Aquí, presentamos un método robusto para la perfusión in situ del hígado de ratón para estudiar la regulación aguda y directa del metabolismo hepático sin alterar la arquitectura hepática pero en ausencia de factores extrahepáticos.
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Artículo de método
Producción hepática de glucosa, ureagénesis y lipólisis cuantificadas mediante el modelo de hígado de ratón perfundido
En este artículo
Resumen
Resumen
El hígado tiene numerosas funciones, incluido el metabolismo de los nutrientes. A diferencia de otros modelos in vitro e in vivo de investigación hepática, el hígado perfundido aislado permite el estudio de la biología hepática y el metabolismo en todo el hígado con una arquitectura hepática intacta, separada de la influencia de factores extrahepáticos. Las perfusiones hepáticas se desarrollaron originalmente para ratas, pero el método también se ha adaptado a ratones. Aquí describimos un protocolo para la perfusión in situ del hígado de ratón. El hígado se perfunde antegrágradamente a través de la vena porta con tampón bicarbonato Krebs-Henseleit oxigenado, y la salida se recoge de la vena cava inferior suprahepática con pinzamiento de la vena cava inferior infrahepática para cerrar el circuito. Con este método, los efectos hepáticos directos de un compuesto problema pueden evaluarse con una resolución temporal detallada. La función hepática y la viabilidad son estables durante al menos 3 h, lo que permite la inclusión de controles internos en el mismo experimento. Las posibilidades experimentales que utilizan este modelo son numerosas y pueden inferir información sobre la fisiología hepática y las enfermedades hepáticas.
Introducción
El hígado es un órgano esencial en el metabolismo. Desempeña un papel clave en el control del equilibrio energético de todo el cuerpo mediante la regulación del metabolismo de la glucosa, los lípidos y los aminoácidos. El aumento de las enfermedades hepáticas en todo el mundo se está convirtiendo en una importante carga para la salud mundial, y se necesita más conocimiento sobre la fisiopatología y sus consecuencias para las funciones hepáticas.
Se han desarrollado varios modelos in vitro para la investigación en el hígado como complemento de los estudios in vivo. Los hepatocitos primarios aislados y cultivados de roedores....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentos con Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca (permiso 2018-15-0201-01397) y el comité de ética local de acuerdo con la directiva de la UE 2010/63/UE, los Institutos Nacionales de Salud (publicación n.º 85-3) y siguiendo las directrices de la legislación danesa que rige la experimentación con animales (1987). Se trata de un procedimiento terminal, y la causa de la muerte es la exanguinación y perforación del diafragma bajo anestesia profunda.
1. Animales de experimentación
- Obtenga ....
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Resultados
Se requiere una línea de base estable para determinar si un estímulo o sustrato conduce a la liberación de la molécula de interés. La figura 3A muestra un ejemplo de un experimento exitoso. La producción de urea en el hígado perfundido se mide en intervalos de 2 minutos y se muestra como media ± SEM. Los períodos de referencia que preceden a cada uno de los dos períodos de estimulación son constantes. La producción media de urea durante los dos períodos de es.......
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Discusión
El hígado de ratón aislado y perfundido es una herramienta de investigación sólida para el estudio de la dinámica y los mecanismos moleculares del metabolismo hepático. La posibilidad de recoger muestras minuto a minuto proporciona una evaluación detallada del efecto directo de un compuesto problema en el hígado. En comparación con los estudios in vivo, el hígado perfundido nos permite estudiar el metabolismo hepático de forma aislada, evitando factores extrahepáticos transportados por la sangre y con un control.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses relevantes para este artículo.
Agradecimientos
Los estudios y Nicolai J. Wewer Albrechtsen fueron apoyados por la Beca de Excelencia para Investigadores Emergentes de la Fundación Novo Nordisk - Endocrinología y Metabolismo (Solicitud No. NNF19OC0055001), Premio al Futuro Líder de la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (NNF21SA0072746) y Fondo de Investigación Independiente de Dinamarca, Sapere Aude (1052-00003B). El Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo financiero de la Fundación Novo Nordisk (acuerdo de subvención NNF14CC0001). La figura 1B se creó con biorender.com. Agradecemos al Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) por sus fructíferas discusiones so....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Llave de paso de 3 vías | BD 394601 | ||
| Altromin dieta de cría Altromin | Spezialfutter | 1319 | |
| Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2· 2H2O) | Catéteres Sigma | C8106 | |
| (0,7 mm) | BD | 381812 | |
| Papel de filtro (tamaño de poro 2,0 µ m) | Millipore | AP2029325 | |
| Kit de glucosa | QuantiChromTM | DIGL-100 | Protocolo de baja concentración |
| Ketamina | MSD Salud Animal | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligadura (seda negra estéril) | Agnthos | 14739 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Graso no esterificado kit de ácidos | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Mesa de operaciones, calentada en soporte de trípode, tipo 873 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Fosfato de dihidrógeno de potasio(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| con cuatro canales | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Cinta elegante | Mediq danmark | 4001910 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Circulador termostático | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Volumen del baño 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubo | Tygon | E3603 | Diámetro interior 1,59 mm, diámetro exterior 3,18 mm |
| Sistema de perfusión universal | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Unidad básica uniper UP-100, tipo 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Aminoácidos mixtos |
| Adaptador de abrazadera para vasos | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Abrazaderas para vasos | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Xilacina | Rompun Vet 530701 | 10 mg/kg |
Referencias
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329(2016).
- Lauschke, V. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
