Un protocolo para evaluar la destrucción cuantitativa de células tumorales por células Jurkat que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un solo antígeno tumoral. Este protocolo se puede utilizar como plataforma de cribado para la optimización rápida de las construcciones de bisagras de CAR antes de la confirmación en células T derivadas de sangre periférica.
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Artículo de método
Evaluación rápida de la citotoxicidad in vitro del receptor de antígeno quimérico que expresa jurkat mediante imágenes fluorescentes
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) están a la vanguardia de la oncología. Un CAR se construye a partir de un dominio diana (generalmente un fragmento variable de cadena única, scFv), con un enlazador intracadena que lo acompaña, seguido de un dominio bisagra, transmembrana y coestimulador. La modificación del enlazador intracadena y del dominio de bisagra puede tener un efecto significativo en la muerte mediada por CAR. Teniendo en cuenta las muchas opciones diferentes para cada parte de una construcción CAR, hay un gran número de permutaciones. La fabricación de células CAR-T es un proceso largo y costoso, y la fabricación y prueba de muchas construcciones requiere una gran inversión de tiempo y material. Este protocolo describe una plataforma para evaluar rápidamente las construcciones de CAR optimizadas para bisagras en células Jurkat (CAR-J). Las células Jurkat son una línea de células T inmortalizadas con una alta absorción de lentivirus, lo que permite una transducción eficiente de CAR. Aquí, presentamos una plataforma para evaluar rápidamente CAR-J utilizando un generador de imágenes fluorescente, seguido de la confirmación de la citólisis en células T derivadas de PBMC.
Introducción
La terapia de células CAR-T ha demostrado ser muy prometedora en neoplasias malignas hematológicas, lo que se evidencia en los 6 productos CAR-T aprobados por la FDA desde 2017, según lo informado por el Instituto Nacional del Cáncer1. Existen numerosas células CAR-T en ensayos clínicos para atacar tumores sólidos. La ingeniería de nuevos objetivos CAR y la optimización de la construcción de CAR son vitales para la eficacia de una célula CAR-T. La elección de la construcción de CAR ideal para cada aplicación es esencial para una orientación precisa de los antígenos asociados al tumor (TAA) y, al mismo tiempo, evitar niveles bajos de expresión d....
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Protocolo
NOTA: Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en una cabina de bioseguridad con bata de laboratorio, guantes y siguiendo las técnicas asépticas estándar.
1. Generación de CAR que expresa Jurkats (CAR-J)
- Compre células Jurkat, clon E6-1 de ATCC. Descongelar 1 x 106 células en un matraz T-75 y cultivarlas en matraces T-75. Manténgalos en suspensión a 0,6 x 106 células por ml utilizando medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementados con 10% de FBS en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
- Placa 1 x 105 células Jurkat por pocillo de un cultivo....
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Resultados
Se evaluó un rango de relación E:T entre 1:8 y 8:1 para CAR-J1 a las 72 h que se dirigió a EGFR en células TNBC MDA-MB-231. Las células Jurkat se transducieron con lentivirus CAR con polibreno para generar células CAR-J como se describe en el paso 2. La citotoxicidad de CAR-J1 aumentó significativamente con una mayor relación E:T sin diferencias en la relación de muerte a 1:8 (Figura 1). Se observó más del 50% de muertes a 4:1 E:T durante 72 h. Este E:T se utilizó para experimentos posterior.......
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Discusión
Aquí hemos propuesto un método rápido para evaluar eficientemente la actividad citolítica específica de la diana inducida por la expresión de CAR en células Jurkat. Todas las construcciones de CAR tienen el mismo scFv pero diferentes dominios bisagra y transmembrana que se ha demostrado que afectan a la potencia de las células CAR-T13. La evaluación adicional de la destrucción inespecífica por parte de estos CAR-J se realizó mediante el cultivo con células knock-out de antígenos (KO). Esto demuest.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
MDA-MB-231 fue un amable regalo del Dr. Shane Stecklein. Los autores agradecen la financiación del Centro Oncológico de la Universidad de Kansas para llevar a cabo esta investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo cónico de 15 mL (estéril) | Midwest Scientific | #C15B | Cualquier similar funcionará |
| Tubo cónico de 50 mL (estéril) | Thermo Scientific | 339652 | Cualquier similar funcionará |
| Negro/Transparente Placa de 96 pocillos | Falcon | 353219 | Celligo tiene una lista de placas compatibles |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Cualquier similar funcionará |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Versión 5.3.0.0 | Cualquier similar funcionará |
| Incubadora de cultivo celular | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Cualquier similar funcionará |
| Matraces tratados con cultivo celular (T75, varios tamaños, estériles) | TPP | 90076 | Cualquier similar funcionará |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Cualquier similar funcionará |
| Analizador de células Cytek Muse | Cytek | 0500-3115 | Cualquier similar funcionará |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Cualquier similar funcionará |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Cualquier similar funcionará |
| Citómetro de flujo | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Cualquier similar funcionará |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Empresa | Versión 10.7.1 | Cualquier similar funcionará |
| Fluorobrito DMEM | Gibco | A18967-01 | Cualquier similar funcionará |
| Software | GraphPad | GraphPad Versión 9.3.1 (471) | Cualquier similar funcionará |
| Pipeta Multichanel | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Cualquier similar funcionará |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Cualquier similar funcionará |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Cualquier similar funcionará |
| Puntas de pipeta (Estériles, filtradas, 1 mL, Varios tamaños) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Cualquier similar funcionará |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Cualquier similar funcionará |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Cualquier similar funcionará |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Cualquier similar funcionará |
| Ayuda para pipetas serológicas | Drummond Scientific | 4-000-105 | Cualquier similar funcionará |
| Pipetas serológicas (estériles, varios tamaños) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Cualquier similar funcionará |
| Piruvato de sodio | Corning | 25-000-CI | Cualquier similar funcionará |
| Depósitos estériles | Midwest Scientific | RESE-2000 | Cualquier similar funcionará |
| Centrífuga de mesa | Eppendorf | 5810R | Cualquier similar funcionará |
Referencias
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....
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Reimpresiones y permisos
