Artículo de método

Producción hepática de glucosa, ureagénesis y lipólisis cuantificadas mediante el modelo de hígado de ratón perfundido

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DOI:

10.3791/65596

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6 de octubre de 2023

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1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2NNF Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department for Clinical Biochemistry, Copenhagen University Hospital - Bispebjerg and Frederiksberg, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 5NNF Center for Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un método robusto para la perfusión in situ del hígado de ratón para estudiar la regulación aguda y directa del metabolismo hepático sin alterar la arquitectura hepática pero en ausencia de factores extrahepáticos.

Resumen

El hígado tiene numerosas funciones, incluido el metabolismo de los nutrientes. A diferencia de otros modelos in vitro e in vivo de investigación hepática, el hígado perfundido aislado permite el estudio de la biología hepática y el metabolismo en todo el hígado con una arquitectura hepática intacta, separada de la influencia de factores extrahepáticos. Las perfusiones hepáticas se desarrollaron originalmente para ratas, pero el método también se ha adaptado a ratones. Aquí describimos un protocolo para la perfusión in situ del hígado de ratón. El hígado se perfunde antegrágradamente a través de la vena porta con tampón bicarbonato Krebs-Henseleit oxigenado, y la salida se recoge de la vena cava inferior suprahepática con pinzamiento de la vena cava inferior infrahepática para cerrar el circuito. Con este método, los efectos hepáticos directos de un compuesto problema pueden evaluarse con una resolución temporal detallada. La función hepática y la viabilidad son estables durante al menos 3 h, lo que permite la inclusión de controles internos en el mismo experimento. Las posibilidades experimentales que utilizan este modelo son numerosas y pueden inferir información sobre la fisiología hepática y las enfermedades hepáticas.

Introducción

El hígado es un órgano esencial en el metabolismo. Desempeña un papel clave en el control del equilibrio energético de todo el cuerpo mediante la regulación del metabolismo de la glucosa, los lípidos y los aminoácidos. El aumento de las enfermedades hepáticas en todo el mundo se está convirtiendo en una importante carga para la salud mundial, y se necesita más conocimiento sobre la fisiopatología y sus consecuencias para las funciones hepáticas.

Se han desarrollado varios modelos in vitro para la investigación en el hígado como complemento de los estudios in vivo. Los hepatocitos primarios aislados y cultivados de roedores y humanos son ampliamente utilizados. Las células no parenquimatosas se pueden separar de los hepatocitos mediante centrifugación diferencial y de gradiente, y el cocultivo de diferentes tipos celulares es útil para estudiar la diafonía intercelular1. A pesar de que los hepatocitos humanos primarios se consideran el estándar de oro para probar la toxicidad de los fármacos, varios estudios han demostrado que los hepatocitos se desdiferencian rápidamente en el cultivo de tejidos, lo que resulta en la pérdida de las funciones hepáticas 2,3,4. El cultivo de hepatocitos en un sistema esferoide 3D mejora la desdiferenciación, es más estable y parece imitar al hígado in vivo en un grado mayor que los sistemas de cultivo 2D tradicionales5. Los cortes de hígado cortados con precisión son otro modelo in vitro bien establecido que mantiene intacta la arquitectura del tejido y contiene las células no parenquimatosas presentes en el hígado6. Los modelos in vitro más avanzados incluyen el hígado en un chip7 y los organoides hepáticos8. Sin embargo, con todos estos enfoques, hay una pérdida de integridad estructural y dinámica de flujo, incluido el flujo vectorial de la vena portal-hepática, lo que probablemente afecte la generalización.

El hígado de rata perfundido aislado fue descrito por primera vez por Claude Bernard en 18559, y todavía se utiliza en varios campos científicos para estudios de biología hepática, toxicología y fisiopatología. Las ventajas del hígado perfundido en comparación con los modelos in vitro mencionados anteriormente incluyen el mantenimiento de la arquitectura hepática, el flujo vascular, la polaridad y zonación de los hepatocitos, y las interacciones entre los hepatocitos y las células no parenquimatosas. En comparación con los estudios in vivo, el hígado perfundido permite el estudio del metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y con un control completo sobre las condiciones experimentales. A lo largo de los años se han realizado varias modificaciones para mejorar el modelo de perfusión hepática de rata 10,11,12,13. Aunque se han utilizado ratones para estudios de hígado perfundido aislado, hay menos bibliografía disponible. Aquí, presentamos un método para la perfusión in situ del hígado de ratón mediante canulación de la vena porta y la vena cava suprahepática inferior para estudiar las respuestas metabólicas agudas y directas a sustratos metabólicos y hormonas medidas en el efluente venoso hepático del hígado de ratón en tiempo real.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentos con Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca (permiso 2018-15-0201-01397) y el comité de ética local de acuerdo con la directiva de la UE 2010/63/UE, los Institutos Nacionales de Salud (publicación n.º 85-3) y siguiendo las directrices de la legislación danesa que rige la experimentación con animales (1987). Se trata de un procedimiento terminal, y la causa de la muerte es la exanguinación y perforación del diafragma bajo anestesia profunda.

1. Animales de experimentación

  1. Obtenga ratones de la cepa, edad y sexo deseados. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6JRj de entre 11 y 16 semanas de edad. Aloje hasta 5 ratones machos u 8 hembras por jaula con acceso ad libitum a comida y agua y mantenga un ciclo de luz-oscuridad de 12 h / 12 h con luces encendidas de 6 a.m. a 6 p.m.

2. Preparativos preoperatorios

  1. Prepare un tampón de perfusión hepática.
    1. Búfer Krebs-Henseleit. Mezclar y disolver 118 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO 4 y 1,2 mmol/L de KH 2 PO4 en dH 2 O. Disolver 1,25 mmol/L de CaCl2en un vaso de precipitados aparte y añadir el tampón.
    2. Disuelva 25 mmol/L de NaHCO3 y agréguelo lentamente al tampón mientras revuelve. Guarde el tampón a 4 grados. El búfer es estable durante al menos 1 mes.
      NOTA: La precipitación puede ocurrir si el CaCl2 y el NaHCO3 no se disuelven individualmente antes de ser agregados.
  2. Filtrar el tampón de perfusión a través de un filtro de 2 μm y ajustar el pH a 7,5 utilizando HCl.
    NOTA: Este paso debe realizarse el día experimental, ya que el pH aumenta con el tiempo, incluso cuando se almacena en matraces cerrados.
  3. Preparar los compuestos de ensayo en una concentración superior a la concentración final deseada (p. ej., concentración de 20x cuando se infunde a una velocidad de 0,175 ml/min a través de una bomba de brazo lateral) en tampón de perfusión Krebs-Henseleit filtrado y ajustado al pH. Si procede, diluir los compuestos problema en tampón de perfusión Krebs-Henseleit con un 1 % de BSA añadido como portador (para evitar la adhesión a tubos y cristalería, esencial para todos los péptidos), filtrado a través de un filtro de tamaño adecuado.

3. Funcionamiento y perfusión

NOTA: En la Figura 1 se proporciona una ilustración de la configuración de perfusión utilizada en este estudio.

  1. Gasear el tampón de perfusión (95% O 2, 5% CO2) durante al menos 30 minutos para suministrar suficiente oxígeno al hígado y mantener el pH correcto desde el inicio de la operación (el sistema tampón de bicarbonato alcanzará un pH de 7,4 bajo gasificación continua, ver Figura 1 suplementaria).
  2. Anestesiar a un ratón mediante la administración de ketamina (90 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
  3. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una mesa de operaciones calentada y confirme la falta de reflejos en respuesta al pellizco del dedo del pie. Rocíe con etanol al 70% para evitar que el cabello se pegue a las tijeras. Fijar el mouse a la superficie caliente ayuda a aumentar la estabilidad para los siguientes procedimientos.
  4. Haga una incisión con unas tijeras en la base del abdomen y corte hacia arriba hasta la caja torácica en ambos lados para exponer la cavidad abdominal. Mueva los intestinos hacia la derecha con un hisopo de algodón, exponiendo la vena porta.
  5. Coloque dos ligaduras debajo de la vena porta con pinzas curvas y prepare un nudo suelto para cada ligadura.
  6. Inserte un catéter de 0,7 mm en la vena porta. Una vez perforada, retire la aguja del catéter y guíe el catéter a través de la vena hasta que la punta del catéter esté cerca del hígado, como se ilustra en la Figura 2. La sangre fluye hacia el catéter.
  7. Apriete las ligaduras. Si el catéter no está lleno de sangre, llénelo con tampón de perfusión para evitar la introducción de una burbuja de aire.
  8. Conecte el tubo de perfusión e inicie la perfusión del hígado con tampón de bicarbonato Krebs-Henseleit a 37 °C poniendo en marcha la bomba de rodillos a un caudal de perfusión de 0,8 ml/min. El hígado palidece en cuestión de segundos.
  9. Corta la caja torácica y el diafragma con unas tijeras. En este punto, el animal es sacrificado. Coloque una ligadura debajo de la vena cava inferior suprahepática con pinzas de punta fina. Coloque un bolígrafo, una gasa enrollada u otro artículo desechable debajo de la parte posterior del ratón para que la vena sea más accesible.
  10. Insertar un catéter en la vena cava inferior suprahepática a través de la aurícula derecha del corazón. Cuando esté perforado, retire la aguja del catéter y guíe el catéter a través de la vena hasta que la punta del catéter esté cerca del hígado. El tampón de sangre y perfusión se agota inmediatamente.
  11. Apriete la abrazadera y coloque un tubo para la recolección del efluente de perfusión. Asegure todos los tubos con cinta impermeable (cinta adhesiva lisa o similar).
  12. Utilice un adaptador de pinza vascular para colocar una pinza vascular a través de la vena cava infrahepática inmediatamente por encima de la vena renal derecha para evitar la mezcla (Figura 2).
  13. Aumente el caudal de perfusión a 3,5 ml/min y ponga en marcha un temporizador. Inicie el registro de presión. La perfusión exitosa generalmente resulta en una presión de ~ 10 mm / Hg.
  14. Cubra el hígado con un paño estéril humedecido con solución salina y agregue solución salina durante el experimento para evitar que se seque.
  15. Recoja el efluente de perfusión durante 1 minuto y mida el volumen. El volumen debe ser de aproximadamente 3,5 ml/min. No se espera una mezcla de sangre en esta etapa, y el corazón ya no bombea.
  16. Espere un período de equilibrio de 30 minutos antes de comenzar el experimento.

figure-protocol-1
Figura 1: Ilustración de la configuración de perfusión . (A)La mesa de operaciones se eleva sobre un soporte de trípode y se calienta a 37 °C. El tampón de perfusión se gasifica (95%O2, 5% CO2), se bombea a través de una bomba de rodillos peristálticos y se calienta en el intercambiador de calor con una trampa de burbujas incorporada. Además, el sistema consta de un manómetro y una bomba de husillo para ajustar la presión de perfusión. La presión de perfusión se registra y visualiza continuamente a través de un transductor en un PC, un programa de registro de presión. (B) El recuadro rojo captura las conexiones de las llaves de paso de tres vías. La primera llave de paso de tres vías está abierta para la infusión de un compuesto de prueba a través de una bomba de jeringa, y la segunda está cerrada. El tercero está abierto para mediciones continuas de presión. La cuarta llave de paso se puede utilizar para recoger muestras de entrada, por ejemplo, análisis de gases en el hígado perfundido. Los conectores se pueden modificar según sea necesario para experimentos específicos que requieren más o menos líneas de infusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Fotos de la cavidad abdominal del ratón antes y durante la perfusión hepática. (A)El punto verde indica la ubicación de la punta del catéter de la vena porta. Es importante que la punta del catéter se coloque justo debajo del punto de ramificación de la vena porta en las venas portas hepáticas izquierda y derecha, pero por encima de la rama pancreato-duodenal para evitar fugas. El punto amarillo indica la ubicación correcta de la pinza del vaso en la vena cava inferior infrahepática entre la vena renal derecha y el hígado para evitar el reflujo de sangre hacia el hígado perfundido. (B, C) Hígado de ratón perfundido con los dos catéteres insertados en la vena porta (B) y la vena cava inferior suprahepática (C) y la pinza del vaso en la vena cava inferior infrahepática (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Experimenta

  1. Comience el experimento recolectando las primeras muestras de referencia utilizando un colector de fracciones al final del período de equilibrio. Recoja las muestras en el intervalo de tiempo deseado y colóquelas en hielo inmediatamente.
  2. Revise la trampa de burbujas con regularidad y rellénela con tampón de perfusión cuando esté cerca de vaciarse.
  3. Recoger una muestra del tampón a través de una llave de paso de tres vías inmediatamente antes de que entre en el órgano y del catéter colector insertado en la vena cava inferior (después de que se haya perfundido a través del hígado).
  4. Mida las muestras con un analizador de gases en sangre para confirmar que el órgano es metabólicamente activo (indicado por un aumento de la presión parcial de CO2 y una disminución del pH).
  5. Repita los pasos 4.3-4.4 al final del experimento para evaluar la viabilidad a lo largo del experimento (Figura complementaria 2).
    NOTA: La disminución de la presión parcial de oxígeno no proporciona una medida confiable de la respiración debido a las pérdidas de oxígeno de los tubos, el órgano, etc.
  6. Después de 15 min de perfusión basal, iniciar la primera estimulación mediante la infusión de una sustancia problema a través de una llave de paso de tres vías al caudal deseado utilizando una bomba de jeringa (p. ej., concentración 20 veces mayor de la sustancia problema cuando se infunde a una velocidad de 0,175 ml/min a través de una bomba de brazo lateral). Alternativamente, cambiar el tampón de referencia por un nuevo tampón (oxigenado y calentado) que contenga el compuesto problema en la concentración final.
  7. Detenga la estimulación y recoja muestras de referencia durante 20-30 minutos antes de comenzar la segunda estimulación.
  8. Al final del experimento, infundir un control positivo apropiado durante 5-10 min.
  9. Después del experimento, extirpe el hígado perfundido y péselo para normalizar la salida al peso del hígado. Congele el hígado en nitrógeno líquido para la medición potencial del contenido de proteínas para normalizar la producción al contenido de proteínas.

5. Mediciones bioquímicas

  1. Cuantificar la concentración de la molécula de interés mediante ensayos apropiados para mediciones en tampón de perfusión (ensayos colorimétricos o ELISA internos o disponibles comercialmente). El tampón es compatible con la mayoría de las técnicas basadas en ómicas, como la metabolómica y la proteómica.
    NOTA: En este estudio, la urea se midió con base en un ensayo colorimétrico descrito anteriormente14. La glucosa y los ácidos grasos no esterificados se cuantificaron utilizando kits disponibles en el mercado.

6. Análisis de datos

  1. Presente los datos en gráficos XY que muestren la salida secretora a lo largo del tiempo.
    NOTA: Una de las virtudes del sistema de perfusión in vitro es que es posible expresar los datos como la salida real (concentración × caudal, por ejemplo, μmol/min) en lugar de la concentración medida en la salida (mmol/L) como en los estudios in vivo . Considere la posibilidad de normalizar la producción del peso del hígado cuando se comparen diferentes modelos de ratón o del contenido total de proteínas (medido por BCA) cuando se comparen ratones de control con modelos de ratón con obesidad o enfermedades hepáticas en las que un aumento del peso del hígado puede deberse a un mayor contenido de grasa.
  2. Presentar los datos resumidos como puntos individuales por animal que representen la media o la producción total durante el inicio del estudio y durante un período de estimulación (normalmente de 15 a 30 minutos) o la producción incremental utilizando la línea de base anterior para cada período de estimulación, dependiendo del diseño del estudio.
  3. Analice los datos mediante una prueba t pareada (dos grupos) o ANOVA de un factor con estimulaciones repetidas (más de dos grupos) con una prueba post-hoc adecuada para pruebas múltiples.

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Resultados

Se requiere una línea de base estable para determinar si un estímulo o sustrato conduce a la liberación de la molécula de interés. La figura 3A muestra un ejemplo de un experimento exitoso. La producción de urea en el hígado perfundido se mide en intervalos de 2 minutos y se muestra como media ± SEM. Los períodos de referencia que preceden a cada uno de los dos períodos de estimulación son constantes. La producción media de urea durante los dos períodos de es...

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Discusión

El hígado de ratón aislado y perfundido es una herramienta de investigación sólida para el estudio de la dinámica y los mecanismos moleculares del metabolismo hepático. La posibilidad de recoger muestras minuto a minuto proporciona una evaluación detallada del efecto directo de un compuesto problema en el hígado. En comparación con los estudios in vivo, el hígado perfundido nos permite estudiar el metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y con un control...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses relevantes para este artículo.

Agradecimientos

Los estudios y Nicolai J. Wewer Albrechtsen fueron apoyados por la Beca de Excelencia para Investigadores Emergentes de la Fundación Novo Nordisk - Endocrinología y Metabolismo (Solicitud No. NNF19OC0055001), Premio al Futuro Líder de la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (NNF21SA0072746) y Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca, Sapere Aude (1052-00003B). El Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo financiero de la Fundación Novo Nordisk (acuerdo de subvención NNF14CC0001). La figura 1B se creó con biorender.com. Agradecemos al Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) por sus fructíferas discusiones sobre el hígado de ratón perfundido.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Llave de paso de 3 víasBD 394601
Altromin dieta de cría AltrominSpezialfutter1319
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2· 2H2O)Catéteres SigmaC8106
(0,7 mm)BD381812
Papel de filtro (tamaño de poro 2,0 µ m)MilliporeAP2029325
Kit de glucosaQuantiChromTMDIGL-100Protocolo de baja concentración
KetaminaMSD Salud Animal51148590 mg/kg
Ligadura (seda negra estéril)Agnthos14739
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma230391
Graso no esterificado kit de ácidosFujifilm Wako ChemicalsNEFA-HR(2)
Mesa de operaciones, calentada en soporte de trípode, tipo 873Harvard Bioscience, Inc.
Cloruro de potasio (KCl)SigmaP9541
Fosfato de dihidrógeno de potasio(KH2PO4)Merck1.04877
con cuatro canalesHarvard Bioscience, Inc.730100
Cinta eleganteMediq danmark4001910
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)SigmaS5761
Cloruro de sodio (NaCl)SigmaS1679
Circulador termostáticoHarvard Bioscience, Inc.730125Volumen del baño 3 L, 230 V/50 Hz
TuboTygonE3603Diámetro interior 1,59 mm, diámetro exterior 3,18 mm
Sistema de perfusión universalHarvard Bioscience, Inc.732316Unidad básica uniper UP-100, tipo 834
VaminFresenius KabiB05ABA01Aminoácidos mixtos
Adaptador de abrazadera para vasosDeutsche BiomedicalDBC1002
Abrazaderas para vasosDeutsche BiomedicalDBC1005
WindkesselHarvard Bioscience, Inc.
XilacinaRompun Vet 53070110 mg/kg
733776Bomba de rodillo , 732068

Referencias

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  3. Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330(2022).
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