Consideraciones prácticas para el diseño, la ejecución y la interpretación de estudios que involucran ensayos de flexión de huesos enteros de huesos de roedores

Las pruebas mecánicas del hueso son el método principal para extraer información funcional relacionada con la susceptibilidad de un hueso a las fracturas. En los estudios preclínicos, se pueden utilizar varias modalidades de prueba, pero la más común es, con mucho, la flexión de los huesos largos. Estas pruebas son fáciles de realizar y se pueden usar en huesos que varían en tamaño desde humanos hasta ratones. Dado que los ratones son uno de los animales más estudiados en la investigación preclínica, este protocolo se centrará en las pruebas de flexión realizadas en el fémur y las tibias de los ratones.

Antes de realizar las pruebas de flexión, los huesos deben cosecharse y almacenarse adecuadamente. Los métodos de almacenamiento más comunes han sido tradicionalmente la congelación de huesos en gasas empapadas en solución salina, la congelación en solución salina sola o la deshidratación de huesos en etanol ¹. Se ha demostrado que los huesos almacenados en etanol tienen una mayor rigidez y módulo elástico y una disminución de los parámetros de deformación en comparación con los almacenados congelados¹. Incluso la rehidratación de los huesos antes de la prueba no recupera estas propiedades a niveles normales ¹. Almacenar sumergido en solución salina podría causar daño al hueso, ya que se ejerce presión a medida que la solución salina se expande. Además, se requeriría una descongelación completa de la solución para extraer los huesos para la exploración por microtomografía computarizada (μCT). En consecuencia, congelar los huesos recién cosechados en una gasa empapada en solución salina se ha convertido en el método de almacenamiento estándar y se recomienda a lo largo de este protocolo.

Debido a que el tamaño y la forma de un hueso afectan su fuerza de volumen y muchos modelos de enfermedades alteran significativamente el tamaño y la morfología del hueso, los principios de ingeniería se utilizan para normalizar los efectos del tamaño para producir propiedades que estimen el comportamiento^{del tejido}. Este enfoque requiere una geometría de sección transversal de la ubicación de la falla, que se adquiere más comúnmente utilizando μCT para crear escaneos de los huesos antes de la prueba. μCT es ampliamente utilizado debido a su disponibilidad y alta resolución de imagen. Además, no se incluyen las contribuciones de tejidos blandos y la exploración no requiere fijación química u otras modificaciones en el hueso ^3,4. En todas las formas de TC, una fuente de rayos X se enfoca en un objeto, mientras que un detector en el otro lado del objeto mide la energía de rayos X resultante. Esto produce una sombra de rayos X de la muestra que se puede convertir en una imagen ^3,5. El objeto que se está escaneando se gira (o la fuente de rayos X y el detector se giran alrededor de la muestra), generando imágenes que se pueden reconstruir en un conjunto de datos tridimensionales que representa el objeto⁵.

La resolución de escaneo, es decir, la proximidad entre sí que pueden estar dos objetos y resolverse individualmente, se controla cambiando el tamaño nominal del vóxel o el tamaño de un píxel en la imagen resultante. En general, se acepta que los objetos deben tener al menos dos veces el tamaño de un solo vóxel para ser identificados³, pero una relación más alta permitirá una mayor precisión. Además, los vóxeles más grandes son más propensos a efectos de volumen parcial: cuando un solo vóxel contiene tejidos de diferentes densidades, se le asigna el promedio de estas densidades, en lugar de la densidad específica de un solo tejido, lo que puede conducir a una sobreestimación o subestimación de las áreas de tejido y la densidad mineral³. Si bien estos problemas se pueden mitigar eligiendo tamaños de vóxel más pequeños, el uso de una resolución más alta no garantiza la eliminación de los efectos de volumen parcial y puede requerir tiempos de escaneo más largos³. Cuando se escanean huesos ex vivo, generalmente se recomienda un tamaño de vóxel de 6-10 μm para evaluar con precisión la arquitectura trabecular de los huesos de ratón. Se puede usar un tamaño de vóxel más grande de 10-17 μm para el hueso cortical, aunque se debe usar el tamaño de vóxel razonable más pequeño. Este protocolo utiliza un tamaño de vóxel de 10 μm, que es lo suficientemente pequeño como para diferenciar las propiedades trabeculares clave y minimizar los efectos de volumen parcial sin un tiempo de escaneo extenso.

La energía de rayos X y los ajustes del filtro de energía también deben seleccionarse cuidadosamente, ya que la alta densidad mineral y el grosor del tejido óseo atenúan y alteran en gran medida el espectro de energía de rayos X transmitido. En general, se asume que debido a que el espectro de rayos X emitido es equivalente al espectro que sale del objeto⁶, el uso de rayos X de baja energía en objetos densos como el hueso puede conducir a un artefacto conocido como endurecimiento del haz⁷. Se recomienda un voltaje más alto de 50-70 kVp cuando se escanean muestras óseas para reducir la incidencia de estos artefactos⁵. Además, la inserción de un filtro de energía de aluminio o cobre crea un haz de energía más concentrado, lo que minimiza aún más los artefactos ^4,7. Se utilizará un filtro de aluminio de 0,5 mm a lo largo de este protocolo.

Por último, el paso de rotación del escaneo y la longitud de rotación (por ejemplo, 180°-360°), controlan juntos el número de imágenes capturadas, lo que determina la cantidad de ruido en el escaneo final⁴. Promediar varios fotogramas en cada paso puede reducir el ruido, pero puede aumentar el tiempo de exploración⁴. Este protocolo utiliza un paso de rotación de 0,7 grados y un promedio de fotogramas de 2.

Una nota final sobre el escaneo: los maniquíes de calibración de hidroxiapatita deben escanearse utilizando la misma configuración de escaneo que los huesos experimentales para permitir la conversión de los coeficientes de atenuación a densidad mineral en g/cm³⁵. Este protocolo utiliza maniquíes de 0,25 g/cm3 y 0,75 g^{/cm3 de} hidroxiapatita, aunque existen diferentes maniquíes disponibles. Tenga en cuenta que algunos sistemas de escaneo utilizan maniquíes internos como parte de la calibración diaria del sistema.

Una vez que se completa el escaneo, las proyecciones angulares se reconstruyen en imágenes transversales del objeto, generalmente utilizando el software adjunto del fabricante. Cualquiera que sea el sistema que se utilice, es importante asegurarse de que todo el hueso se capture en la reconstrucción y que el umbral se establezca adecuadamente para permitir el reconocimiento del hueso frente al no hueso. Después de la reconstrucción, es fundamental rotar todas las exploraciones en tres dimensiones para que los huesos estén orientados de manera consistente y correctamente alineados con el eje transversal, nuevamente utilizando el software del fabricante.

Después de la rotación, se pueden seleccionar regiones de interés (ROI) para el análisis en función de si se desean propiedades corticales, propiedades trabeculares o geometría de fractura para la normalización mecánica. Para este último, los ROI deben seleccionarse después de la prueba midiendo la distancia desde el sitio de la fractura hasta un extremo del hueso y utilizando el tamaño del vóxel para determinar la ubicación de corte correspondiente en el archivo de escaneo. La región seleccionada debe tener al menos 100 μm de longitud, con el punto de fractura en el centro aproximado de la ROI, para proporcionar una estimación adecuada⁴.

Con los ROI seleccionados, se necesitan dos propiedades para la normalización mecánica (para calcular la tensión de flexión y la deformación): la distancia máxima desde el eje de flexión del neutro hasta la superficie donde se inicia la falla (se supone que es la superficie cargada en tensión, determinada por la configuración de la prueba) y el momento de inercia del área alrededor del eje neutro (también depende de la configuración de la prueba). Este protocolo recomienda el uso de un código personalizado para determinar estos valores. Para acceder al código, póngase en contacto directamente con el autor correspondiente o visite el sitio web del laboratorio en https://bbml.et.iupui.edu/ para obtener más información.

Una vez que se ha completado el escaneo μCT, pueden comenzar las pruebas mecánicas. Las pruebas de flexión se pueden realizar en configuraciones de cuatro o tres puntos. Se prefieren las pruebas de flexión de cuatro puntos, ya que eliminan la tensión de cizallamiento en el hueso entre los puntos de carga, lo que permite que se produzca una flexión pura en esta región³. El hueso se fracturará debido a la tensión, creando una falla que es más representativa de las verdaderas propiedades de flexión del hueso³. Sin embargo, el hueso debe cargarse de tal manera que entregue la misma carga en ambos puntos de carga (esto se puede facilitar con un cabezal de carga pivotante). En las pruebas de flexión de tres puntos, hay un gran cambio en la tensión de cizallamiento donde el punto de carga se encuentra con el hueso, lo que hace que el hueso se rompa en este punto debido al cizallamiento, no a la tensión³. Las normas ASTM recomiendan que los materiales que se someten a flexión deben tener una relación longitud-anchura de 16:1, lo que significa que la longitud del tramo de soporte debe ser 16 veces mayor que la anchura del hueso para minimizar los impactos del cizallamiento ^8,9. Esto a menudo es imposible de lograr cuando se prueban huesos pequeños de roedores, por lo que el tramo de carga simplemente se hace lo más grande posible, pero con un cambio lo más pequeño posible en la forma de la sección transversal. Además, al realizar la flexión de cuatro puntos, la relación entre las longitudes del tramo inferior y superior debe ser de ~ 3: 1⁸, lo que generalmente se puede lograr en la tibia, pero es difícil en el fémur más corto. Además, las paredes corticales más delgadas de los fémures los hacen susceptibles a la deformación de tipo anillo que cambia la forma de la sección transversal del hueso durante la prueba (esto se puede acentuar en las pruebas de cuatro puntos, ya que se requiere una mayor fuerza para inducir el mismo momento de flexión en comparación con la flexión de tres puntos). Por lo tanto, la flexión de tres puntos se utilizará para el fémur de ratón, mientras que la flexión de cuatro puntos se utilizará para las tibias a lo largo de este protocolo.

Por último, es importante potenciar adecuadamente el estudio para el análisis estadístico. Una recomendación general para los ensayos mecánicos es tener un tamaño de muestra de 10-12 huesos por grupo experimental para poder detectar diferencias, ya que algunas propiedades mecánicas, especialmente los parámetros postrendimiento, pueden ser muy variables. En algunos casos, esto puede significar comenzar con un tamaño de muestra animal más alto debido al desgaste que podría ocurrir durante el estudio. El análisis del tamaño de la muestra utilizando los datos existentes debe completarse antes de intentar un estudio.

Existen numerosas limitaciones y suposiciones, pero las pruebas de flexión pueden proporcionar resultados bastante precisos, especialmente cuando las diferencias relativas entre los grupos son de interés. Estas propiedades, junto con el análisis de la arquitectura trabecular y la morfología cortical, pueden proporcionar una mejor comprensión de los estados de la enfermedad y los regímenes de tratamiento. Si se tiene cuidado con los aspectos del experimento que están bajo nuestro control (por ejemplo, la recolección, el almacenamiento, el escaneo y las pruebas), podemos estar seguros de que se han generado resultados precisos.

Todos los procedimientos descritos a lo largo de este protocolo que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Uso y Animales (IACUC) de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Indiana antes del procedimiento. Los animales descritos en el procedimiento fueron sacrificados por inhalación de CO₂seguida de luxación cervical como medio secundario de eutanasia.

1. Recolección, almacenamiento y descongelación de huesos

1. Cosecha y almacenamiento
   1. Coloque el ratón con la ventral hacia arriba. Use un bisturí (o una hoja de afeitar o tijeras) para hacer una incisión en la unión aproximada del fémur y la pelvis en un lado.
   2. Continúe la incisión inicial dorsalmente hasta que se localice la articulación de la cadera; Busca la cabeza femoral que aparece como una pequeña esfera blanca unida a la pelvis.
   3. Aplique presión con el borde de un bisturí en el borde proximal de la cabeza femoral hasta que la cabeza femoral se salga de la cavidad. Extirpe tejido adicional para liberar la extremidad posterior del resto de la canal.
   4. Con la extremidad posterior aislada, separe la tibia y el fémur induciendo la flexión en la articulación de la rodilla. Mueva el bisturí en la dirección medial-lateral en la superficie anterior de la rodilla para cortar cualquier tejido adyacente, incluidos los ligamentos entre los huesos.
   5. Si esto no separa los huesos, extienda la articulación de la rodilla para permitir el acceso a la superficie posterior. Tenga cuidado de evitar cortar el hueso o raspar el cartílago articular.
   6. Una vez que el fémur y la tibia estén separados, retire el retropié de la tibia flexionando la articulación y usando un movimiento de aserrado medial-lateral en la superficie posterior de la articulación. Si es necesario, extienda la articulación para exponer la superficie anterior. Tenga cuidado de no cortar el hueso.
   7. Una vez aislados, limpie los huesos de todos los tejidos blandos adherentes. Si realiza pruebas de flexión de cuatro puntos en la tibia, retire también el peroné. El peroné está conectado por ligamentos en el extremo proximal, pero está fusionado a la tibia cerca del extremo distal del hueso. Use unas tijeras afiladas cerca del punto de conexión para separar el peroné.
   8. Envuelva los huesos aislados y limpios por separado en una gasa empapada en solución salina y guárdelos a -20 °C. Haga esto inmediatamente después de la cosecha.
   9. Repita los pasos 1.1.1 a 1.1.8 para el otro lado de la canal.
      NOTA: Si hay resistencia al tratar de separar los huesos en los pasos 1.1.4-1.1.6, es mejor repetir los pasos en lugar de tratar de separar los huesos. Los movimientos enérgicos pueden provocar daños o fracturas en los huesos.
2. Descongelación
   NOTA: El número de ciclos de congelación-descongelación a los que se somete un hueso debe minimizarse, ya que los ciclos de congelación-descongelación excesivos pueden afectar negativamente las propiedades mecánicas del hueso. La descongelación parcial para la exploración con μCT se puede lograr dejando el hueso a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Solo descongele completamente el hueso cuando realice pruebas de flexión como se describe a continuación.
   1. Preferiblemente descongelar durante la noche
      1. Mueva los huesos de -20 °C de almacenamiento a 1-4 °C en una cámara frigorífica o refrigerador. Asegúrese de que los huesos permanezcan allí durante 8-12 h para que se descongelen por completo antes de la prueba.
   2. Descongelación rápida
      1. Ajuste la temperatura de la bañera a aproximadamente 37 °C. Una vez a esta temperatura, añadimos los huesos al baño.
      2. Dejar los huesos en la bañera durante aproximadamente 1 h.

2. Escaneo μCT

1. Envuelva los huesos en parafilm antes de escanearlos para mantener la hidratación. Mantenga todos los demás huesos en hielo mientras espera a ser escaneados.
2. Una vez envuelto en parafilm, coloque el hueso en un soporte para interactuar con el escáner. Asegúrese de que todos los huesos escaneados estén alineados en la misma orientación, ya que una alineación coherente simplificará la rotación más adelante en el análisis.
3. Ajuste la configuración de escaneo de acuerdo con la aplicación del escaneo. Se recomiendan los siguientes ajustes generales de escaneo para los huesos del ratón: resolución/tamaño de vóxel: 10 μm; tamaño de píxel: medio, 2000 x 1048; filtro: aluminio de 0,5 mm; paso de rotación: 0,7; Promedio de fotogramas: 2.
   NOTA: Estos ajustes pueden diferir según el sistema utilizado para escanear, y se debe consultar el manual del fabricante y del usuario según sea necesario.
4. Una vez que la fuente de rayos X esté encendida, realice una corrección de campo plano para minimizar los artefactos. Para hacer esto, primero, asegúrese de que la cámara esté vacía y apague el campo plano.
5. Mide la intensidad media del campo y ajústala al 60%. Una vez al 60%, actualice el campo plano y vuelva a encenderlo.
6. Asegúrese de que la intensidad media sea ahora (86-88%).
   NOTA: Este proceso puede variar según el sistema μCT utilizado. Consulte el manual del usuario antes de intentar el proceso.
7. Una vez que la corrección de campo plano se haya realizado con éxito, coloque el soporte en la cámara. Asegúrese de que las muestras estén centradas y niveladas antes de colocar el pedestal en la cámara.
8. Una vez que el pedestal esté asegurado, cierre la cámara, asegúrese de que todo el hueso sea capturado en la exploración (puede ser necesaria una vista de exploración) e inicie la exploración.
9. Después de la exploración, vuelva a almacenar los huesos en una gasa empapada en solución salina a -20 °C.

3. Reconstrucción con μCT

1. Seleccione un ROI que capture todo el hueso en la reconstrucción. Para ello, vea la sección transversal más grande del hueso y dimensione el ROI en función de esta sección transversal.
2. Establezca el umbral del software para permitir el reconocimiento adecuado del hueso en comparación con el no hueso. Para ello, utilice un histograma en el que se establezca una restricción inferior en 0 y la restricción superior se establezca al final de los datos del histograma máximo.
3. Ajuste la configuración adicional, incluida la reducción del artefacto anular y el endurecimiento del haz al 5 y al 20 %, respectivamente. Compruebe que la compensación de desalineación esté dentro del rango de -7 a 7. Estos valores pueden variar según el software. Asegúrese de verificarlos con el manual del usuario y las instrucciones del fabricante antes de comenzar la reconstrucción.
   NOTA: Los artefactos se pueden minimizar durante la reconstrucción mediante correcciones para el endurecimiento de la viga, los artefactos del anillo y la compensación de desalineación. La compensación de desalineación puede actuar como un indicador de la calidad del escaneo y, si está fuera de un rango especificado por el fabricante, se debe repetir el escaneo. Sin embargo, la configuración de la reconstrucción dependerá del software y se debe consultar el manual del usuario.

4. Rotación de μCT

NOTA: Una vez reconstruidas, las exploraciones deben rotarse para establecer una orientación uniforme en todos los huesos y para garantizar que las secciones transversales del hueso resultante se tomen normales al eje longitudinal con el menor ángulo de desplazamiento posible. Esto debe hacerse con el software de elección del usuario.

1. Rotación del fémur
   1. Rotar el fémur para que todos los huesos tengan la misma orientación longitudinal. Por ejemplo, oriente todos los huesos con el extremo proximal del hueso en la parte superior de la exploración.
   2. Gire el hueso de modo que la orientación de la sección transversal de todos los huesos sea la misma. Por ejemplo, gire los huesos para que la cara anterior esté siempre en el lado derecho de las exploraciones.
   3. Una vez realizados estos ajustes, enderece el escaneo para asegurarse de que se mantiene la simetría alrededor del eje central.
   4. Guarde el conjunto de datos girado.
2. Rotación de tibia
   1. Repita los pasos 4.1.1-4.1.4 para la tibia.

5. Procedimiento de ensayo mecánico

1. Preparación
   1. Antes de realizar las pruebas mecánicas, asegúrese de que se haya obtenido y reconstruido un escaneo μCT con una resolución de 6-10 μm para verificar que se haya adquirido un escaneo de calidad para cada muestra para calcular la geometría de la sección transversal en el sitio de la fractura (secciones 2-3).
   2. Una vez obtenidos y verificados los escáneres, descongele todos los huesos antes de realizar la prueba (sección 1). Pruebe todos los huesos de un experimento en el mismo día y aleatorice el orden de las pruebas para minimizar el sesgo del usuario y la variabilidad del sistema entre muestras y grupos experimentales. Asegúrese de que los huesos permanezcan hidratados durante todo el proceso de prueba.
2. Configuración del aparato
   1. Localice una célula de carga con la sensibilidad y capacidad adecuadas para la muestra. Considere el rango de falla esperado para la muestra y elija una celda de carga con aproximadamente un 50% más de capacidad mientras maximiza la sensibilidad (por ejemplo, una celda de carga de 10 lbf con una capacidad de 45 N para un hueso de ratón en el rango de falla de 0-25 N).
   2. Ubique los accesorios de carga y soporte del tramo.
   3. Instale la celda de carga y los accesorios como se muestra en la Figura 1, atornillando la celda de carga en el soporte superior o inferior del probador, el accesorio de carga superior en la celda de carga y el accesorio inferior en el soporte inferior del probador. Asegure un ajuste seguro.
      NOTA: Por lo general, se recomienda la fijación de la célula de carga al accesorio superior cuando se realizan pruebas de flexión para evitar el contacto del fluido con la célula de carga, pero se puede utilizar la parte inferior si es necesario.
   4. Una vez que la célula de carga y los accesorios estén instalados, seleccione una longitud de tramo de soporte y asegúrese de que permanezca constante para todas las muestras que se están probando. Para elegir una distancia de tramo de apoyo, primero ubique el hueso más corto del conjunto de muestras.
   5. Oriente el hueso entre los accesorios como se muestra en la Figura 2.
   6. Para doblar el fémur en tres puntos, siga la Figura 2A. Asegúrese de que la superficie anterior del hueso esté contra el tramo de soporte y que la región del tramo esté dentro de la diáfisis de la muestra. Evite incluir el tercer trocánter en el extremo proximal y el punto de transición donde el hueso se ensancha en la metáfisis y los cóndilos en el extremo distal.
   7. Para el doblado de cuatro puntos, asegúrese de que los tramos de soporte y carga estén alineados y centrados entre sí. Siga la Figura 2B para cargar el hueso en los accesorios.
      1. Establezca las longitudes de los vanos de apoyo y carga para que sigan una relación de 3:1 8 (por ejemplo, 9 mm de vano de apoyo y 3 mm de vano^de carga).
      2. En el caso de una tibia, cargue la superficie medial del hueso contra el tramo de soporte con un soporte en la unión tibia/peroné. Es probable que el otro soporte se coloque justo después de la cresta tibial. Asegúrese de que el tramo de carga, centrado dentro del tramo de soporte, contenga una región uniforme del hueso.
   8. Mida la distancia del tramo de apoyo si realiza un doblado de tres puntos y las distancias del tramo de carga y del soporte si realiza un doblado de 4 puntos y registre estas distancias. Asegúrese de que este valor se registre desde el centro de los puntos de carga tanto para las mediciones de carga como para las de apoyo.
   9. Vuelva a colocar el hueso en solución salina o rehidrátelo con un bolo de solución salina.
      NOTA: Al seleccionar puntos para un tramo de carga, se recomienda utilizar puntos circulares (un radio de 0,75 mm es suficiente, ya que distribuye la carga al mismo tiempo que hace contacto con el hueso en la tangente del círculo). Si bien la teoría recomienda un filo de cuchillo para representar una carga puntual, esto aplastará el hueso en el punto de aplicación de la carga, lo que llevará a sobreestimaciones de la deformación y subestimaciones del módulo.
   10. Asegúrese de que todas las partes del accesorio estén apretadas y libres de movimiento.
3. Configuración del software
   1. Asegúrese de que el probador esté conectado correctamente a la computadora a través de la caja del módulo, los canales de la celda de carga y cualquier otro requisito según el manual del sistema.
   2. En el software asociado con el probador mecánico, cree un perfil de prueba de flexión con una rampa que tenga una velocidad de desplazamiento que sea lo suficientemente lenta como para no inducir efectos viscoelásticos (a menudo se usa 0.025 mm/s ) para cargar el hueso hasta la falla.
   3. También se recomienda una frecuencia de muestreo mínima de 25 Hz al crear un perfil de prueba, aunque se prefiere una frecuencia de muestreo más alta.
   4. Cree una carpeta por grupo de estudio y guarde cada prueba como un archivo individual dentro de esa carpeta.
4. Carga y prueba de muestras
   1. Seleccione un hueso correctamente descongelado (consulte el paso 1.2). Mida y registre su longitud completa con calibradores.
   2. Cargue la muestra en los accesorios como se muestra en la Figura 2A si prueba un fémur en flexión de tres puntos y en la Figura 2B si prueba una tibia en flexión de cuatro puntos.
   3. Cambie el nombre del archivo para reflejar la muestra que se está probando.
   4. Ponga a cero la carga (no el desplazamiento). Encienda el motor del sistema; Asegúrese de que no esté en control de carga o desplazamiento.
   5. Con precaución, aplique una precarga mínima al hueso para asegurar su posición y ayudar a evitar que el hueso ruede, pero asegúrese de que no comprometa la muestra. Apunte a una precarga de aproximadamente 0,25 N. Asegúrese de mantener la orientación ósea deseada antes de continuar.
   6. Hidrata la muestra rociándola generosamente con solución salina.
   7. Comience la prueba de flexión seleccionando Iniciar o Ejecutar en el software. CRÍTICO: Observe cuidadosamente la muestra durante la totalidad de la prueba y anote las pruebas en las que ocurrió algún problema (p. ej., rodadura, deslizamiento).
      NOTA: Estos problemas podrían comprometer los datos y será útil consultar notas sobre estas pruebas durante el análisis.
   8. Esté atento a que el hueso comience a fracturarse (en el lado de la tracción). La mayoría de las pruebas continuarán hasta que se produzca un error. En este punto, la prueba terminará a través de sus límites programados. Si se produce un fallo pero el comprobador continúa desplazándose, detenga manualmente la prueba para evitar daños en la célula de carga.
   9. Una vez completada la prueba, mida la longitud desde el extremo distal hasta el punto de rotura con calibradores y regístrela.
   10. Repita los pasos 5.4.1 a 5.4.9 para cada muestra.

Figura 1: Configuración del probador mecánico. (A) Ensayos de flexión de tres puntos y (B) de cuatro puntos. La célula de carga se muestra en amarillo, los accesorios de carga se muestran en azul y los accesorios de soporte se muestran en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Orientación de los huesos entre los accesorios . (A) Orientación adecuada de un fémur en dispositivos de carga de flexión de tres puntos que muestran (de arriba a abajo) vistas desde el lado medial, anterior y posterior del fémur cuando se colocan correctamente. Los accesorios de carga se muestran en naranja y los accesorios de soporte se muestran en azul. Los tramos inferiores deben ajustarse para incluir la mayor parte posible de la parte más recta de la diáfisis, y el accesorio superior debe estar centrado entre esos tramos. (B) Orientación adecuada de una tibia para la flexión de cuatro puntos que muestra (de arriba a abajo) vistas desde los lados anterior, lateral y medial de la tibia. El hueso debe cargarse de manera que la superficie medial entre en contacto con el accesorio inferior y la superficie lateral entre en contacto con el accesorio superior. La unión tibia-peroné debe colocarse justo fuera del tramo de carga. Los tramos deben ajustarse para cumplir mejor con una relación de tramo de carga a soporte de 1:3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Selección del ROI

1. Con las longitudes de corte registradas, cargue las imágenes giradas en el software de elección del usuario. Una vez cargadas las imágenes giradas, localice y registre las rebanadas superior e inferior del hueso.
2. Calcule la diferencia entre las rebanadas superior e inferior. Multiplique este valor por el tamaño del vóxel de escaneo para determinar la longitud total del hueso en micrómetros.
3. Para localizar la ubicación de la fractura en la tomografía computarizada, divida la longitud de rotura registrada (en micrómetros) por el tamaño del vóxel para obtener el número de cortes de μCT desde el extremo distal de la exploración hasta el punto de rotura.
4. Seleccione un ROI, centrado en esta ubicación. En primer lugar, establezca la longitud total deseada del ROI (al menos 100 μm). Encuentre el número de sectores que representa esta longitud dividiendo la longitud en micrómetros por el tamaño del vóxel para determinar el número total de sectores en el ROI.
5. Para obtener el límite inferior del ROI, divida el número total de segmentos de ROI por 2 y reste este valor de la ubicación de corte calculada anteriormente que se encuentra en el paso 6.4.
6. Agregue la longitud total del ROI en segmentos al valor calculado anteriormente para obtener el límite superior del ROI.
7. Seleccione el ROI adecuado, en función de los límites calculados, y guárdelo.

7. Normalización de los datos de fuerza y desplazamiento

NOTA: El probador mecánico solo generará puntos con coordenadas x e y (desplazamiento, fuerza). Estos puntos se pueden convertir en tensión y deformación utilizando las ecuaciones de tensión y deformación por flexión de Euler-Bernoulli, pero requieren propiedades geométricas obtenidas a partir de escaneos μCT. La cuantificación de estas propiedades se puede realizar con el software preferido por el usuario. Preferimos un código personalizado, que brinda un control completo sobre todas las entradas, cálculos y salidas. Como se mencionó anteriormente, para acceder al código, comuníquese directamente con el autor correspondiente o visite el sitio web del laboratorio en https://bbml.et.iupui.edu/ para obtener más información. A continuación se analizan las ecuaciones de tensión y deformación, así como las propiedades geométricas necesarias que deben obtenerse a partir de escaneos μCT, para calcularlas.

1. Ecuaciones de normalización de flexión de tres puntos
   1. La ecuación utilizada para calcular la tensión en la flexión de tres puntos se muestra a continuación en la Ecuación 1. En esta ecuación, "F" representa la fuerza y "L" representa la longitud del tramo de apoyo. Los valores de fuerza son registrados por el probador mecánico durante la prueba. Asegúrese de que la longitud del tramo de soporte se registre antes de la prueba. "c" e "I" son propiedades geométricas que se calcularán mediante escaneos μCT (sección 7.3).
      (1)
   2. La ecuación para calcular la deformación se muestra a continuación en la Ecuación 2; "c" y "L" representan las mismas propiedades para los cálculos de tensión y deformación. "d" significa los valores de desplazamiento registrados por el probador mecánico durante las pruebas.
      (2)
2. Ecuaciones de normalización de flexión de cuatro puntos
   1. La ecuación para la tensión en flexión de cuatro puntos se muestra a continuación en la Ecuación 3. "F" e "I" siguen siendo las mismas variables discutidas en el paso 7.1.1. Calcule "a" a partir de las medidas del soporte y la envergadura de carga antes de la prueba. Si se sigue la relación recomendada de 3:1 para el soporte y el tramo de carga para la flexión de cuatro puntos, "a" será un tercio de la longitud del tramo de apoyo.
      (3)
   2. La ecuación para la deformación en flexión de cuatro puntos se muestra a continuación en la Ecuación 4. "c" y "a" significan las mismas propiedades para los cálculos de tensión y deformación. "d" significa los valores de desplazamiento registrados por el probador mecánico durante las pruebas.
      (4)
3. Cálculo de propiedades geométricas a partir de escaneos μCT
   1. La variable "c" representa la distancia desde el eje neutro hasta la superficie del hueso que se cargó en tensión. En consecuencia, determine el centroide de cada sección transversal en los escaneos μCT, ya que el eje neutro pasa a través del centroide.
      1. Si se sigue la orientación de prueba de un fémur en flexión de tres puntos descrita en el paso 5.2.6, mida "c" con respecto a la superficie anterior.
      2. Si sigue la orientación de prueba de una tibia descrita en el paso 5.2.7, mida "c" con respecto a la superficie medial del hueso.
   2. La variable "I" representa el momento de inercia del área alrededor del eje de flexión (el eje medial-lateral para un fémur; el eje antero-posterior para una tibia). Calcule este valor usando la ecuación 5. En esta ecuación, "dA" es el área de cada píxel capturada en el escaneo μCT, mientras que y es la distancia calculada de cada píxel desde el eje neutro.
      (5)

8. Propiedades de interés de los ensayos mecánicos

1. Antes de calcular cualquier propiedad mecánica, genere una curva de fuerza-desplazamiento y una curva de tensión-deformación (las curvas ideales se muestran a continuación en la Figura 3, junto con las propiedades significativas).
   NOTA: El análisis de muestras biológicas no siempre genera curvas que se parezcan a estos ejemplos idealizados, pero siguen siendo una guía útil.
2. Examine estas curvas antes del análisis para detectar errores en las pruebas, como un hueso que se enrolla o se desliza. Estos errores suelen provocar protuberancias o regiones planas en la parte lineal inicial de la curva. En este punto, elimine el exceso de datos, incluidos los datos que puedan haberse recopilado antes de que el probador se pusiera en contacto con el hueso o los datos después de la falla.
3. Una vez que esté seguro de una prueba de calidad mediante las curvas trazadas, comience el análisis de las propiedades significativas.
   1. Rigidez y módulo elástico
      1. Calcule la rigidez utilizando solo la región elástica de la curva fuerza-desplazamiento. La pendiente de la curva en esta región es la rigidez.
      2. Calcule el módulo elástico utilizando la pendiente de solo la parte elástica de la curva tensión-deformación.
   2. Límite elástico
      NOTA: Hay dos puntos de fluencia, uno en la curva fuerza-desplazamiento y otro en la curva tensión-deformación. Los valores (x,y) para este punto de la curva fuerza-desplazamiento se conocen como desplazamiento a fluencia y fuerza de fluencia, mientras que los de la curva tensión-deformación se conocen como deformación a fluencia y tensión de fluencia. Estos puntos representan el final de la región elástica de la curva y se pueden encontrar de las formas que se enumeran a continuación.
      1. Método de la curva tensión-deformación: Calcule un desplazamiento de línea de (0,0) en una deformación del 0,2% (2.000 microdeformación) pero con la misma pendiente que el módulo elástico. Traza esta línea en el gráfico de tensión-deformación; La posición en la que esta línea intercepta la curva tensión-deformación se define como el límite elástico. Utilice esta coordenada de tensión de fluencia y deformación para encontrar los valores análogos de fuerza y desplazamiento; Estos valores representarán la fuerza de fluencia y el desplazamiento a los valores de fluencia.
      2. Método secante: Calcule la rigidez a partir de la curva fuerza-desplazamiento y reduzca la rigidez en un porcentaje elegido (5-10%). Traza una recta que comience en (0,0) con la pendiente de esta rigidez reducida y deja que se interseque con la curva fuerza-desplazamiento. El punto de intersección tendrá las coordenadas (desplazamiento a ceder, fuerza de cedencia).
         NOTA: El método secante se puede utilizar para encontrar el límite elástico sin datos de tensión-deformación.
   3. Fuerza máxima y tensión máxima
      1. Calcule la fuerza máxima y la tensión máxima encontrando el valor máximo en los conjuntos de datos respectivos.
   4. Propiedades de desplazamiento y deformación
      1. Valores de desplazamiento a fluencia y deformación a fluencia que representan el desplazamiento o deformación hasta el punto de fluencia. Para encontrarlos, localice el rendimiento como se describe en el paso 8.3.2.
      2. Los valores de desplazamiento total y deformación total representan el desplazamiento total o la deformación total que experimentó una muestra a lo largo de la prueba y corresponden al punto de falla.
      3. Desplazamiento posterior al rendimiento y deformación posterior al rendimiento: El desplazamiento posterior al rendimiento se informa comúnmente y se puede calcular restando el desplazamiento al rendimiento del desplazamiento total. Calcule la deformación posterior al rendimiento restando la deformación al rendimiento de la deformación total, pero informe esto con precaución, ya que la deformación se deriva primero bajo la suposición de que el material es linealmente elástico (prerendimiento). Esto hace que una medida posterior al rendimiento sea susceptible de ser invalidada.
   5. Propiedades energéticas
      1. Calcule la energía como el área bajo la curva fuerza-desplazamiento o la curva tensión-deformación.
      2. El área bajo la curva fuerza-desplazamiento se conoce como trabajo. El área calculada bajo la parte de la curva de pre-rendimiento, o la región elástica, se conoce como trabajo elástico o energía. El área calculada bajo la curva más allá del límite elástico, o la región plástica, se conoce como post-rendimiento o trabajo plástico, o pérdida de energía.
      3. El área total calculada bajo la curva de tensión-deformación se conoce como tenacidad o módulo de tenacidad, mientras que el área calculada bajo la curva de tensión-deformación hasta el límite elástico se conoce como resiliencia. La tenacidad posterior al rendimiento, al igual que la deformación posterior al rendimiento, a menudo no se informa debido a los supuestos de las ecuaciones de deformación en los que no se incluye esta propiedad.

Figura 3: Curvas fuerza-desplazamiento y tensión-deformación. (A) Curva ideal fuerza-desplazamiento; (B) curva ideal de tensión-deformación con la línea derivada del método de desplazamiento del 0,2% utilizado para calcular el límite elástico que se muestra en rojo (tenga en cuenta que esta línea tiene la misma pendiente que la de la región elástica de la curva). Las propiedades clave que se pueden obtener de la curva fuerza-desplazamiento incluyen el límite elástico, la fuerza última, el desplazamiento a fluencia, el desplazamiento total y el trabajo. Las propiedades a nivel tisular que se pueden obtener de la curva de tensión-deformación incluyen tensión de fluencia, tensión última, deformación a fluencia, deformación total, resiliencia y tenacidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez finalizada la tomografía computarizada, la mayoría de las exploraciones inadecuadas pueden detectarse en la reconstrucción. A menudo, los escaneos deficientes tendrán una alta compensación de desalineación que es un claro indicador de un error durante el escaneo. Sin embargo, pueden producirse errores en otros pasos y también podrían dar lugar a datos inexactos. Estos errores a menudo se pueden detectar a medida que se examinan las propiedades arquitectónicas calculadas individuales. Si los valores caen muy lejos del rango de otros en un grupo, se debe volver a examinar el escaneo, el ROI y el método de cálculo de las propiedades.

Una vez que se completan las pruebas de flexión, se deben examinar los gráficos de fuerza-desplazamiento de cada prueba para identificar las pruebas deficientes que pueden necesitar ser eliminadas del conjunto de datos. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de una prueba problemática. El gráfico de la Figura 4A muestra los resultados de una prueba de flexión realizada correctamente. Hay una región lineal clara que carece de una convergencia de baja pendiente, un punto de fluencia, un punto último (fuerza máxima), una caída en la fuerza a medida que el desplazamiento se extiende más allá de la fuerza máxima y un punto de falla. La curva es suave, sin cambios bruscos en la carga hasta después de que se haya alcanzado el punto final. En consecuencia, las propiedades de esta prueba pueden identificarse fácilmente y ser confiables. El gráfico que se muestra en la Figura 4B muestra el resultado de una prueba de flexión con múltiples características preocupantes. Los cambios bruscos en la carga y la aparición de múltiples picos en la gráfica son indicadores importantes de problemas con esta prueba. Si bien pueden ocurrir picos menores en una prueba adecuada cerca de la fuerza máxima, la magnitud y el número de picos en este gráfico sugieren que el hueso puede haber rodado durante la prueba. Ya sea que se observen y observen durante la prueba o cuando se examinan las pruebas antes del análisis, los datos de la muestra deben investigarse durante el análisis posterior a la prueba. Si los datos son realmente defectuosos o están muy fuera del rango de otras muestras del grupo, sería ideal no incluir esta prueba en el conjunto de datos final. Esta es una de las razones para alimentar adecuadamente el experimento con cálculos de potencia a priori . Podría ser posible informar solo ciertas propiedades de una muestra (en este caso, las propiedades de prerendimiento podrían ser aceptables), pero esto no es lo ideal y debe explicarse claramente cuando se informa.

Figura 4: Gráficos de fuerza-desplazamiento. (A) Gráfico ideal de fuerza-desplazamiento. (B) Gráfico de fuerza-desplazamiento resultante de una prueba de flexión deficiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con todos los gráficos de fuerza-desplazamiento examinados y los valores normalizados a tensión-deformación, las propiedades de interés pueden identificarse y mostrarse de múltiples maneras. En la Figura 5, se muestran los gráficos resultantes de fuerza-desplazamiento y tensión-deformación para un estudio completo. Se trata de representaciones esquemáticas en las que se determinan la fuerza y el desplazamiento en el punto de partida (0,0), el fluencia, el punto final y el fallo para cada hueso y, a continuación, se promedian la fuerza/tensión y el desplazamiento/deformación para obtener un gráfico medio para cada grupo. Los gráficos no se utilizan para el análisis estadístico, pero se pueden utilizar para mostrar cómo varía el comportamiento general debido a factores como un tratamiento o el estado de la enfermedad. Los gráficos que se muestran en la Figura 5 son de un estudio que compara ratones control con aquellos inducidos con un estado de diabetes tipo 2 y enfermedad renal crónica (DM2-ERC). Las tibias derechas de estos animales se sometieron a pruebas hasta el fallo mediante flexión de cuatro puntos y se analizaron para obtener las propiedades discutidas en la sección 8 del protocolo. A partir de la Figura 5, queda claro que el grupo de DM2-ERC tenía propiedades mecánicas reducidas, incluida la resistencia y la rigidez, tanto a nivel estructural como tisular. Estos ratones también parecen tener propiedades postrendimiento reducidas, un indicador de fragilidad. Estos gráficos no deben utilizarse para extraer conclusiones definitivas de un estudio. Más bien, actúan como una representación visual y deben verificarse realizando un análisis estadístico de todas las propiedades de interés.

Figura 5: Gráficos de fuerza-desplazamiento y tensión-deformación para un estudio completo . (A) Gráfico de fuerza-desplazamiento para animales de control y animales inducidos por diabetes tipo 2 y enfermedad renal crónica. Este gráfico resultó de promediar la fuerza de fluencia, el desplazamiento a la fluencia, la fuerza última, el desplazamiento final, la fuerza de falla y el desplazamiento total para cada grupo y trazar estas medias junto con la desviación estándar. (B) Tensión-tensión para animales control y animales con DM2-ERC. Este gráfico resultó de promediar la tensión de fluencia, la deformación a fluencia, la tensión última, la deformación última, la tensión de falla y la deformación total y trazar las medias resultantes junto con la desviación estándar. Abreviatura: DT2-ERC = animales inducidos por diabetes tipo 2 y enfermedad renal crónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los datos mecánicos y los resultados de una prueba t de dos colas se muestran en la Tabla I. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Un examen general sugiere datos dentro de los rangos adecuados y con los niveles esperados de variabilidad. Tenga en cuenta que las propiedades posteriores al rendimiento tienden a tener la mayor variación y, por lo tanto, a menudo requieren los tamaños de muestra más grandes para detectar diferencias significativas. Como sugieren las curvas esquemáticas de la Figura 5, hay disminuciones significativas en casi todas las propiedades mecánicas estructurales y a nivel tisular. A partir de estos datos, se puede concluir que el estado de enfermedad inducido condujo a huesos más débiles, menos rígidos y más susceptibles a fracturarse debido a la pérdida de deformabilidad y la reducción de la tenacidad. Los estudios con comparaciones más matizadas pueden no ser tan sencillos de interpretar. Un ejemplo de esto puede ser si se observan mejoras significativas en las propiedades mecánicas a nivel estructural, pero no en las propiedades mecánicas a nivel tisular. En este caso, es probable que los efectos observados se deban a cambios en la arquitectura del hueso (p. ej., aumento del área, aumento del grosor cortical) en lugar de mejoras en la calidad ósea a nivel tisular. Por ejemplo, el área ósea aumentó debido a la ganancia de hueso tejido, pero la calidad del tejido ha disminuido ya que ahora está presente un hueso tejido desorganizado en lugar de un hueso laminar organizado. Esto podría apoyarse mediante un análisis de μCT en el que se pueden observar mejoras estadísticamente significativas en la arquitectura. Por el contrario, puede haber mejoras significativas en las propiedades mecánicas a nivel tisular con mejoras mínimas o nulas en las propiedades mecánicas a nivel estructural. Esta alta calidad de tejido podría enmascarar las trampas de los huesos más pequeños. La interpretación de los datos puede complicarse aún más si se observan cambios en las propiedades previas al rendimiento, pero no en las propiedades posteriores al rendimiento o viceversa. En el primer caso, un cambio en la capacidad del hueso para resistir la deformación puede mejorar, mientras que su capacidad para tolerar el daño no lo es. En cada uno de estos casos, la capacidad de hacer referencia a las propiedades arquitectónicas a partir del análisis de μCT es muy beneficiosa y debe utilizarse (aunque la descripción de ese método está más allá del alcance de este artículo). Debido a la complejidad de la interpretación de estas propiedades, presentar todas las propiedades en forma de tabla o figura (no solo aquellas propiedades que tienden a ser las más fáciles de interpretar, como la fuerza última, o que cuentan la historia que se busca contar) permite una representación más completa de los impactos mecánicos.

Tabla 1: Resultados de las pruebas mecánicas y análisis estadísticos. Los valores se muestran como media ± desviación estándar. Los valores de p son el resultado de una prueba t desapareada de dos colas. * P < 0,05 y ** P < 0,01. Abreviatura: DT2-ERC = animales inducidos por diabetes tipo 2 y enfermedad renal crónica.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.