calefactora al controlador (que contiene una sonda anal adjunta), enciéndala y deje que la placa alcance los 36 °C (Figura 4A).
- Retire el ratón anestesiado de la cámara de inducción y colóquelo sobre la placa calefactora (Figura 4B y Figura 5A). Realice la transferencia de la cámara a la inserción rápidamente para minimizar el tiempo que el ratón está activo sin anestesia inhalante.
- Fije el cono de la nariz en el ratón (Figura 4B, C y Figura 5). Si es necesario, use cinta adhesiva para asegurar aún más el ángulo y la posición del cono de la nariz.
- Inserte la sonda anal y ajuste la temperatura del controlador hasta que la temperatura corporal del mouse sea estable a ~36 °C (Figura 4A, B). Una vez que el mouse esté colocado correctamente, use una envoltura adhesiva de plástico para atrapar el calor, si es necesario, para mantener aún más la temperatura corporal adecuada (Figura 4C).
- Coloque el mouse de manera que la cabeza se alinee con el disco de cubreobjetos e inmovilice la oreja en el centro del cubreobjetos de vidrio con un clip metálico para la oreja (Figura 5A, B) o cinta adhesiva (Figura 5C).
NOTA: La presión de la pinza metálica sobre la oreja se puede ajustar aflojando el tornillo que fija la pinza al inserto. Se puede agregar un resorte de metal para aumentar la flexibilidad de apriete del clip.- Para cambiar la ubicación de la pinza para la oreja, desenrosque el perno con una llave Allen de 2,5 mm y transfiéralo al sitio secundario (Figura 2B, C). Al volver a montar el clip para la oreja, colóquelo contra el inserto, seguido de la arandela en la parte superior. Use un perno para sujetar firmemente el clip con una ligera fuerza para pivotar el clip.
- Ajuste la posición z del objetivo hasta que las celdas estén dentro del lugar focal (Figura 6A, D). Establezca los parámetros de pila z y lapso de tiempo de acuerdo con los objetivos experimentales y comience la adquisición de imágenes.
NOTA: Si se logra la configuración correcta, se pueden obtener imágenes de la oreja del ratón durante al menos 3 h consecutivas (Figura 6A', D').- Una vez establecidos los límites de la pila z, ajuste la potencia y la ganancia del láser para asegurarse de que ningún plano z esté sobresaturado para minimizar el fotoblanqueo. Determine los parámetros de lapso de tiempo utilizando el grosor total de la pila z, los números de paso (se recomienda el muestreo de Nyquist) y los intervalos de tiempo.
- Determine los parámetros de imagen (intervalos de tiempo, tiempo total de obtención de imágenes, etc.) utilizando múltiples factores, incluida la viabilidad de los animales bajo anestesia, el fotoblanqueo/fototoxicidad inducido por láser y el objetivo de las imágenes en vivo (es decir, la dinámica de la división celular, las interacciones célula-célula, etc.).
4. Terminación de la imagen
- Encienda la almohadilla térmica de circulación de agua y configúrela en Ciclo continuo y 35 °C durante al menos 30 minutos antes de finalizar la adquisición de la imagen.
- Al finalizar la obtención de imágenes, seleccione Low Flow en el vaporizador electrónico para detener la administración de isoflurano y mueva el mouse a una almohadilla térmica hasta que sea ambulatorio.
- Una vez despierto, mueva el mouse de regreso al recipiente de transferencia mientras continúa manteniéndolo en una almohadilla térmica hasta que esté completamente ambulatorio. Supervise constantemente el mouse mientras está en el panel térmico hasta que responda.
- En el vaporizador electrónico, haga clic en Seleccionar menú > Control anestésico > vacío. Retire el frasco de isoflurano del sistema y vuelva a colocar la tapa del fabricante en el frasco.
- Mida el peso de la botella de isoflurano y el recipiente de carbón e ingrese los pesos en el registro. Una vez que el recipiente de carbón pese 50 g por encima de la medición de referencia, deseche el recipiente y reemplácelo por una unidad nueva. Regrese el isoflurano a la caja de seguridad.
- Retire el disco deslizante y límpielo con papel para lentes y solución para lentes. Almacenar adecuadamente para evitar arañazos para su reutilización.
- Retire el tubo de anestesia del soporte del inserto y desenrosque el inserto de la platina del microscopio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El ensamblaje adecuado del inserto de imágenes en vivo en un microscopio confocal invertido y la orientación apropiada de un ratón transgénico sobre el inserto se validan mediante la adquisición de pilas z de tejido auditivo vivo marcado con fluorescencia durante un curso de tiempo ≥1 h con evidencia mínima de deriva en los ejes x, y y z. Las imágenes deben capturarse a intervalos constantes (el tiempo del intervalo dependerá de la cuestión biológica, la intensidad de la señal de fluorescencia, etc.) para que la dinámica...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este estudio, presentamos una nueva herramienta que facilita la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de epitelios de piel de ratón intactos en microscopios confocales invertidos. Este invento está hecho de PLA, que es el material imprimible en 3D más común y económico; todos los costes internos de impresión 3D de este inserto ascienden a 5 < dólares. Las dos piezas de inserción separadas (Figura 1, Archivo Suplementario 1 y Lima Suplementari...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Valentina Greco por los ratones K14-mCherry-H2B. Agradecemos al Taller de Máquinas del Departamento de Física de la Universidad de Emory por generar los discos de cubreobjetos de vidrio. Este trabajo fue financiado por el Premio al Desarrollo Profesional #IK2 BX005370 del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. BLRD Service to LS, los premios NIH RF1-AG079269 y R56-AG072473 a MJMR, y el premio I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award a MJMR.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Impresora 3D | Qudi Tech | i-Fast | Impresiones 3D con material PLA |
| 40x 1.25NA lente de objetivo de silicona | Nikon | ||
| AxR Microscopio confocal de escaneo láser | Nikon | ||
| VWR | 76337-046 Aplicación de | crema/ungüento | |
| Hiclato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | Induce el marcaje de GFP de los núcleos de fibroblastos en Pdgfra-rtTA; Destornillador de cabeza plana para ratones pTRE-H2B-GFP |
| (2,5 mm) | Inserto de affiix para la etapa del microscopio | ||
| Tornillos de cabeza plana x 4 (#6-32) | Inserto de tornillo Nikon en la | etapa del microscopio | |
| Fondo de vidrio Plato de cultivo | chemglass Ciencias de la Vida | CLS-1811-002 | Modificado mediante la eliminación de las paredes del plato para su uso como disco de cubreobjetos compatible con el inserto vivo; el disco de 35 mm de ancho contiene cubreobjetos de vidrio de 20 mm de ancho; las paredes del plato fueron Retirado por el taller mecánico |
| Controlador de placa de calor | Physitemp | TCAT-2LV | Controlador de temperatura animal - Bajo voltaje; Accesorio de prueba anal para el control de la temperatura corporal del ratón |
| Llave hexagonal (1,5 mm) | Para ajustes de tornillo de fijación M3 | ||
| Llave hexagonal (2,5 mm) | Ajuste de la tensión en la pinza metálica para la oreja | ||
| Inserto | |||
| de imagen intravitalIsoflurano | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Cinta de etiquetado de anestesia para ratones |
| (o cinta adhesiva) | VWR | 10127-458 | Alternativa a la pinza metálica para inmovilizar la oreja al cubreobjetos |
| Cierre | utilizado como pinza para la oreja | ||
| Ratón: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Promotor específico de fibrroblasto que impulsa la expresión de rtTA inducible por doxiciclina |
| Ratón: K14-H2BPAmCherry | Cortesía de la Dra. Valentina Greco en la Universidad | células epiteliales epidérmicas con mCherry; referido en el texto como "K14-H2B-mCherry" | |
| Ratón: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | El Laboratorio Jackson | RRID: IMSR_JAX:005104 | Etiquetas núcleos de fibroblastos con GFP cuando se combinan con Pdgfra-rtTA e inducidos con doxiciclina |
| Envoltura de sellado multiusos | Glad | Enhance mouse warm's | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Lubricante ocular |
| Tornillos de fijación x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Accesorio para módulo de placa calefactora |
| Aceite de inmersión de silicona Aplicado | a silicona 40x objetivo | ||
| Placa calefactora para animales pequeños | Physitemp | HP-4M | Proporciona calor a los animales |
| Somnoflow Vaporizador electrónico de bajo flujo | Kent Scientific | SF-01 | Anestesia de ratón |
| Grasa al vacío | Flinn Scientific | AP1095 | Sella el disco de deslizamiento para insertar |
| la depilación Veet | |||
| Almohadilla térmica de circulación de agua | Stryker Medical | TP700 | para la reactivación del ratón después de la obtención de imágenes |
Referencias
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196(2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Multidimensional imaging of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634(2023).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
