Artículo de método

Evaluación rápida de la citotoxicidad in vitro del receptor de antígeno quimérico que expresa jurkat mediante imágenes fluorescentes

DOI:

10.3791/65560

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27 de octubre de 2023

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1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Un protocolo para evaluar la destrucción cuantitativa de células tumorales por células Jurkat que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un solo antígeno tumoral. Este protocolo se puede utilizar como plataforma de cribado para la optimización rápida de las construcciones de bisagras de CAR antes de la confirmación en células T derivadas de sangre periférica.

Resumen

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Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) están a la vanguardia de la oncología. Un CAR se construye a partir de un dominio diana (generalmente un fragmento variable de cadena única, scFv), con un enlazador intracadena que lo acompaña, seguido de un dominio bisagra, transmembrana y coestimulador. La modificación del enlazador intracadena y del dominio de bisagra puede tener un efecto significativo en la muerte mediada por CAR. Teniendo en cuenta las muchas opciones diferentes para cada parte de una construcción CAR, hay un gran número de permutaciones. La fabricación de células CAR-T es un proceso largo y costoso, y la fabricación y prueba de muchas construcciones requiere una gran inversión de tiempo y material. Este protocolo describe una plataforma para evaluar rápidamente las construcciones de CAR optimizadas para bisagras en células Jurkat (CAR-J). Las células Jurkat son una línea de células T inmortalizadas con una alta absorción de lentivirus, lo que permite una transducción eficiente de CAR. Aquí, presentamos una plataforma para evaluar rápidamente CAR-J utilizando un generador de imágenes fluorescente, seguido de la confirmación de la citólisis en células T derivadas de PBMC.

Introducción

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La terapia de células CAR-T ha demostrado ser muy prometedora en neoplasias malignas hematológicas, lo que se evidencia en los 6 productos CAR-T aprobados por la FDA desde 2017, según lo informado por el Instituto Nacional del Cáncer1. Existen numerosas células CAR-T en ensayos clínicos para atacar tumores sólidos. La ingeniería de nuevos objetivos CAR y la optimización de la construcción de CAR son vitales para la eficacia de una célula CAR-T. La elección de la construcción de CAR ideal para cada aplicación es esencial para una orientación precisa de los antígenos asociados al tumor (TAA) y, al mismo tiempo, evitar niveles bajos de expresión d....

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Protocolo

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NOTA: Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en una cabina de bioseguridad con bata de laboratorio, guantes y siguiendo las técnicas asépticas estándar.

1. Generación de CAR que expresa Jurkats (CAR-J)

  1. Compre células Jurkat, clon E6-1 de ATCC. Descongelar 1 x 106 células en un matraz T-75 y cultivarlas en matraces T-75. Manténgalos en suspensión a 0,6 x 106 células por ml utilizando medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementados con 10% de FBS en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Placa 1 x 105 células Jurkat por pocillo de un cultivo....

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Resultados

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Se evaluó un rango de relación E:T entre 1:8 y 8:1 para CAR-J1 a las 72 h que se dirigió a EGFR en células TNBC MDA-MB-231. Las células Jurkat se transducieron con lentivirus CAR con polibreno para generar células CAR-J como se describe en el paso 2. La citotoxicidad de CAR-J1 aumentó significativamente con una mayor relación E:T sin diferencias en la relación de muerte a 1:8 (Figura 1). Se observó más del 50% de muertes a 4:1 E:T durante 72 h. Este E:T se utilizó para experimentos posterior.......

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Discusión

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Aquí hemos propuesto un método rápido para evaluar eficientemente la actividad citolítica específica de la diana inducida por la expresión de CAR en células Jurkat. Todas las construcciones de CAR tienen el mismo scFv pero diferentes dominios bisagra y transmembrana que se ha demostrado que afectan a la potencia de las células CAR-T13. La evaluación adicional de la destrucción inespecífica por parte de estos CAR-J se realizó mediante el cultivo con células knock-out de antígenos (KO). Esto demuest.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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MDA-MB-231 fue un amable regalo del Dr. Shane Stecklein. Los autores agradecen la financiación del Centro Oncológico de la Universidad de Kansas para llevar a cabo esta investigación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo cónico de 15 mL (estéril)Midwest Scientific#C15BCualquier similar funcionará
Tubo cónico de 50 mL (estéril)Thermo Scientific339652Cualquier similar funcionará
Negro/Transparente Placa de 96 pocillosFalcon353219Celligo tiene una lista de placas compatibles
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CCualquier similar funcionará
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersión 5.3.0.0Cualquier similar funcionará
Incubadora de cultivo celularThermo ScientificHeraCell 160iCualquier similar funcionará
Matraces tratados con cultivo celular (T75, varios tamaños, estériles)TPP90076Cualquier similar funcionará
CFSETonbo13-0850-U500Cualquier similar funcionará
Analizador de células Cytek MuseCytek0500-3115Cualquier similar funcionará
DMEMGibco11995-040Cualquier similar funcionará
FBSGemini bio-products900-108Cualquier similar funcionará
Citómetro de flujoCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcCualquier similar funcionará
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Empresa Versión 10.7.1Cualquier similar funcionará
Fluorobrito DMEMGibcoA18967-01Cualquier similar funcionará
SoftwareGraphPadGraphPad Versión 9.3.1 (471)Cualquier similar funcionará
Pipeta MultichanelThermo ScientificFinnpipette F2Cualquier similar funcionará
PBSGibco10010-031Cualquier similar funcionará
PenStrepGibco15070-063Cualquier similar funcionará
Puntas de pipeta (Estériles, filtradas, 1 mL, Varios tamaños)Pr1maPR-1250RK-FL, etcCualquier similar funcionará
Pipettors Thermo ScientificFinnpipette F2Cualquier similar funcionará
Propidium IodideInvitrogenP1304MPCualquier similar funcionará
RPMICorning10-041-cvCualquier similar funcionará
Ayuda para pipetas serológicasDrummond Scientific4-000-105Cualquier similar funcionará
Pipetas serológicas (estériles, varios tamaños)Pr1maPR-SERO-25, etcCualquier similar funcionará
Piruvato de sodioCorning25-000-CICualquier similar funcionará
Depósitos estérilesMidwest ScientificRESE-2000Cualquier similar funcionará
Centrífuga de mesaEppendorf5810RCualquier similar funcionará
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Referencias

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  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....

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Etiquetas

C lulas CAR Tc lulas Jurkatcribado de alto rendimientodireccionamiento al EGFRmodificaci n del dominio bisagrac lulas T derivadas de PBMCplaca de 96 pocillostinci n con yoduro de propidio

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