Establecimiento de un modelo de ratones con fístula oronasal

La fístula oronasal (FNO), una abertura anormal entre las cavidades oral y nasal, se manifiesta clínicamente como un defecto en un área estructural desde la apófisis alveolar hasta la úvula, que comúnmente ocurre como una complicación después de la reparación del paladar hendido¹. Los pacientes con FNO experimentan reflujo alimentario, trastornos articulares y deterioro de la función velofaríngea, lo que afecta significativamente su calidad de vida ^2,3,4. La tasa de FNO postoperatoria oscila entre el 2,4% y el 55% debido a factores como el ancho de la hendidura, el tipo de Veau y el método quirúrgico 5,6,7,8. Además, la tasa de recurrencia después de la reparación de ONF es alta, oscilando entre el 0% y el 43%⁹.

Varios tratamientos novedosos se han mostrado recientemente prometedores en el campo de la ONF, incluyendo diferentes materiales, fármacos y técnicas novedosas 10,11,12,13,14,15,16,17. La evaluación precisa de los efectos terapéuticos es esencial, ya que proporciona la base para seleccionar y desarrollar tratamientos con FENO. Sin embargo, obtener una evaluación válida a corto plazo para efectos terapéuticos distintos de la cirugía es un desafío, ya que las características de las FNO varían entre los diferentes pacientes. Por lo tanto, es necesario establecer un modelo de enfermedad de ONF para verificar la efectividad de estos métodos de tratamiento.

Durante varias décadas, los investigadores han generado el modelo de fístula oronasal (ONF) en varias especies animales, incluidas ratas^18,19, lechones 20,21, minicerdos²² y perros ^23, ya que estas especies poseen un paladar duro sustancial adecuado para la manipulación quirúrgica. Sin embargo, los ratones tienen una secuencia genética y un genoma completo similar al de los humanos, lo que los convierte en un modelo importante para la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos^24,25,26. Además, los ratones ofrecen poca variación de un lote a otro, lo que los convierte en una opción favorable para establecer el modelo ONF^12,13,27.

Sin embargo, no se describieron los pasos detallados para crear ONF y no se tuvo en cuenta la estabilidad del tamaño de ONF. Además, la verificación de la formación de ONF se basó únicamente en la observación²⁸, sin garantizar la comunicación directa entre las cavidades oral y nasal. No se demostró a través de otros medios, como la pérdida de peso corporal del ratón debido a las dificultades para comer causadas por la ONF. Además, no se tuvo en cuenta la variación normal en el tamaño de la herida, lo cual es crucial para los estudios sobre fármacos o materiales que promueven o inhiben la cicatrización de heridas. Por lo tanto, existe una gran necesidad de establecer un modelo ONF estable y validado.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo práctico de ONF que aborde los problemas antes mencionados, con la esperanza de que este protocolo sirva como base para futuras investigaciones sobre los mecanismos de cicatrización de heridas palatinas y nuevos tratamientos para ONF.

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan. Para el presente estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6 (hembras).

1. Preparación quirúrgica

1. Reúna los instrumentos quirúrgicos necesarios para el procedimiento: germinador, cauterización oftalmológica, tijeras microquirúrgicas, pinzas microquirúrgicas, jeringas y agujas (26 g x 0,63 pulgadas) (Figura 1A, B) (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Antes del procedimiento quirúrgico, autoclave los instrumentos quirúrgicos, incluida la cauterización oftalmológica, las pinzas microquirúrgicas y las tijeras microquirúrgicas, a 102,9 kPa (1,05 kg/cm²) y 121 °C durante 20 min.
2. Reúna los suministros quirúrgicos necesarios: paños quirúrgicos, guantes de látex, algodón estéril, láminas estériles, láminas de metal estériles, cartón pluma como plataforma quirúrgica, bandas elásticas (que se pueden obtener rasgando un guante de látex médico) y cinta adhesiva (Figura 1C) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Utilice un juego separado de suministros para cada ratón, incluidas jeringas y hojas estériles para el campo quirúrgico.
3. Limpie el área quirúrgica y el aparato (fuente de luz, cartón pluma y dispositivo de mantenimiento de la temperatura, consulte la Tabla de materiales) con toallitas con alcohol. Cubra las perillas y los mangos de los instrumentos que puedan ser necesarios durante el procedimiento con una lámina de metal estéril.
4. Abra asépticamente los instrumentos individuales y colóquelos con cuidado en el área quirúrgica. Active el germinador (ver Tabla de Materiales) y las luces para su uso durante el procedimiento. Coloque la cauterización oftalmológica en el germinador y caliéntelo a 250 °C durante 20 min.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Realice la fijación del ratón y abra la cavidad bucal siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Seleccione un ratón hembra C57BL/6J que pese entre 20 y 25 g y tenga entre 8 y 12 semanas de edad. Aloje al ratón durante 7 días antes de realizar cualquier procedimiento.
   2. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de Zoletil50 (80 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) (ver Tabla de Materiales). Aplique ungüento oftálmico para los ojos en el ojo del ratón. Espere hasta que no haya una respuesta de pellizco en los dedos de los pies.
      NOTA: El mouse está listo para el procedimiento cuando no puede girar de forma independiente.
   3. Asegure el mouse a una tabla de espuma forrada con hojas estériles. Utilice cinta adhesiva para atar el ratón a la plataforma quirúrgica en posición supina (Figura 2A).
   4. Abra la cavidad bucal del ratón. Coloque dos agujas (26 g x 0,63 pulgadas) delante del plano orbital de la oreja y dos más detrás de él. Coloque una banda elástica alrededor de las agujas y cruce los incisivos para mantener la boca abierta. Use pinzas microquirúrgicas para mantener abiertas las comisuras de la boca (Figura 2B).
      NOTA: Asegúrese de que el paladar duro esté claramente expuesto. Fije la lengüeta debajo de la banda elástica para evitar la obstrucción del campo de visión y la quemadura durante los experimentos posteriores.
2. Cree la fístula oronasal (ONF) en el paladar duro (Figura 3A-F).
   1. Recupere la cauterización oftalmológica, que se ha calentado a 250 °C durante 20 min. Coloque la punta de cauterización a 1 mm de distancia de la intersección de la línea media del paladar y la línea del primer premolar, creando una lesión de la mucosa de espesor completo en el paladar duro en la línea media.
      NOTA: Evite quemar la lengua del ratón.
   2. Después de unos segundos, retire la cauterización oftalmológica cuando la mucosa alrededor de la punta de la cauterización se vuelva blanca.
   3. Coloque la cauterización oftalmológica en el germinador y continúe calentándola a 250 °C durante 10 min. Repita el paso anterior para agrandar la herida alrededor de los bordes hasta que alcance una longitud de 2,0 mm y una anchura de 1,5 mm.
      NOTA: Cada extensión debe seguir el borde de la última lesión. Use un calibrador vernier para medir la longitud y el ancho de la lesión. La lesión debe cubrir el 10% del paladar.
   4. Use tijeras microquirúrgicas para eliminar cualquier exceso de tejido blando desnaturalizado alrededor de la herida. Use algodón estéril para detener el sangrado y evitar la asfixia por inhalación del ratón. Mida la herida para asegurarse de que forme una lesión de la mucosa del paladar duro de espesor completo que mida 2,0 x 1,5 mm en la línea media.

3. Cuidados postoperatorios

1. Administrar Meloxicam al ratón en el momento del despertar postoperatorio, a dosis de 5 mg/kg/d durante 3 días, por vía subcutánea²⁹.
2. Coloque el mouse en un dispositivo de mantenimiento de temperatura hasta que recupere completamente la conciencia.
   NOTA: Asegúrese de que el mouse esté colocado de manera que facilite la respiración. Rotar a los ratones cada 10-15 minutos para evitar que la sangre se acumule o colapse los lóbulos pulmonares. Una vez que el ratón se haya calentado, devuélvelo a su jaula. Proporcione gelatina estéril y alimento irradiado en el fondo de la jaula para que los ratones lo consuman.

4. Verificación de la creación de la fístula oronasal

NOTA: El éxito de la creación de la fístula oronasal (ONF) se evalúa al 7º día después del procedimiento quirúrgico.

1. Prepare los suministros quirúrgicos necesarios: banda elástica, cinta adhesiva, jeringas, paños quirúrgicos, guantes de látex, láminas estériles, lámina metálica estéril y cartón pluma.
2. Use paños quirúrgicos y guantes estériles para mantener las condiciones asépticas. Desinfecte la placa de espuma, la fuente de luz y el dispositivo de mantenimiento de temperatura con alcohol.
3. Inducir anestesia general mediante inyección intraperitoneal de Zoletil50 (80 mg/kg). Espere hasta que no haya una respuesta de pellizco en los dedos de los pies. Utilice el mismo método descrito en los pasos 2.1.3 y 2.1.4 para inmovilizar al ratón y exponer el paladar duro.
4. Realice la verificación anatómica estructural asegurándose de que el tabique siga siendo visible en el sitio de la herida, lo que indica una creación exitosa de ONF (Figura 4A, B).
5. Realizar la verificación funcional: cerrar la cavidad bucal del ratón e inyectar agua estéril en su cavidad bucal utilizando una jeringa estéril. La creación exitosa de ONF se confirma cuando el líquido fluye desde las fosas nasales del ratón.
6. Coloque el ratón en el dispositivo de mantenimiento de la temperatura (37 °C) hasta que recupere completamente la conciencia. Rotar a los ratones cada 10-15 minutos para evitar que la sangre se acumule o colapse los lóbulos pulmonares.

Para evaluar la viabilidad y estabilidad de este método experimental, se realizó el mismo procedimiento en diez ratones, y se realizaron observaciones sobre la mortalidad, los cambios en el tamaño de la herida, el peso corporal y el análisis histológico. Los ratones fueron sacrificados el día 7.

El procedimiento presentó una baja tasa de mortalidad. La cauterización oftalmológica y el germinador, representados en la Figura 1A-C, fueron los instrumentos clave utilizados en este experimento. El modelo ONF se creó de acuerdo con el protocolo proporcionado. De los diez ratones operados, solo uno expiró al 7º día después de la operación. La tasa de mortalidad global a lo largo del experimento fue de aproximadamente el 10%.

Los resultados revelaron una notable variabilidad en el tamaño de la ONF generada con el método descrito. El día de la cirugía, todos los ratones presentaban heridas de forma ovalada que medían 2,0 mm de largo y 1,5 mm de ancho. Al evaluar la formación de ONF al 7º día después de la cirugía, se observó una variación significativa en el tamaño de la ONF (P = 0,0085) (Figura 5A,B).

La presencia de ONF puede provocar complicaciones como reflujo alimentario y dificultades para comer, lo que puede provocar cambios de peso. Por lo tanto, también se tuvo en cuenta el peso corporal de los ratones. Los ratones se pesaron el día de la cirugía (día 1) y el día 7 (día 7) cuando se examinó la formación de ONF. Se observó una reducción significativa de peso el día 7 en comparación con el día 1 (P < 0,001) (Figura 6A,B). La pérdida de peso corporal fue del 25,16%.

Para el análisis histológico, tanto la herida como el tejido normal se extrajeron de los ratones el día 7. Los paladares aislados se utilizaron como muestras para el corte histológico. Se colocaron en cajas de inclusión de tejidos y se fijaron con paraformaldehído al 4% y reactivo de descalcificación de ácido fórmico al 10%. A continuación, los tejidos se incrustaron en parafina, se seccionaron en cortes de 7 μm a lo largo de los planos coronales y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). El análisis histológico de la ONF reveló pérdida de mucosa dura del paladar, hueso desnudado y formación de ONF (Figura 7). Se realizó la histología de los pulmones y no se detectaron anomalías entre los ratones normales y los ratones con ONF.

Figura 1: Instrumentos y suministros quirúrgicos . (A) El germinador utilizado para calentar la cauterización oftalmológica. (B) Instrumentos quirúrgicos: cauterización oftalmológica, tijeras microquirúrgicas, pinzas microquirúrgicas, jeringas y agujas (26 g x 0,63 pulgadas). (C) Suministros quirúrgicos: paños quirúrgicos, guantes estériles, algodón estéril, sábanas estériles, láminas metálicas estériles, cartón pluma, bandas elásticas y cinta adhesiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fijación del ratón y apertura de la cavidad oral . (A) Las extremidades delanteras del ratón fueron pegadas con cinta adhesiva para asegurarlo. (B) Se insertaron agujas de jeringa en la tabla de espuma y se colocó una banda elástica sobre las agujas. La cavidad bucal del ratón se abrió con una banda elástica y pinzas microquirúrgicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Creación de la fístula oronasal . (A) Exposición de la cavidad oral. (B) Colocar la punta de la cauterización oftalmológica en la porción de la línea media del paladar duro. (C) Eliminación de la cauterización oftalmológica. (D) Eliminar el exceso de tejido blando alrededor de la herida con tijeras microquirúrgicas. (E) Detener el sangrado con algodón estéril. (F) Herida palatina formada por final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Examen de la herida palatina al 7º día de la cirugía . (A) Herida palatina el día 1. (B) Herida palatina en el día 7. Las flechas blancas indican la fístula oronasal (ONF). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Tamaño de la herida palatina en el día 1 y en el día 7. (A) Valores medios para ratones en los días 1 y 7. (B) Diferencia significativa verificada mediante la prueba t de muestras pareadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Peso de los ratones en el día 1 y el día 7. (A) Valores medios de los ratones en el día 1 y el día 7. (B) Diferencia significativa verificada mediante la prueba t de muestras pareadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Observación histológica. El análisis histológico de la ONF muestra pérdida de mucosa dura del paladar, hueso denudado y formación de ONF. (A) Fístula oronasal en el día 7, aumento: 4x. (B) Fístula oronasal en el día 7, aumento: 10x. (C) Control sin lesión, aumento: 4x. (D) Control sin lesión, aumento: 10x. La flecha negra muestra la ubicación de la ONF. Barras de escala: A,C = 200 μm; B,D = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.