Artículo de método

Pinza hiperglucémica y pinza hipoglucémica en ratones conscientes

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DOI:

10.3791/65581

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26 de enero de 2024

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

En este artículo

Resumen

Una pinza hiperglucémica se utiliza para medir la liberación de insulina con una concentración de glucosa en sangre más alta mantenida. Una pinza hipoglucémica sirve para medir la producción de glucosa inducida por respuestas contrarreguladoras. Ambos métodos utilizan el mismo procedimiento quirúrgico. En este trabajo se presenta una técnica de pinza para evaluar el metabolismo sistémico de la glucosa.

Resumen

La diabetes mellitus (DM) es causada por una liberación insuficiente de insulina de las células β pancreáticas (DM tipo 1) y sensibilidad a la insulina en los músculos, el hígado y los tejidos adiposos (DM tipo 2). La inyección de insulina trata a los pacientes con DM, pero conduce a la hipoglucemia como efecto secundario. El cortisol y las catecolaminas se liberan para activar la producción de glucosa del hígado para recuperar la hipoglucemia, lo que se denomina respuestas contrarreguladoras (RRC). En la investigación de la DM con modelos de roedores, se utilizan pruebas de tolerancia a la glucosa e inyección de 2-desoxiglucosa para medir la liberación de insulina y la RCR, respectivamente. Sin embargo, las concentraciones de glucosa en sangre cambian de forma persistente durante los experimentos, lo que dificulta la evaluación de la liberación neta de insulina y la RRC. Este artículo describe un método en el que la glucosa en sangre se mantiene en 250 mg/dL o 50 mg/dL en ratones conscientes para comparar la liberación de insulina y hormonas CRR, respectivamente.

Se implantan tubos de polietileno en la arteria carótida y la vena yugular de los ratones, y se permite que los ratones se recuperen de la cirugía. El tubo de la vena yugular se conecta a una jeringa Hamilton con una bomba de jeringa para permitir la infusión de insulina o glucosa a una velocidad constante y variable. El tubo de la arteria carótida es para la extracción de sangre. Para la pinza hiperglucémica, se infunde un 30% de glucosa en la vena y los niveles de glucosa en sangre se miden de la sangre arterial cada 5 minutos o 10 minutos. La velocidad de infusión de glucosa al 30% se incrementa hasta que el nivel de glucosa en sangre llega a 250 mg/dL. Se recolecta sangre para medir las concentraciones de insulina. Para el pinzamiento hipoglucémico, se infunde 10 mU/kg/min de insulina junto con un 30% de glucosa, cuya velocidad de infusión es variable para mantener 50 mg/dL de nivel de glucosa en sangre. La sangre se extrae para medir las hormonas contrarreguladoras cuando tanto la infusión de glucosa como la glucosa en sangre alcanzan un estado estacionario. Tanto las pinzas hiperglucémicas como las hipoglucémicas tienen el mismo procedimiento quirúrgico y configuraciones experimentales. Por lo tanto, este método es útil para los investigadores del metabolismo sistémico de la glucosa.

Introducción

La glucosa es una fuente importante de energía para las células, y la falta de glucosa puede provocar una variedad de síntomas y complicaciones. En el caso de glucosa baja (hipoglucemia, generalmente inferior a 70 mg/dL en el nivel de glucosa en sangre en ayunas, pero no debe determinarse por un solo valor1), los síntomas más comunes incluyen debilidad, confusión, sudoración y dolor de cabeza. También puede alterar la función cerebral y aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares y mortalidad2. Por el contrario, la hiperglucemia es una afección médica en la que la concentración de glucosa plasmática supera los niveles normales (generalmente > 126 mg/dL enel nivel 3 de glucosa en sangre en ayunas). Esto puede ocurrir en personas con diabetes que tienen un déficit en la producción o utilización de insulina. La hiperglucemia puede conducir a la cetoacidosis diabética, que ocurre cuando el cuerpo no puede usar la glucosa para obtener energía, sino que descompone los ácidos grasos como combustible. El estado hiperglucémico e hiperosmolar también aumenta la mortalidad4. La hiperglucemia a largo plazo puede causar daños en los vasos sanguíneos, los nervios y los órganos, lo que lleva al desarrollo de varias complicaciones crónicas como enfermedades cardiovasculares, retinopatías y enfermedades renales. Por lo tanto, la concentración de glucosa en sangre debe mantenerse en un rango estrecho entre 100 mg/dL y 120 mg/dL.

La glucosa en sangre está regulada por el equilibrio entre la entrada y la salida de glucosa en un modelo de un compartimento (Figura 1A). El aporte de glucosa incluye la glucosa absorbida de los alimentos y la producción de glucosa del hígado, los riñones y el intestino delgado. La producción de glucosa comprende la absorción de glucosa en los tejidos y la eliminación de glucosa de los riñones. Tanto la cantidad de entrada como la salida de glucosa están reguladas por hormonas endocrinas. Por ejemplo, el glucagón, la corticosterona y las catecolaminas, conocidas como hormonas contrarreguladoras, se liberancuando los niveles de glucosa en sangre disminuyen. Estimulan la descomposición del glucógeno y la síntesis de glucosa, principalmente del hígado; Estos procesos se conocen como glucogenólisis y gluconeogénesis, respectivamente. La hiperglucemia aumenta la liberación de insulina de las células β pancreáticas y estimula la absorción de glucosa en los músculos, los tejidos adiposos y el corazón 6,7,8,9. El ejercicio aumenta la captación de glucosa independiente de la insulina10. El sistema nervioso simpático aumenta la absorción de glucosa en los músculos y el tejido adiposo marrón 6,11. Para medir la capacidad de regular el metabolismo de la glucosa en los tejidos periféricos, los investigadores suelen utilizar la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) y la prueba de tolerancia a la insulina (ITT) (Figura 1B, C). En la TGT hay que tener en cuenta dos factores: la liberación de insulina y la sensibilidad a la insulina (Figura 1B). Sin embargo, la curva de concentración de glucosa durante la prueba de 120 minutos es diferente en cada ratón, lo que puede afectar a diferentes cantidades de liberación de hormonas. En el ITT, la glucosa en sangre está regulada tanto por la sensibilidad a la insulina como por la liberación de hormonas contrarreguladoras. Por lo tanto, es difícil determinar el significado preciso del metabolismo de la glucosa, la liberación de insulina y la sensibilidad a la insulina en GTT e ITT, en situaciones en las que los niveles de glucosa en sangre no son constantes.

Para superar estos problemas, es deseable mantener la glucosa en sangre a un nivel constante (o "pinza"). En la pinza hiperglucémica, la glucosa se infunde en el torrente sanguíneo para elevar los niveles de glucosa en sangre a un nivel específico y luego se mantiene en ese nivel durante un período de tiempo. La cantidad de glucosa infundida se ajusta en función de las mediciones de los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos para mantener un estado estable. Esta técnica es particularmente útil para comprender los parámetros de secreción de insulina a un nivel de glucosa fijado. La pinza hipoglucémica es un método para mantener bajos los niveles de glucosa en sangre mediante la infusión de insulina. La glucosa se infunde a una velocidad variable para mantener un nivel específico de glucosa en sangre. Si el ratón no puede recuperarse de la hipoglucemia, se debe infundir más glucosa.

Aunque la realización de pinzas hiperglucémicas e hipoglucémicas tiene muchas ventajas, los procedimientos quirúrgicos y experimentales se consideran técnicamente difíciles. Así, pocos grupos de investigación han sido capaces de realizarlas. Nuestro objetivo fue describir estos métodos para que los investigadores con limitaciones financieras y de mano de obra comiencen estos experimentos con un presupuesto más bajo.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kumamoto.

NOTA: Para aliviar el dolor, se administró ibuprofeno en agua potable (0,11 mg/ml) durante 48 h, y buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) 30 min antes de la cirugía. Las condiciones estériles incluyen guantes, máscaras e instrumentos esterilizados en autoclave con óxido de etileno entre animales. La cirugía se realizó en una almohadilla térmica ajustada a 37 °C y cubierta por una nueva alfombra de laboratorio para cada animal. Antes de la cirugía, el área quirúrgica se limpió con una solución de betadine y alcohol. Todos los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados con un autoclave (para no más de dos cirugías). Antes de hacer la incisión, se revisó a los ratones para asegurarse de que estuvieran completamente anestesiados. La profundidad de la anestesia para cada ratón se evaluó antes y durante la cirugía mediante un pellizco en el dedo del pie. El período de aclimatación no fue más de 5 minutos cada vez. Siga las instrucciones de la IACUC en la institución respectiva.

1. Preparación de tubos para la vena yugular y la arteria carótida

  1. Esterilice todos los tubos, suministros de polipropileno (p. ej., puntas de pipeta) y suturas con un autoclave u óxido de etileno. Para la vena yugular, conecte 8 cm de tubo1 (ver Materiales) y 3 cm de tubo2 con pegamento (Figura 2A). Coloque 2 mm de tubo1 en la parte superior, ya que el tubo 2 (polietileno) es demasiado duro y puede dañar los vasos sanguíneos (tubo1.1).
  2. Tubo de extensión para la vena yugular (Tubing1.2) para infundir glucosa e insulina
    1. Prepare dos tubos de 30 cm y un tubo de 10 cm con tubo2 (Figura 2A). Corte el extremo afilado de una punta de pipeta de 20 μL (o cualquier cosa que tenga un extremo de punta estrecho con un diámetro exterior de < 0,5 mm para conectar con el tubo 1.1) y coloque tres tubos2 (30 cm, 30 cm y 10 cm) juntos en él. Selle con pegamento adhesivo.
    2. Coloque 5 cm de tubo1 en el otro extremo del tubo2.
  3. Para la arteria carótida (tubería1.3): Estire la tubería2 para hacerla más delgada. Conecte 8 cm de tubería1 y 3 cm de tubería estirada2 con pegamento (Figura 2A). Haz una marca a 9 mm de la punta.
  4. Aguja con extremo no afilado que conecta el tubo a la jeringa: Haga un rasguño cerca del extremo afilado de la aguja (23 G) con una lima de metal, dóblela suavemente hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces con unos alicates y rómpela. Haga el mismo corte en el medio de la aguja para hacer un trozo de conector de metal (Figura 2A).
  5. Tubo de extensión para la extracción de sangre de la arteria (Juego de tubos 1.4): Conecte 10 cm de tubo1 con el conector metálico y la aguja no afilada que se fabricó en el paso 1.4.
    NOTA: Todos los tubos y suturas se esterilizan con un autoclave u óxido de etileno

2. Cirugía

  1. Anestesiar a un ratón con isoflurano (1,5-2,0%) o ketamina/xilacina (ketamina 10 mg/mL, xilacina 1 mg/mL en solución salina estéril al 0,9%, 0,1 mL/10 g de peso corporal (PC) mediante inyección intraperitoneal [ip]). Mantenga el ratón sobre la almohadilla caliente (37 °C) para reducir el estrés físico. Espere la anestesia profunda durante 5-10 minutos. Confirme la profundidad de la anestesia mediante el reflejo pedal, la respiración y la frecuencia cardíaca, y la respuesta a los estímulos mediante el pellizco de los dedos de los pies. Durante la cirugía, se debe usar cinta quirúrgica para asegurar la tapa de la nariz a la mesa de operaciones para la inhalación continua de la anestesia. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
  2. Llene solución salina heparinizada (100 U/mL) en los tubos 1.1 y 1.3 y conéctelos con una jeringa de 1 mL con una aguja no afilada (Figura 2B). Cierre el extremo de la tubería3 (consulte la Tabla de materiales) fundiéndola con un soldador, que se utilizará como tapas para la tubería1.1 y la tubería1.3.
  3. Afeitar y limpiar la primera (interescapular en la espalda) y la segunda (cuello en la parte delantera) de la incisión con tres ciclos de betadine al 10% seguidos de una preparación preoperatoria con alcohol estéril al 70%. Realizar una pequeña incisión vertical en la línea media cefálica de 5 mm al esternón, diseccionar los tejidos sin fondo y exponer la arteria. Separa el nervio vago de la arteria. Esto reduce los efectos negativos de la eliminación del nervio vago en el metabolismo de la glucosa.
    NOTA: El paso desde la incisión ventral hasta el paso donde se inserta el catéter en la vena y se asegura con suturas de seda se realiza bajo un microscopio.
  4. Coloque dos suturas de seda debajo de la arteria. Detenga el flujo sanguíneo atando una sutura firmemente en el lado craneal (Figura 2C-1) y la otra sin apretar en el lado caudal (Figura 2C-2), lo cual es suficiente para detener el flujo sanguíneo pero suficiente para volver a abrirse más tarde. Coloque una sutura más debajo de la arteria (Figura 2C-3).
  5. Corte la arteria cerca de la Figura 2C-1 con unas tijeras de resorte y coloque el tubo 1.3 en la arteria. Haga un lazo suelto tanto en la arteria como en el tubo (Figura 2C-3, no lo ate firmemente. El tubo se insertará más profundamente en la arteria). Abra el nudo en el lado caudal (Figura 2C-2) para insertar el tubo hasta que la marca de 9 mm llegue al nudo en el medio (Figura 2C-3). Amarre firmemente todas las ligaduras y enjuague con solución salina estéril heparinizada.
  6. Exponga la vena yugular derecha desde la misma incisión que la arteria carótida derecha para el catéter yugular. Aislar el extremo craneal y ligarlo con sutura de seda (Figura 2D-1, Tabla de materiales). Coloque otro trozo de sutura en el extremo caudal de la vena expuesta (Figura 2D-2). Corte la vena cerca de la marca Figura 2D-1 con unas tijeras de resorte.
  7. Inserte el catéter (no demasiado profundo para evitar que penetre en los vasos), átelo y confirme visualmente que toma muestras de sangre. Enjuague con solución salina estéril heparinizada (0,2 ml) y confirme visualmente que no quede sangre en el catéter.
  8. Coloque el ratón sobre el nuevo paño quirúrgico estéril para evitar la infección de la primera herida. Dar la vuelta al ratón, limpiar con tres ciclos de betadine seguidos de una preparación preoperatoria con alcohol estéril y hacer una pequeña incisión entre los omóplatos.
  9. Pase un portaagujas por debajo de la piel desde la incisión en la espalda hasta el lado ventral. Pinza los catéteres con el portaagujas, páselos por debajo de la piel y llévelos de vuelta. Limpie el sitio de la incisión y cierre las incisiones ventrales con una sutura sintética (diámetro 0,15-0,2 mm). Pinza el catéter venoso con micro serrefine en el sitio de la incisión entre los omóplatos.
  10. Cortar el catéter 1 cm por encima de la pinza, enjuagarlo con solución salina heparinizada y cerrarlo con un tapón (paso 2.4). Siga el mismo procedimiento para el catéter arterial. Cerrar la incisión dorsal con una sutura sintética (diámetro 0,15-0,2 mm).
  11. Coloque el ratón en una jaula cálida y limpia (Figura 2E). Realizar diariamente los cuidados postoperatorios.

3. Recuperación

  1. Coloque una sola casa para el ratón porque otro ratón puede morder el catéter en la carcasa del grupo.
    1. Para reducir el estrés por aislamiento social, mantenga a los ratones con enriquecimientos ambientales (p. ej., refugios). Realizar diariamente los cuidados postoperatorios. Para aliviar el dolor, la angustia y el malestar, proporcione atención postoperatoria, incluida la analgesia (ibuprofeno en el agua potable (0,11 mg/ml).
    2. Observe a los ratones en busca de signos de infección, como supuración, letargo o dolor en el sitio de la incisión. La mayoría de los ratones sanos comienzan a caminar y alimentarse aproximadamente 2 horas después de la cirugía. Una postura encorvada, el pelaje erizado y la disminución de la ingesta de alimentos pueden indicar dolor. Si se observan estos signos, eutanasia inmediata a los ratones decapitándolos bajo anestesia profunda o asfixia por dióxido de carbono.
  2. La sangre entrará en el catéter en la arteria y formará un coágulo. Para mantener las líneas del catéter, retire el coágulo diariamente, siguiendo los pasos 3 a 6.
  3. Llene una jeringa de 1 ml y una aguja de 23 g (extremo no afilado) con solución salina heparinizada (100 U/ml). Utilizando una cámara de inducción, anestesiar ligeramente al ratón con isoflurano (1,0%-1,5%). A continuación, retire el ratón de la cámara y realice la extracción del coágulo bajo anestesia con isoflurano con una tapa nasal.
  4. Sujete el tubo de la arteria en la parte posterior del ratón con micro serrefine, retire la tapa y extraiga la sangre y los coágulos. Enjuague el catéter con solución salina heparinizada con otra jeringa de 1 ml con una aguja de 23 G (extremo no afilado) y vuelva a taparlo. Limpie la vía venosa como la vía arterial en caso de coagulación grave.
  5. Realice el mismo procedimiento para limpiar el catéter una vez al día durante 3 a 5 días.
  6. Compruebe el peso corporal del ratón. Si el peso corporal se reduce en más de un 10% desde el día de la cirugía, aplique cuidados de apoyo e intente mejorar la puntuación de la condición corporal normal, y utilice el ratón para otro experimento.
    NOTA: La pérdida de peso de los animales fue inferior al 10% en los experimentos de este estudio. La pérdida de peso afectará fuertemente el metabolismo sistémico de la glucosa. Por lo tanto, se recomienda esperar a la recuperación del peso corporal o retirar del experimento de la pinza.

4. Configure el sistema de bomba (para pinza hipoglucémica)

  1. Prepare 1 U/mL de insulina en solución salina BSA al 0,1 %, glucosa al 30 % en solución salina y solución salina heparinizada.
  2. Mide el peso corporal del ratón. Calcule el volumen de 1 U/mL de insulina para hacer la infusión de insulina (10 mU/kg/min). Infundir 1,7 μL/min de solución de insulina en los ratones en el experimento de pinza. Para hacer 300 μL de insulina infundida, el volumen requerido para 1 U/mL de insulina (μL) es de 2,647 (μL/g) x Peso corporal (g). Un volumen de 300 μL de infusión de insulina es suficiente para terminar el experimento de pinza en 1 ratón. La Tabla 1 muestra un ejemplo de infusión de insulina.
  3. Llene la infusión de insulina y la glucosa al 30 % en cada jeringa Hamilton, conéctelas con el tubo 1.2 y coloque la jeringa en la bomba de jeringa (Figura 3A). Llene cada solución en el tubo 1.2. Llene solución salina en una jeringa de 1 ml y un juego de tubos 1.4 (Figura 2A).
  4. Anestesiar al ratón con isoflurano (1,0%-1,5%) y conectar el tubo1.2 al catéter venoso y el juego de tubos1.4 al catéter arterial (Figura 3A). Usa cinta de celofán para mantener los tubos juntos.
  5. Coloque el ratón en un vaso de precipitados vacío de 500 ml.
    NOTA: Para la pinza hiperglucémica, use solución salina en lugar de 1 U/ml de insulina.

5. Pinza hipoglucémica

  1. Mida los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos, como se muestra en la Figura 3B, y recoja muestras de sangre para mediciones hormonales a -15 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minutos, 80 minutos, 100 minutos y 120 minutos. Siga el paso 5.2 para medir la glucosa en sangre.
    NOTA: No es necesario medir la glucosa en sangre en todos los momentos, pero se recomienda medirla al menos cada 10 min. Mida la glucosa en sangre cada 5 minutos cuando su nivel y velocidad de infusión de glucosa no sean estables.
  2. Sujete el extremo superior del juego de tubos1.4 y conecte una jeringa nueva, extraiga 50 μL de sangre y colóquela en un tubo de 1.5 mL para lavarla. Medir el nivel de glucosa en la sangre.
    NOTA: Es la sangre diluida por la solución salina en el tubo debido al lavado del catéter después de la toma de muestras anterior. Un volumen de 50 μL es suficiente para reemplazar la sangre diluida con sangre pura.
  3. Almacene la sangre diluida (glóbulos rojos). Lave la sangre acumulada (~500 μL) con solución salina (consulte los pasos 5.11-5.12) y regrese al cuerpo para evitar la hipoxia.
  4. El catéter está conectado a la arteria con presión arterial alta, por lo que cuando se afloja la pinza, la sangre fluirá hacia afuera y se usará para medir la glucosa con un práctico medidor de glucosa. Infundir 50 μL de solución salina para mantener suficiente cantidad de líquido sanguíneo.
  5. Para la toma de muestras de sangre, extraiga 50 μl adicionales de sangre y colóquela en un tubo de 1,5 ml sobre hielo. Infundir 100 μL (50 μL de reemplazo + 50 μL de muestreo) de solución salina.
  6. Después de 0 minutos de medición de glucosa en sangre, ponga en marcha la bomba de insulina de la jeringa. Primero, infundir 30 mU/kg/min en bolo durante 2 min (5,1 μL/min), luego 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) de infusión durante el resto de la duración.
  7. Mida el nivel de glucosa en sangre y cambie la velocidad de infusión de glucosa cada 5-10 minutos durante 120 minutos.
  8. Cree un estado estacionario en el que la velocidad de infusión de glucosa no cambie y el nivel de glucosa en sangre sea de 50 mg/dL.
  9. Después de recolectar la muestra de sangre a t = 120 min, infundir un agente de eutanasia en la vena yugular y recolectar tejidos para análisis de ARN o proteínas.
  10. Centrifugar la sangre a 1000 x g durante 5 minutos y medir la concentración de hormonas como la insulina o el péptido C utilizando un kit ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  11. Para lavar la sangre, centrifugar la sangre a 1000 x g durante 3 min. Retirar el sobrenadante, añadir 500 μL de solución salina heparinizada y realizar el pipeteo.
  12. Repita el lavado nuevamente y coloque los glóbulos rojos lavados en una jeringa de 1 ml para la arteria. Las células sanguíneas se volverán a infundir automáticamente cuando se infundan 50 o 100 μL de solución salina en los pasos 5.2 y 5.3. Controle cuidadosamente el hematocrito para prevenir la hipoxia.
    NOTA: Para la medición de la glucosa en sangre, se utilizó un medidor de glucosa comercial y práctico.

6. Pinza hiperglucémica

  1. Seguir los pasos de la técnica de pinza hipoglucémica, pero sin infusión de insulina y con la glucemia ajustada a 250-300 mg/dL. Mida los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos, como se muestra en la Figura 3B, y recoja muestras de sangre para mediciones hormonales a -15 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minutos, 80 minutos, 100 minutos y 120 minutos.
  2. Conecte una jeringa nueva al juego de tubos1.4, extraiga 50 μL de sangre y colóquela en un tubo de 1.5 mL para lavarla.
  3. Para la toma de muestras de sangre, extraiga 50 μl adicionales de sangre y colóquela en un tubo de 1,5 ml sobre hielo. Infundir 100 μL (50 μL de reemplazo + 50 μL de muestreo) de solución salina.
  4. Después de 0 minutos de medición de glucosa en sangre, ponga en marcha la bomba de la jeringa de glucosa. Primero, infundir 30 g/kg/min en bolo durante 2 min (5,1 μL/min), luego 10 g/kg/min (1,7 μL/min) durante el resto de la duración.
  5. Mida el nivel de glucosa en sangre y cambie la velocidad de infusión de glucosa cada 5 -10 minutos durante 120 minutos. Cree un estado estacionario en el que la velocidad de infusión de glucosa no cambie y el nivel de glucosa en sangre sea de 250-300 mg/dL, un estado hiperglucémico con pinza.

Resultados

El estudio de pinza hipoglucémica se realizó en ratones machos C57BL/6N (8 semanas de edad, más de 25 g de peso corporal) 3 h en ayunas al inicio del experimento (Figura 4A,B). El nivel inicial de glucosa en sangre fue de 136 mg/dl (t = -15 min). Si es inferior a 90 mg/dL, puede deberse a que la cirugía no salió bien, o a que el catéter arterial se insertó demasiado profundo, o a que han entrado coágulos de sangre en el flujo sanguíneo. La condición del ratón después de la cirugía afecta el metabolismo energético en el ratón. El metabolismo fisiológico de la glucosa no se puede medir en condiciones de mala salud. C57BL es más propenso a la coagulación después de la cirugía; Los ratones que tienen un peso corporal más alto, como los ratones FVB o ICR, tienen menos probabilidades de perder peso debido al lavado de coágulos después de la cirugía. Por lo tanto, es mejor que los principiantes utilicen ratones FVB para practicar los procedimientos de pinzamiento. Los ratones C57BL requieren cuidados más intensivos. La inserción del catéter de 9 mm en la arteria no nos ha dado ningún problema en la recolección de sangre, incluso en ratones FVB e ICR. La administración de insulina se inició a t = 0 min y los niveles de glucemia disminuyeron (Figura 4A). La RGI no había sido estable entre t = 0 min y t = 70 min. Posteriormente, se convirtió en un estado estacionario después de 80 min.

El estudio de pinza hiperglucémica también se realizó en ratones machos C57BL/6N (8 semanas de edad, más de 25 g de peso corporal) 3 h en ayunas al inicio del experimento (Figura 4C,D). Después de medir la glucosa en sangre y recolectar muestras de sangre a t = -15 y t = -5 min, se infundió glucosa de t = 0 min. El nivel de glucosa en sangre llegó a ser de 250 mg/dL a t = 40 min. El estado estacionario continuó desde t = 30 min hasta el final.

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Figura 1: Regulación de los niveles de glucosa en sangre. (A) Diagrama conceptual que ilustra la regulación de la glucosa en sangre en el cuerpo. (B,C) Regulación del metabolismo de la glucosa en (B) test de tolerancia a la glucosa (GTT) y (C) test de tolerancia a la insulina (ITT). Varios factores regulan los niveles de glucosa en sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Preparación de los tubos y pasos de la cirugía. (A) Imágenes de los tubos de la arteria carótida y la vena yugular. Los números de tubería coinciden con los números de paso del protocolo. (B) Método de preparación de los tubos para la cirugía. (C, D) Las posiciones numeradas en las que se ligan los hilos de seda para insertar el catéter en la arteria (C) y en la vena (D). Posiciones de los hilos de seda en el lado craneal (C-(1)) y caudal de la arteria (C-(2)), y uno más en el centro de ellos (C-(3)) (procedimiento 2-4). Posiciones de los hilos de seda en el lado craneal (D-(1)) y caudal de la vena (D-(2)), y uno más en el medio de ellos (D-(3)) (procedimiento 2-6). (E) Diagrama de las cánulas arteriales y venosas que salen de la espalda Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ajuste de la abrazadera. (A) Diagrama que muestra la configuración de los tubos, las bombas, las jeringas y el ratón. (B) Hoja para registrar los niveles de glucosa en sangre y la velocidad de infusión de glucosa. Se recogen 50 μL de sangre a t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min y 120 min. La velocidad de infusión de insulina fue de 5,1 μL/min de t = 0 a 2 min y cambió a 1,7 a t = 2 min. El nivel de glucosa en sangre se midió cada 10 min. La glucemia se midió cada 5 min cuando su nivel no era estable. La velocidad de infusión de glucosa se modificó cada vez que se midió la glucosa en sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Resultados representativos de pinza hipoglucémica y pinza hiperglucémica. (A) Niveles de glucosa en sangre y (B) Velocidad de infusión de glucosa de pinza hipoglucémica. (C) Niveles de glucosa en sangre y (D) velocidad de infusión de glucosa de la pinza hiperglucémica. Los datos representan la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SoluciónCálculoPara ratón de 20 g
1 U/mL de insulina(2.647 x peso corporal) μL52,9 μL
Solución salina BSA al 0,1 %300 μL - volumen de insulina (μL)247,1 μL

Tabla 1: Ejemplo de cálculo para preparar la infusión de insulina.

Discusión

El método descrito aquí es simple y se puede hacer con puntas de pipeta, jeringas y otros elementos que se encuentran en los laboratorios ordinarios. Aunque es posible que los investigadores necesiten comprar tubos y bombas adicionales, no se necesitan equipos costosos. Así, este protocolo de cateterismo y pinza es más fácil de iniciar en comparación con reportes previos 12,13,14.

La técnica de pinza fue desarrollada alrededor de 1970 y ha sido utilizada en ratones y humanos15. Es un método útil para medir con precisión el metabolismo de la glucosa y se dice que es el estándar de oro. Sin embargo, no es una técnica común utilizada por muchos investigadores. La técnica de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico se ha descrito en ratones13 y ratas14, pero el método de cateterismo aquí es diferente, y los lectores pueden elegir el más fácil para sus experimentos. Uno de los propósitos de este artículo es reducir el obstáculo para iniciar un experimento. Por lo tanto, proporcionamos información detallada sobre los materiales de los catéteres hechos a mano, los procedimientos quirúrgicos y un ejemplo de curso de tiempo experimental. Estos son informativos para el investigador que intenta realizar pinzas por primera vez.

La secreción de insulina en la obesidad y la diabetes depende de la etapa. Muchos informes sugieren que la secreción de insulina aumenta en la obesidad para reducir la glucosa en sangre en el estado de resistencia a la insulina16, pero la función de las células β se dañará en la DM tipo 217,18. De hecho, se ha informado que el número y el área de los islotes pancreáticos y la secreción de insulina aumentan en modelos de ratones con obesidad, como los ratones alimentados con una dieta alta en grasas19 o los ratones deficientes en leptina20. En estos modelos de ratón, que tienen un fenotipo evidente, las diferencias pueden determinarse examinando los niveles de insulina en sangre 15-30 min después de la administración de glucosa en el GTT. Sin embargo, en algunos casos, no es fácil determinar las diferencias en la secreción de insulina. Por ejemplo, si los ratones transgénicos (Tg) tienen un nivel de glucosa en sangre de 500 mg/dL, mientras que un ratón WT tiene 300 mg/dL y ambos ratones tienen el mismo nivel de insulina en sangre, ¿podemos decir que la secreción de insulina disminuye en Tg? En este caso, no podemos comparar la capacidad de secreción de insulina a menos que los niveles de glucosa en sangre sean los mismos utilizando el método presentado aquí. Esta es una de las razones por las que no existe una teoría establecida sobre cuándo la función de las células β comienza a deteriorarse en la transición de la obesidad a la diabetes. También podemos medir la secreción de insulina mediante cultivo primario de páncreas21 o ex vivo22. Sin embargo, arruinará el efecto del sistema nervioso central en la liberación de insulina porque se eliminará la inervación del nervio vago. La secreción de insulina post-absorción es bien conocida, pero el cerebro y el sistema nervioso autónomo también regulan la liberación de insulina23. El experimento para analizar este último debe realizarse en una extracción de sangre sin anestesia, sin restricciones e indolora. Esta es también la razón por la que el nervio vago debe separarse de la arteria carótida en el paso 2.3.

Se ha reportado que la diabetes mellitus causa hiperglucemia debido a la resistencia a la insulina y al aumento de las secreciones de glucagón24 y otras hormonas contrarreguladoras25. Además, los episodios repetidos de hipoglucemia en humanos con diabetes debido a fallas en la dosis de insulina u otras causas pueden conducir a una condición llamada hipoglucemia recurrente, en la que los pacientes son propensos a la hipoglucemia26. Se ha sugerido que la tasa de caída de la glucemia en la pinza hipoglucémica afecta la detección periférica o central de la hipoglucemia27. La hipoglucemia de inicio lento puede ser apropiada para estudiar el papel de los sensores de glucosa en las venas portal-mesentéricas, mientras que una disminución muy rápida de la glucosa en sangre puede ser apropiada para el estudio de los sensores de glucosa cerebral27. La insulina de 1 U/mL se utiliza en ratones C57BL delgados. Sin embargo, se necesitará una mayor concentración de insulina en ratones obesos porque tienen resistencia a la insulina, y 1 U/mL no es suficiente para disminuir los niveles de glucosa en sangre.

En el modelo de un compartimento del pool de glucosa en sangre (Figura 1A), la cantidad de glucosa absorbida puede afectar a la tasa de aporte de glucosa14. Así, la tasa de producción de glucosa, uno de los principales objetivos de la medición del clamp hiperinsulinémico-euglucémico, puede verse afectada por la duración del ayuno. Sin embargo, un ayuno prolongado puede aumentar la liberación de hormonas contrarreguladoras. Por lo tanto, los investigadores establecen el tiempo de ayuno de acuerdo con su propósito de análisis. Otro método de pinza incluye la toma de muestras de sangre de la cola, lo cual es simple porque solo se necesita insertar una cánula intravenosa14. Sin embargo, la sangre se recolecta en una sujeción, lo que causa una cantidad moderada de estrés por restricción y un aumento de las catecolaminas plasmáticas y otras hormonas del estrés14. Además, es preferible medir las concentraciones de hormonas en el flujo sanguíneo en el centro del cuerpo en lugar de en la sangre en las extremidades. Por lo tanto, la toma de muestras de sangre de las arterias en ratones que se mueven libremente es la mejor para medir fisiológicamente el metabolismo de la glucosa. Los ratones no se mueven, y no es necesario girar cuando están aclimatados al entorno experimental. Sin embargo, se recomienda utilizar un eslabón giratorio para evitar que se enreden las líneas de infusión y muestreo. La tubería 1.2 y el juego de tuberías 1.4 (Figura 3A) no son buenos para usar un eslabón giratorio. El sistema debe mejorarse si se requiere que el investigador utilice un pivote. La reinfusión de células sanguíneas no influye en el estado estable establecido de glucosa en sangre e insulina. El presente método también se puede aplicar a estudios metabolómicos utilizando isótopos. Por ejemplo, si se infunde continuamente 13C-glucosa en la vena, se puede medir la tasa de renovación metabólica sistémica y los metabolitos intermedios intracelulares28. Por lo tanto, este es un método útil para analizar el metabolismo de la glucosa.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes (del MEXT); una Beca de Ayuda a la Investigación Científica (B) (Subvención número JP21H02352); Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médicos (AMED-RPIME, número de subvención JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); la Fundación Conmemorativa de Uehara; Fundación Astellas para la Investigación de Trastornos Metabólicos; Fundación Suzuken Memorial, Fundación de Ciencias de la Vida Akiyama y Fundación de Investigación de Neurociencia Narishige. También agradecemos a Nur Farehan Asgar, Ph.D, por editar un borrador de este manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pegamento adhesivoHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
Kit ELISA (péptido C)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Ratón C-peptide ELISA Kit ELISA
kit ELISA (insulina)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U)
Práctico medidor de glucosaNipro Co.11-777Free Style Freedom Lite
Insulina (100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
RatónJapón SLC Inc.C57BL/6NCrSlcC57BL
SuturaNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Bomba
jeringaPump Systems Inc.NE-1000
Sutura sintéticaVÖ MELHR-17
Tubing1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) Tubo de silicona2
Fisher Scientific427400BD Tubo de PE intramedic3
IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.tamaño5Tubo de polietileno tamaño5
de esterilizada

Referencias

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  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
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  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

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