El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.
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Artículo de método
Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido
En este artículo
Resumen
Resumen
Comprender los comportamientos normales y aberrantes de las células in vivo es necesario para desarrollar intervenciones clínicas que frustren el inicio y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es fundamental optimizar los enfoques de imagen que faciliten la observación de la dinámica celular in situ, donde la estructura y la composición de los tejidos permanecen inalteradas. La epidermis es la barrera más externa del cuerpo, así como la fuente de los cánceres humanos más prevalentes, a saber, los carcinomas cutáneos de piel. La accesibilidad del tejido cutáneo presenta una oportunidad única para monitorizar el comportamiento de las células epiteliales y dérmicas en animales intactos mediante microscopía intravital no invasiva. Sin embargo, este sofisticado enfoque de imagen se ha logrado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales, que representan una barrera de entrada significativa para la mayoría de los investigadores. Este estudio presenta un inserto de platina de microscopio impreso en 3D diseñado a medida y adecuado para su uso con microscopios confocales invertidos, lo que agiliza la obtención de imágenes intravitales a largo plazo de la piel del oído en ratones transgénicos vivos. Creemos que esta versátil invención, que puede personalizarse para adaptarse a la marca y el modelo de microscopio invertido de elección y adaptarse a la obtención de imágenes de sistemas de órganos adicionales, resultará invaluable para la comunidad de investigación científica en general al mejorar significativamente la accesibilidad de la microscopía intravital. Este avance tecnológico es fundamental para reforzar nuestra comprensión de la dinámica de las células vivas en contextos normales y de enfermedad.
Introducción
La microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite el monitoreo de los comportamientos celulares en sus ambientes in vivo no perturbados. Este método único ha proporcionado información clave sobre el funcionamiento interno de los complejos sistemas de órganos de los mamíferos, incluidos el pulmón1, el cerebro2, el hígado3, la glándula mamaria4, el intestino5 y la piel6. Además, este enfoque ha revelado alteraciones del comportamiento celular durante el desarrollo tumoral7,
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Protocolo
Esta investigación se realizó de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales de la Universidad de Emory y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Atlanta y ha sido aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
1. Instalación del inserto de imágenes en vivo en la platina del microscopio invertido
- Construya la inserción utilizando archivos .stl (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3) especificando las dimensiones y el diseño 3D (consulte la Figura 1 y la Figura 2A....
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Resultados
El ensamblaje adecuado del inserto de imágenes en vivo en un microscopio confocal invertido y la orientación apropiada de un ratón transgénico sobre el inserto se validan mediante la adquisición de pilas z de tejido auditivo vivo marcado con fluorescencia durante un curso de tiempo ≥1 h con evidencia mínima de deriva en los ejes x, y y z. Las imágenes deben capturarse a intervalos constantes (el tiempo del intervalo dependerá de la cuestión biológica, la intensidad de la señal de fluorescencia, etc.) para que la dinámica.......
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Discusión
En este estudio, presentamos una nueva herramienta que facilita la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de epitelios de piel de ratón intactos en microscopios confocales invertidos. Este invento está hecho de PLA, que es el material imprimible en 3D más común y económico; todos los costes internos de impresión 3D de este inserto ascienden a 5 < dólares. Las dos piezas de inserción separadas (Figura 1, Archivo Suplementario 1 y Lima Suplementari.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Valentina Greco por los ratones K14-mCherry-H2B. Agradecemos al Taller de Máquinas del Departamento de Física de la Universidad de Emory por generar los discos de cubreobjetos de vidrio. Este trabajo fue financiado por el Premio al Desarrollo Profesional #IK2 BX005370 del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. BLRD Service to LS, los premios NIH RF1-AG079269 y R56-AG072473 a MJMR, y el premio I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award a MJMR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Impresora 3D | Qudi Tech | i-Fast | Impresiones 3D con material PLA |
| 40x 1.25NA lente de objetivo de silicona | Nikon | ||
| AxR Microscopio confocal de escaneo láser | Nikon | ||
| VWR | 76337-046 Aplicación de | crema/ungüento | |
| Hiclato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | Induce el marcaje de GFP de los núcleos de fibroblastos en Pdgfra-rtTA; Destornillador de cabeza plana para ratones pTRE-H2B-GFP |
| (2,5 mm) | Inserto de affiix para la etapa del microscopio | ||
| Tornillos de cabeza plana x 4 (#6-32) | Inserto de tornillo Nikon en la | etapa del microscopio | |
| Fondo de vidrio Plato de cultivo | chemglass Ciencias de la Vida | CLS-1811-002 | Modificado mediante la eliminación de las paredes del plato para su uso como disco de cubreobjetos compatible con el inserto vivo; el disco de 35 mm de ancho contiene cubreobjetos de vidrio de 20 mm de ancho; las paredes del plato fueron Retirado por el taller mecánico |
| Controlador de placa de calor | Physitemp | TCAT-2LV | Controlador de temperatura animal - Bajo voltaje; Accesorio de prueba anal para el control de la temperatura corporal del ratón |
| Llave hexagonal (1,5 mm) | Para ajustes de tornillo de fijación M3 | ||
| Llave hexagonal (2,5 mm) | Ajuste de la tensión en la pinza metálica para la oreja | ||
| Inserto | |||
| de imagen intravitalIsoflurano | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Cinta de etiquetado de anestesia para ratones |
| (o cinta adhesiva) | VWR | 10127-458 | Alternativa a la pinza metálica para inmovilizar la oreja al cubreobjetos |
| Cierre | utilizado como pinza para la oreja | ||
| Ratón: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Promotor específico de fibrroblasto que impulsa la expresión de rtTA inducible por doxiciclina |
| Ratón: K14-H2BPAmCherry | Cortesía de la Dra. Valentina Greco en la Universidad | células epiteliales epidérmicas con mCherry; referido en el texto como "K14-H2B-mCherry" | |
| Ratón: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | El Laboratorio Jackson | RRID: IMSR_JAX:005104 | Etiquetas núcleos de fibroblastos con GFP cuando se combinan con Pdgfra-rtTA e inducidos con doxiciclina |
| Envoltura de sellado multiusos | Glad | Enhance mouse warm's | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Lubricante ocular |
| Tornillos de fijación x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Accesorio para módulo de placa calefactora |
| Aceite de inmersión de silicona Aplicado | a silicona 40x objetivo | ||
| Placa calefactora para animales pequeños | Physitemp | HP-4M | Proporciona calor a los animales |
| Somnoflow Vaporizador electrónico de bajo flujo | Kent Scientific | SF-01 | Anestesia de ratón |
| Grasa al vacío | Flinn Scientific | AP1095 | Sella el disco de deslizamiento para insertar |
| la depilación Veet | |||
| Almohadilla térmica de circulación de agua | Stryker Medical | TP700 | para la reactivación del ratón después de la obtención de imágenes |
Referencias
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196(202....
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Reimpresiones y permisos
