Artículo de método

Análisis de proteínas de la célula huésped mediante perlas de enriquecimiento junto con digestión limitada

DOI:

10.3791/65544

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19 de enero de 2024

 ,  , 
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta un protocolo para enriquecer proteínas de células huésped (HCP) a partir de productos farmacológicos (DP) y detectar péptidos mediante perlas de enriquecimiento de proteomas. El método se demuestra utilizando una sustancia farmacológica (DS) de anticuerpos monoclonales (mAb) de fabricación propia, que es un material de referencia bien caracterizado para evaluar y comparar diferentes métodos en términos de rendimiento.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que pueden afectar negativamente a las proteínas terapéuticas, incluso en pequeñas cantidades. Para evaluar los riesgos potenciales asociados con los productos farmacéuticos, se han desarrollado métodos para identificar a los profesionales de la salud de baja abundancia. Un enfoque crucial para el desarrollo de un método sensible de detección de HCP consiste en enriquecer a los HCP y, al mismo tiempo, eliminar los anticuerpos monoclonales (mAb) antes del análisis, utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS).

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para enriquecer las proteínas de la célula huésped utilizando perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles en el mercado. Estas perlas contienen una biblioteca diversa de ligandos hexapéptidos con afinidades específicas por diferentes proteínas. El protocolo también incorpora la digestión limitada y la posterior detección de péptidos mediante nano LC-MS/MS. Al emplear estas técnicas, los HCP con baja abundancia se pueden enriquecer más de 7000 veces, lo que resulta en un impresionante límite de detección tan bajo como 0.002 ppm. Cabe destacar que este protocolo permite la detección de 850 profesionales de la salud con un alto nivel de confianza utilizando un mAb del NIST. Además, está diseñado para ser fácil de usar e incluye una demostración en video para ayudar con su implementación. Al seguir estos pasos, los investigadores pueden enriquecer y detectar eficazmente a los profesionales de la salud, mejorando la sensibilidad y la precisión de la evaluación de riesgos de los productos farmacéuticos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que se liberan del cultivo celular del organismo huésped y se copurifican con anticuerpos monoclonales (mAb)1,2,3,4. Los niveles traza de HCP pueden afectar negativamente la calidad del producto farmacéutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto, se desea un método de análisis de HCP sensible para detectar HCP en niveles inferiores a ppm.

Se pueden aplicar métodos ortogonales para detectar HCP en baja abundancia. El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se utiliza generalmente para cuantificar los HCP generales, y también puede detectar y cuantificar los HCP individuales si se dispone de los anticuerpos correspondientes16. Sin embargo, la producción de anticuerpos específicos para el HCP requiere mucho tiempo y mano de obra. Por el contrario, la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas (LC-MS) puede proporcionar información completa sobre los HCP individuales en los medicamentos mAb y se aplica ampliamente para la identificación de HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Se han desarrollado varios métodos para detectar HCP con LC-MS/MS, incluyendo la digestión limitada20, la filtración17, la deleción de la proteína A21, la inmunoprecipitación (IP) y el enriquecimiento de ProteoMiner (PM)18. La mayoría de los métodos tienen como objetivo reducir la cantidad de anticuerpos monoclonales y enriquecer los profesionales de la salud antes del análisis de LC-MS/MS, disminuyendo así el rango dinámico entre los péptidos de anticuerpos monoclonales y los péptidos de los profesionales sanitarios. Este protocolo presenta un método de enriquecimiento proteómico de muestras que combina la tecnología ProteoMiner y la digestión limitada (PMLD)28. El principio de enriquecimiento de ProteoMiner implica el uso de perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles comercialmente que contienen una biblioteca diversa de ligandos peptídicos combinatorios. Estos ligandos se unen específicamente a las proteínas de los productos farmacológicos de anticuerpos, lo que permite la eliminación del exceso de moléculas mientras concentran las proteínas de la célula huésped (HCP) de baja abundancia en sus respectivos ligandos de afinidad. Por otro lado, el principio de digestión limitada implica el uso de una baja concentración de tripsina. Esta concentración es suficiente para digerir los profesionales de la salud de baja abundancia, pero no es suficiente para digerir todos los medicamentos de anticuerpos. Este enfoque permite la recuperación y el enriquecimiento de los péptidos HCP digeridos a partir de la solución.

En comparación con los métodos de filtración, la técnica PMLD no está limitada por el tamaño de los PS detectados17. Los métodos de deleción de la proteína A son específicos para detectar HCP asociados con anticuerpos21, mientras que la inmunoprecipitación se restringe a HCP predefinidos de una línea celular particular (como la línea celular de ovario de hámster chino (CHO)), donde se generó un anticuerpo anti-HCP4. Por el contrario, la PMLD se puede aplicar para detectar HCP de cualquier módulo farmacológico y proteínas de la célula huésped copurificadas con productos farmacológicos de varias líneas celulares. Además, la PMLD presenta una mejor sensibilidad en comparación con los métodos mencionados 17,18,20,21,24.

Este enfoque puede enriquecer la concentración de HCP en 7000 veces y reducir el límite de detección a 0,002 ppm28. La configuración experimental se ilustra en la Figura 1.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las abreviaturas utilizadas en el protocolo se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

1. Preparación de soluciones y tampones

NOTA: Los detalles comerciales de todos los reactivos se enumeran en la Tabla de Materiales.

  1. Prepare una solución de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 añadiendo 1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 en 9 ml de agua desionizada en un vial de vidrio y mezcle bien mediante vórtice. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
  2. Preparar 24 mM de desoxicolato de sodio (SDC) disolviendo 10 mg de SDC en 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Prepare 24 mM de laurelil sarcosinato de sodio (SLS) disolviendo 7 mg de SLS en 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Prepare el tampón de elución mezclando 24 mM SDC y 24 mM SLS en una proporción de 1:1 (v/v).
  5. Prepare 50 ng/μL de solución de tripsina añadiendo 400 μL de agua desionizada en 20 μg de tripsina.
  6. Prepare 25 mg/ml de ditiotreitol (DTT) añadiendo 308 μL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, en 7,7 mg de DTT.
  7. Prepare yodoacetamida (IAM) 0,25 M añadiendo 1,2 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, en 56 mg de IAM.
  8. Prepare AGT al 10% agregando 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA) en 9 mL de agua desionizada. Vórtice durante 4 s y gire hacia abajo. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
  9. Prepare el tampón A agregando 1 ml de TFA al 10% en 99 ml de agua desionizada.
  10. Prepare el tampón B agregando 1 ml de AGT al 10% y 49 ml de agua desionizada en 50 ml de acetonitrilo (ACN).
  11. Prepare 10 mM de tampón de histidina añadiendo 37 mg de L-histidina y 54,8 mg de monoclorhidrato de L-histidina monohidrato en 50 mL de agua.

2. Preparación de soluciones de anticuerpos monoclonales (mAb)

  1. Para productos farmacéuticos con concentraciones superiores a 50 mg/ml, diluir 15 mg del anticuerpo monoclonal (mAb) (ver tabla de materiales) con agua desionizada en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, lo que da como resultado un volumen total de 300 μl y un pH final de ~6. Si es necesario, ajuste el pH con ácido acético o Tris-HCl.
  2. En el caso de los medicamentos con concentraciones inferiores a 50 mg/ml, realizar el intercambio tampón siguiendo los pasos 2.2.1 a 2.2.5.
    1. Transfiera 20 mg de cada muestra a un dispositivo de filtro centrífugo de 10k (consulte la tabla de materiales) y centrifugue a 14.000 x g durante 25 min (a temperatura ambiente, RT) hasta que quede un volumen de aproximadamente 100 μL.
    2. Añadir 350 μL de 10 mM de histidina (ver Tabla de Materiales), tampón de pH 6,0 en el filtro, vórtice y centrifugar a 14.000 x g durante 25 min a RT. Repetir una vez.
    3. Invierta el filtro y colóquelo en el tubo de recolección de muestras, luego centrifugue las muestras a 1000 x g durante 5 minutos en RT para recuperar todo el volumen en el tubo de recolección. Lavar el filtro con 200 μL de tampón de histidina 10 mM y pipetear hacia arriba y hacia abajo para recuperar las muestras de proteínas restantes. Transfiera toda la solución al mismo tubo de recolección, vórtice y gire hacia abajo.
    4. Mida la concentración de la muestra con NanoDrop. Ajuste la concentración de cada muestra de proteína a 50 mg/ml añadiendo el tampón de histidina antes de la incubación con perlas de enriquecimiento.
    5. Transfiera 300 μL de la muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 mL.

3. Preparación de perlas de enriquecimiento del proteoma

  1. Retire la tapa superior e inferior de cada columna de centrifugado obtenida del kit comercial de enriquecimiento de proteínas (consulte la Tabla de materiales). No deseche las tapas, ya que se usarán más adelante.
  2. Tome la columna de centrifugación y colóquela en un tubo de microcentrífuga de 2 ml sin tapón. Centrifugar la instalación a temperatura ambiente y 1.000 x g durante 30-60 s a RT para eliminar la solución de almacenamiento. Deseche el material recolectado durante este paso.
  3. Añada 200 μL de tampón de lavado a las perlas de enriquecimiento disponibles en el mercado (consulte la Tabla de materiales) y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces. Coloque la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y centrifugue a 1.000 x g durante 30-60 s a RT para eliminar el tampón. Deseche el material recolectado.
    NOTA: El tampón de lavado está incluido en el kit comercial de enriquecimiento de proteínas.
  4. Repita los pasos 3.3 dos veces.
  5. Vuelva a colocar la tapa inferior y agregue 200 μL de agua, luego vuelva a colocar la tapa superior.

4. Enriquecimiento proteico

  1. Pipetear hacia arriba y hacia abajo el lodo (a partir del paso 3.5) y transferir 40 μL de lodo a la muestra preparada en el paso 2. Incubar y girar el tubo a temperatura ambiente durante 2 h.
  2. Haga una punta con frita (ver Tabla de materiales) usando la aguja de 16 G para obtener el tamaño de frita apropiado, luego insértela en el extremo de la punta de la punta de 200 μL.
  3. Transfiera la muestra con perlas a la punta preparada en el paso 4.2. Centrifugar la punta con un tubo de microcentrífuga de 2 ml a 200 x g durante 3 min a RT para eliminar la solución.
  4. Lave las perlas añadiendo 200 μL de tampón de lavado a la punta y centrifugue la punta con un tubo de microcentrífuga de 2 ml a 200 x g durante 2 min a RT para eliminar la solución de lavado. Repita el paso dos veces.
  5. Lave las perlas añadiendo 200 μL de agua a la punta y centrifugue la punta con un tubo de microcentrífuga de 2 mL a 200 x g durante 2 min a RT para eliminar el agua.
  6. Eluir las proteínas de las perlas añadiendo 10 μL de tampón de elución (paso 1.4) en la punta, y pipetear la suspensión diez veces en la punta para asegurarse de que las perlas estén empapadas con tampón de elución.
  7. Centrifugar la punta con un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 ml a 200 x g durante 30 s a RT para recoger el eluyente. Repita los pasos 4.6-4.7 dos veces y combine toda la elución en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
  8. Añadir 1,5 μL de solución de tripsina (paso 1.5) en el eluyente para la digestión nocturna a 28 °C. Añadir 1,5 μL de 25 mg/mL de DTT (paso 1.6) y calentar la muestra a 90 °C durante 20 min.
  9. Añadir 1,5 μL de IAM de 0,25 M (paso 1.7) e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min. Añadir 3,5 μL de TFA al 10% (paso 1.8), vórtice durante 2 min, y asegurarse de que el pH esté en ~2-3.
  10. Centrifugar a 14.400 × g durante 10 min a RT para precipitar SDC y SLS. Recoja el sobrenadante para desalinizarlo.
  11. Realice la desalinización siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    1. Añadir 50 μL de tampón B (paso 1.10) a la punta desalinizadora de GC (ver Tabla de Materiales). Centrifugar la punta con un soporte a 1000 x g durante 3 min a RT. Deseche el material recogido.
    2. Añadir 50 μL de tampón A (paso 1.9) a la punta. Centrifugar la punta con un soporte a 1000 x g durante 3 min a RT. Deseche el material recogido.
    3. Agregue la muestra acidificada a la punta. Centrifugar la punta con un soporte a 500 x g durante 6 min a RT. Deseche el material recogido.
    4. Lave la punta añadiendo 50 μL de tampón A a la punta. Centrifugar la punta con el soporte a 500 x g durante 3 min en RT. Deseche el material recogido. Repita una vez.
    5. Eluir el péptido de la punta añadiendo 50 μL de tampón B a la punta desalinizadora de GC. Centrifugar la punta con un tubo nuevo a 500 x g durante 3 min en RT. Recoger el material. Repita el paso una vez y combine el eluyente.
    6. Seque el eluyente con un concentrador de vacío (consulte la tabla de materiales).
  12. Vuelva a suspender el eluyente seco en 30 μL de solución de ácido fórmico (AF) al 0,1%.
  13. Mida los rayos UV de las mezclas de péptidos a 214 nm con un espectrofotómetro (consulte la tabla de materiales). La concentración de mezclas peptídicas debe oscilar entre 0,1 y 0,5 mg/ml.
  14. Transfiera 10 μL de cada muestra digerida a un vial de muestra LC, luego inyecte 1 μg de cada muestra digerida en nano LC-MS/MS (consulte la Tabla de materiales). Realice el análisis siguiendo el paso 5. Almacenar el resto de las muestras digeridas en un congelador a -80 °C.

5. Análisis Nano LC-MS/MS

  1. Inyecte la mezcla de péptidos en un sistema nano-LC acoplado a un espectrómetro de masas. Cargue las mezclas peptídicas (~1 μg) en una columna de trampa C18 con el gradiente proporcionado en la Tabla 1A para la desalinización y, a continuación, en una columna analítica C18 a 40 °C para la separación.
    NOTA: El tampón móvil de fase A consistió en 0,1% de AG en agua ultrapura, y la fase móvil B consistió en 0,1% de AG en 80% de ACN.
  2. Separar los péptidos y eluir con el gradiente proporcionado en la Tabla 1B con un caudal de 250 nL/min.
    NOTA: El espectrómetro de masas funcionó en modo dependiente de datos (DDA) con un tiempo de ciclo de 3 s. Los iones se sometieron a fragmentación a través de la disociación colisional (HCD) de mayor energía con una energía de colisión normalizada del 30% para cada exploración completa de MS. Los escaneos se realizaron con una resolución de 60.000, con un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 3e6, un tiempo máximo de inyección de 20 ms y un rango m/z de 380-1600. Los eventos MS/MS se llevaron a cabo con una resolución de 15.000, con un objetivo AGC de 1e5, un tiempo máximo de inyección de 60 ms y un rango m/z de 200-2000. La duración de la exclusión se fijó en 45 s. Las propiedades de la fuente de iones se proporcionan en la Tabla 1C, y los parámetros específicos de espectrometría de masas se pueden encontrar en la Tabla 2A-F.

6. Análisis de datos

  1. Realice una búsqueda en los archivos sin procesar de espectrometría de masas del NISTmAb en la base de datos UniProt mus+musculus29. Además, busque los archivos sin procesar de espectrometría de masas de mAb DS con proteína recombinante con picos en la base de datos UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTA: Estas búsquedas se realizaron en el software Proteome Discoverer (ver Tabla de Materiales) utilizando los motores de búsqueda Sequest HT y Mascot. Las bases de datos utilizadas estaban libres de entradas redundantes.
  2. Para las búsquedas de espectrometría de masas, aplique una tolerancia de masa de 10 ppm y establezca la tolerancia de masa del fragmento en 0,02 Da.
    NOTA: Los criterios de búsqueda abarcaron la carbamidometilación estática de residuos de cisteína (+57,0214 Da) y la modificación variable de la oxidación (+15,9949 Da) en residuos de metionina. Adicionalmente, se aplicó una modificación variable de la desaminación (+0.984 Da).
  3. Realice la búsqueda en la base de datos utilizando la digestión de tripsina, lo que permite un máximo de dos escisiones perdidas. Establezca las tasas de falsos descubrimientos tanto para proteínas como para péptidos en 0,01.
    NOTA: Para identificar positivamente las proteínas de la célula huésped (HCP), se aplicó un requisito mínimo de al menos dos péptidos únicos. En la Tabla 3 se presenta un resumen representativo de los profesionales de la salud identificados asociados con el AcM del NIST analizados por el software Proteome Discoverer.

Resultados

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Este protocolo presentó un flujo de trabajo de preparación de muestras, denominado enriquecimiento de proteínas junto con digestión limitada (PMLD), para el análisis de proteínas de la célula huésped (HCP) en una muestra de anticuerpos monoclonales (mAb). La Figura 1 ilustra el procedimiento paso a paso de PMLD. Los investigadores compararon los resultados del análisis de HCP utilizando la digestión directa (que se muestra en el panel superior de la Figura 2) y PMLD (que se muestra en el panel inferior de la Figura 2). Los perfiles del cromatograma iónico total (TIC) indicaron que la PMLD redujo o eliminó significativamente los principales péptidos de mAb, al tiempo que permitió la observación de algunos péptidos de HCP comparables a los péptidos de mAb. Se proporcionan parámetros detallados para los análisis de nano LC (Tabla 1) y MS/MS (Tabla 2). Además, en la Tabla 3 se muestra un resumen de los HCP identificados asociados con el mAb del NIST, que incluye información como el número de accesión, el nombre del HCP, la especie, el porcentaje de cobertura, los PSM, los péptidos únicos, el peso molecular, el punto isoeléctrico (pI) esperado, la puntuación de Mascot, la puntuación de Sequest HT y el número de péptidos identificados por Mascot y Sequest HT.

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Figura 1: Flujo de trabajo de preparación de muestras de enriquecimiento de proteínas junto con digestión limitada (PMLD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Perfil del cromatograma iónico total (TIC) para el análisis de HCP del AcM del NIST. Panel superior: Perfil de TIC para el análisis de HCP de anticuerpos monoclonales del NIST mediante digestión directa. Panel inferior: Perfil de TIC para el análisis de HCP de anticuerpos monoclonales del NIST mediante PMLD. Es evidente a partir del perfil de TIC que, en comparación con la digestión directa, la mayoría de los principales péptidos de anticuerpos monoclonales se han reducido o eliminado después de la PMLD, mientras que se pueden observar algunos péptidos pertenecientes a los profesionales sanitarios que son comparables a los péptidos de anticuerpos monoclonales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Parámetros para nano LC. (A) Gradiente de la bomba de carga. (B) Gradiente de la bomba NC. (C) Propiedades de la fuente de iones. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro 2: Parámetros para MS/MS. (A) Propiedades de escaneo completo. (B) Propiedades MIPS. (C) Propiedades de intensidad. (D) Propiedades de estado de carga. E) Exclusión dinámica. (F) Propiedades de escaneo MS2 dependientes de los datos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Tabla resumen representativa de los profesionales de la salud identificados asociados con el mAb del NIST analizados por el software Proteome Discoverer. La tabla incluye información como el número de accesión, el nombre del HCP, la especie, el porcentaje de cobertura, el número de coincidencias del espectro peptídico (PSM), el número de péptidos únicos, el peso molecular, el punto isoeléctrico (pI) esperado, la puntuación de Mascot, la puntuación de Sequest HT y el número de péptidos identificados por Mascot y Sequest HT. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro complementario 1: Lista de abreviaturas utilizadas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hay dos versiones de perlas de enriquecimiento de proteínas disponibles comercialmente: una con una capacidad más pequeña y la otra con una capacidad más grande (ver Tabla de materiales). Ambas versiones de las perlas de enriquecimiento contienen diez preparaciones en el paquete. Las instrucciones del fabricante sugieren que cada preparación del kit de pequeña capacidad se puede usar para enriquecer 10 mg de proteína total. Sin embargo, para un rendimiento óptimo del enriquecimiento de proteínas de la célula huésped (HCP) de DS, cada preparación es buena para cinco muestras de SD. Por lo tanto, cada kit se puede utilizar para enriquecer a los profesionales de la salud a partir de cincuenta muestras. Para cada preparación del kit de gran capacidad, es bueno para el enriquecimiento de los profesionales de la salud a partir de veinticinco muestras de DS, lo que permite la detección de los profesionales de la salud a partir de un total de doscientas cincuenta muestras.

El paso 3.1 desaconseja desechar las tapas superior o inferior, ya que se reutilizarán a lo largo de todo el protocolo. Si las cuentas se depositan en la tapa superior, reemplácelas después de quitar el tapón inferior y centrifugar mientras mantiene la tapa superior en la columna. Para utilizar la tapa inferior como tapón, inviértala y colóquela de forma segura en la parte inferior de la columna de centrifugado.

Un paso crítico en el procedimiento es el paso 4.1, donde la suspensión de cordones se deposita en el fondo del tubo. Por lo tanto, es crucial mantener un pipeteo continuo hacia arriba y hacia abajo mientras se transfiere la suspensión a las muestras de anticuerpos monoclonales (mAb). Otro paso crítico es el paso 4.6, en el que es esencial pipetear la lechada diez veces dentro de la punta mientras las perlas están saturadas con tampón de elución. La duración de la centrifugación en los pasos 4.3-4.5, 4.7 y 4.10 puede variar dependiendo de la cantidad de proteínas acumuladas en la célula huésped (HCP). Por lo tanto, es crucial verificar y asegurarse de que los líquidos en la punta se hayan centrifugado correctamente antes de continuar con el siguiente paso. Una vez más, cuando se comienza con una cantidad inicial de 15 mg de anticuerpos-fármacos, se pueden eluir aproximadamente 30 μg de anticuerpos y proteínas enriquecidas de células huésped (HCP). Para lograr una proporción proteína-enzima de 400:1 para una digestión limitada, se añadieron 75 ng de tripsina. Cuando se utiliza una cantidad menor de material de entrada, es necesario medir la concentración de la muestra de proteína eluida. Esta medición ayuda a ajustar la cantidad de tripsina que se debe agregar en consecuencia. El paso 4.9 muestra un precipitado blanco después de agregar el 10% de TFA. Para evitar cualquier interferencia de tensioactivos con la señal MS, es crucial verificar el pH después de agregar ácido trifluoroacético (TFA) para garantizar la eliminación completa del detergente del sobrenadante.

Después del secado y la resuspensión del eluyente en agua, es necesario realizar una medición UV de la mezcla de péptidos. Esta medición es crucial porque la cantidad de péptidos cargados en la columna puede influir en la detección mediante MS. Después de la evaluación, se encontró que aproximadamente 1 μg de la mezcla peptídica exhibió el mejor rendimiento en la EM. En consecuencia, esta cantidad óptima debe inyectarse en nano LC-MS/MS para su posterior análisis.

El enfoque PMLD ofrece varias ventajas en la preparación de muestras, incluida una reducción suficiente de la DS de anticuerpos monoclonales (mAb) al tiempo que se conserva la mayoría de las proteínas de la célula huésped (HCP) de baja abundancia. A diferencia de la inmunoprecipitación (IP), esta técnica no se basa en anticuerpos anti-HCP, lo que elimina el sesgo asociado con los anticuerpos predefinidos y reduce la mano de obra y el tiempo necesarios para producir anticuerpos anti-HCP. Además, a diferencia de los métodos de filtración basados en el punto de corte de peso molecular17, PMLD enriquece a los profesionales de la salud independientemente de su tamaño. Se puede aplicar para enriquecer a los profesionales de la salud a partir de varios módulos de fármacos, como anticuerpos, proteínas de fusión, ScFv y más, lo que lo convierte en un enfoque versátil en comparación con los métodos de deleción de la proteína A21.

Además de estas ventajas, PMLD presenta un límite de detección más bajo y permite la detección de un mayor número de profesionales sanitarios a partir del NISTmAb, un estándar de referencia ampliamente caracterizado, en comparación con otros métodos. Sin embargo, vale la pena señalar que PMLD requiere equipos caseros, lo que limita su aplicación para la automatización. Para ampliar su usabilidad, es posible sustituir ciertos equipos, como la punta por frita, por alternativas disponibles en el mercado. Además, la realización de la desalinización en placas de 96 pocillos puede permitir un mayor rendimiento utilizando este enfoque. Explorar la automatización o la semiautomatización en futuros experimentos puede ser el siguiente paso lógico para ampliar la aplicación más amplia de PMLD.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
16 G, aguja de cubo de metal, 2 pulgadas, estilo de punta 3Columna91016
Acclaim PepMap 100 C18 (20 cm y veces; 0,075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitriloFisher-ScientificA955
con 0,1% de ácido fórmico (v/v), grado Optima LC/MS Unidad deFisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5Millipore SigmaUFC5010
columna analítica C18 (0,075 mm &veces; 1,7 μ m × 30 cm, 100 Å)HEB07503001718ICoAnn Technologies
5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frita para cartuchos SPE, 9,5 mm, 3 mL, 100/paqueteAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc   7820-11201
Concentración interna de mAbRegeneron200 mg/mL
Yodoacetamida (30 x 9,3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific 149320025
L-HistidinaSigma AldrichH6034
L-Histidina monoclorhidrato monohidratoSigma Aldrich53370
MetanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Tubo LoBind de proteínas 0,5 mLEppendorf (VWR)22431064
Tubo LoBind de proteínas 2,0 mlEppendorf (VWR)22431102
Descubridor de proteoma software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Kit de gran capacidadBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Kit de pequeña capacidadBio-Rad1633006
Desoxicolato de sodio (SDC)Sigma AldrichD6750
Lauroil sarcosinato de sodio (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Ácido trifluoracético (TFA)Fisher-Scientific28904
Tripsina (grado de secuenciación modificado)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Revólver de tubo RotadorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Agua con 0,1% de ácido fórmico (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 
trampa Hamilton filtro centrífugo Centrífuga

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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