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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Knockdown de FAM83A pour vérifier son rôle dans la croissance des cellules cancéreuses du col de l’utérus et la sensibilité au cisplatine

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65667
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous montrons les procédures pour le knockdown FAM83A ; les tests permettant de détecter ses effets sur la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus ; et la sensibilisation de ces cellules au cisplatine. Cette étude fournit un gène cible prometteur pour le cancer du col de l’utérus et une référence pour la recherche de médicaments ultérieurs.

Abstract

L’exploration des gènes cibles tumoraux revêt une importance capitale pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. Dans cette étude, nous décrivons les étapes impliquées dans l’identification d’un gène cible tumoral FAM83A dans le cancer du col de l’utérus. Tout d’abord, l’ensemble de données de l’Atlas du génome du cancer a été utilisé pour valider l’expression et la signification pronostique de FAM83A chez les femmes. Un petit ARN interférent (siRNA) a été utilisé pour inhiber le gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . Ensuite, une coloration à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été effectuée pour déterminer les effets sur les capacités de prolifération des cellules tumorales. Des tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont été effectués pour évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.

Le Western blot a été utilisé pour quantifier les niveaux de protéines liées à l’apoptose. La coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. De plus, l’intervention du cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP) a été utilisée pour évaluer le potentiel thérapeutique du gène cible. Des tests de cytométrie en flux et de formation de colonies ont été effectués pour valider davantage les caractéristiques anticancéreuses du gène. En conséquence, il a été démontré que le knockdown de FAM83A inhibe la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et sensibilise ces cellules au cisplatine. Ces méthodologies complètes valident collectivement FAM83A en tant que gène cible associé à la tumeur, prometteur en tant que cible thérapeutique potentielle dans la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus.

Introduction

Le cancer du col de l’utérus est une préoccupation mondiale car il s’agit de l’un des principaux types de tumeurs malignes gynécologiques dans le monde et de la principale cause de mortalité liée au cancer chez les femmes1. La chirurgie radicale et la chimioradiothérapie sont associées à des taux de guérison élevés au stade primaire. Cependant, les résultats du traitement pour les patientes à un stade avancé du cancer du col de l’utérus qui développent une maladie métastatique sont très défavorables2. Par conséquent, il est crucial de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à la migration et à l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la prévention et le traitement de cette maladie.

L’identification des gènes cibles impliqués dans la progression du cancer et la recherche de moyens d’inhiber leur expression ou leur action présentent des options thérapeutiques prometteuses. Dans cette étude, nous avons identifié FAM83 comme un gène cancérigène et étudié plus en détail ses effets inhibiteurs sur les cellules C33a et HeLa. Les oncogènes de la famille FAM83 (FAM83A-H) sont largement rapportés dans les cancers humains 3,4. Récemment, il a été rapporté que FAM83A était régulé à la hausse dans les cancers du poumon5, du sein6, de l’ovaire7 et du pancréas8, ce qui indique que FAM83A joue un rôle important dans la progression du cancer en favorisant la prolifération, l’invasion, les traits de type cellule souche et la résistance aux médicaments dans les cellules tumorales. Il est important de noter que FAM83A a été identifié comme l’un des nouveaux gènes candidats associés à la progression des lésions cervicales et à la cancérogenèse9. Malgré la confirmation de l’expression élevée de FAM83A dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus humain, l’impact spécifique et les mécanismes sous-jacents de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus restent incertains.

Dans cette étude, nous décrivons les protocoles impliqués dans l’identification de FAM83A en tant que gène cible de la tumeur dans le cancer du col de l’utérus et utilisons un petit ARN interférent (siRNA) pour l’inactivation du gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . La coloration à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été réalisée pour déterminer les effets sur la prolifération des cellules tumorales, tandis que les tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont permis d’évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.

Un transfert Western a été effectué pour déterminer les niveaux de protéines liées à l’apoptose, et la coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. Ainsi, nous avons rapporté que FAM83A joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, les métastases et l’invasion dans le cancer du col de l’utérus. Grâce à un dysfonctionnement mitochondrial et à l’apoptose associés à la voie PI3K/AKT, FAM83A a sensibilisé les cellules cancéreuses du col de l’utérus au cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP). Cette étude fournit une nouvelle cible pour le cancer du col de l’utérus et possiblement d’autres cancers et une référence pour le développement de stratégies visant à surmonter la résistance des cellules cancéreuses à certains médicaments chimiothérapeutiques.

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Protocol

L’étude était tout à fait conforme aux lignes directrices de publication fournies par TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Source de données et analyse bioinformatique

  1. Obtenez des données de séquençage de l’ARN à partir de la base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) pour l’analyse en grappes. Utilisez le GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), un outil en ligne pour recalculer les données brutes de séquençage de l’ARN d’échantillons provenant de projets TCGA, afin de dépister des cibles thérapeutiques candidates contre le cancer à l’aide d’un pipeline de traitement standard.
    NOTE : Le site web du GEPIA est accessible gratuitement à tous les utilisateurs.
  2. Accédez à la page d’accueil du site Web du GEPIA et cliquez sur Analyse du type de cancer, sélectionnez l’option Analyse différentielle des gènes et définissez les paramètres suivants : Nom du cancer = CESE (défini comme carcinome épidermoïde du col de l’utérus et adénocarcinome endocervical sur cette page Web), |Log2FC| Seuil = 1, seuil de la valeur q = 0,01, méthodes différentielles = ANOVA et distribution chromosomique = les deux. Ensuite, cliquez sur Liste pour obtenir une liste de gènes qui montre l’expression différentielle entre les groupes tumoraux et normaux.
    REMARQUE : Il faut une revue approfondie de la littérature pour identifier les gènes candidats exprimés de manière différentielle. Dans cette étude, en tenant compte du contexte de la littérature disponible, nous nous concentrons sur le gène tumoral d’intérêt, FAM83A.
  3. Ensuite, examinez l’expression de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus et les tissus normaux à l’aide de GEPIA en passant à l’option Expression DIY sur le site Web et sélectionnez Boîte à moustaches comme type de graphique. Saisissez FAM83A dans le champ des paramètres du gène et définissez les paramètres suivants : |Log2FC| Valeur limite = 1 ; valeur q Cutoff = 0,01. Sélectionnez CESE comme nom du cancer et Correspondre aux données normales TCGA pour le champ Données normales appariées , en laissant tous les autres paramètres à leur valeur par défaut. Cliquez sur Tracer et autorisez le site Web à générer une boîte à moustaches représentant l’expression différentielle du gène FAM83A ; Enregistrez la boîte à moustaches pour référence et analyse ultérieures.
  4. Enfin, analyser la survie globale des patientes porteuses de tumeurs présentant différents niveaux d’expression de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus. Accédez à l’option Tracés de survie sur le site Web, définissez le gène sur FAM83A et sélectionnez Survie globale comme type d’analyse. Ajoutez le nom de la tumeur CESE, choisissez Mois pour les unités de l’axe et laissez tous les autres paramètres à leurs paramètres par défaut. Cliquez sur Tracer et laissez le site Web générer un graphique de courbe de survie ; Conservez ce tableau pour référence et analyse futures.
  5. Prendre en compte à la fois l’expression différentielle de FAM83A dans les tumeurs et sa corrélation avec l’analyse de survie des patientes pour identifier FAM83A comme un gène cible thérapeutique potentiel dans le cancer du col de l’utérus.

2. Expériences cellulaires

  1. Culture cellulaire
    1. Cultiver des lignées cellulaires tumorales humaines dans le milieu modifié à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 .
      REMARQUE : Se reporter au tableau des matériaux pour obtenir des renseignements sur les lignées cellulaires et les composants du milieu de culture.
  2. Transfection cellulaire
    1. Utilisez l’ARNi pour inhiber l’expression de FAM83A dans les cellules.
      REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la séquence spécifique de siRNA.
    2. Semer les cellules dans des plaques à 6 puits et incuber avec le mélange de 50 nM si-FAM83A ou siRNA-NC et de 8 μL d’agent de transfection ou seulement 8 μL d’agent de transfection pendant 4 à 6 h après avoir atteint une confluence de 50 % à 70 %. N’ajoutez que du DMEM sans sérum au contrôle négatif.
    3. Après l’incubation, remplacer le milieu contenant l’agent de transfection par du DMEM + 10 % de sérum de veau fœtal. De plus, 48 h après la transfection, traiter avec 5 μM de cisplatine (DDP) pendant 24 h comme prévu et prélever toutes les cellules pour l’extraction totale de l’ARN et l’analyse qRT-PCR.

3. Détection de l’EdU pour le test de prolifération cellulaire

REMARQUE : Utilisez le kit de prolifération cellulaire EdU pour évaluer la prolifération cellulaire in vitro conformément aux instructions du fabricant.

  1. Ensemencer les cellules dans des plaques à 6 puits et les incuber avec une solution EdU à 10 μM pendant 2 h. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante (RT) et perméabilisez-les avec du Triton X-100 à 0,3 % dans du PBS pendant 10 min à RT.
  2. Retirez le tampon de perméabilisation et ajoutez 500 μL de solution réactionnelle 1x. Ensuite, incubez pendant 30 minutes à RT dans l’obscurité pour la coloration nucléaire.
  3. Colorez les cellules avec le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et visualisez-les au microscope à fluorescence à un grossissement de 200x. Colorez les noyaux des cellules proliférantes avec de l’EdU et examinez-les pour la fluorescence rouge.
  4. Enfin, utilisez un logiciel pour quantifier les résultats en comptant au moins 10 champs aléatoires et calculez les taux de prolifération en utilisant le rapport entre les cellules fluorescentes positives et le nombre total de cellules.

4. Test de cicatrisation des plaies

  1. Cellules de semence en plaques à 6 puits à une densité de 2 × 105 cellules par puits.
  2. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, utilisez un embout de micropipette stérile de 10 μL pour créer délicatement une rayure linéaire dans la monocouche cellulaire. Rincez doucement les puits avec du PBS stérile pour éliminer les cellules détachées et les débris causés par le grattage.
  3. De plus, incubez les cellules dans un milieu contenant 1 % de FBS. Ensuite, observez et prenez des images avec le microscope inversé pour la cicatrisation de la région blessée à 12, 24 et 48 h.

5. Essai d’insertion de membrane poreuse

  1. Préparer une suspension cellulaire dans un milieu de culture cellulaire à la concentration cellulaire souhaitée (contenant 4 × 10cellules 4 ), y compris les cellules C33a transfectées ou témoins et HeLa. Ajoutez la suspension cellulaire dans la chambre supérieure des inserts membranaires, en assurant une distribution uniforme. Ajouter le milieu complet dans la chambre inférieure.
  2. Après incubation pendant 24 h, utiliser de l’alcool méthylique et du violet cristallin à 0,1 % pour la fixation et la coloration des cellules migrant vers les chambres inférieures, respectivement.
  3. Utilisez un microscope inversé pour prendre des images, puis analysez le nombre de cellules en migration en comptant au moins 10 champs aléatoires avec ImageJ.
    1. Pour l’analyse des nombres avec ImageJ, ouvrez l’image dans le logiciel ImageJ, allez dans l’onglet Image dans le menu de l’outil, sélectionnez Ajuster, puis cliquez sur Seuil. Ajustez les paramètres de seuil, si nécessaire, jusqu’à ce que seules les cellules soient visibles sur un fond blanc.
    2. Cliquez sur Appliquer dans la fenêtre Seuil pour appliquer ces paramètres à l’image. Maintenant, sélectionnez l’outil Baguette (traçage) dans la barre d’outils (située en haut de la fenêtre).
    3. Cliquez sur la zone de l’image où se trouvent les cellules pour sélectionner toutes les cellules de l’image seuillée. Une fois les cellules mises en surbrillance, accédez à Analyser dans le menu Outil, puis cliquez sur Analyser les particules. Dans la fenêtre Analyser les particules, entrez la taille (par exemple, 0 - infini) et les valeurs de circularité (par exemple, 0,00 - 1,00) souhaitées en fonction des exigences expérimentales pour inclure toutes les cellules dans le nombre.
    4. Cliquez sur OK et attendez que le logiciel compte les cellules et qu’une nouvelle fenêtre apparaisse avec les résultats de l’analyse.

6. Essai de formation de colonies

  1. Ensemencer 2 × 105 cellules par puits de groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à 6 puits avec ou sans traitement au cisplatine 5 μM (DDP) pendant 24 h.
  2. Après une période de traitement médicamenteux de 24 heures, détacher les cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine et les remettre en suspension dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS. Ensemencer les cellules remises en suspension dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 103 cellules par puits, puis incuber dans un incubateur à 5 % de CO2 à une température de 37 °C.
  3. Après l’incubation pendant ~7 à 10 jours lorsque les colonies sont visibles, fixez les cellules avec du polyoxyméthylène à 4 % et colorez-les avec la solution colorante Giemsa pendant 20 min.
  4. Lavez légèrement les cellules et laissez les plaques sécher à l’air libre. Prenez des images des grappes de colonies au microscope et comptez le nombre de colonies qui contiennent plus de 50 cellules.

7. Analyse de la dépolarisation de la membrane mitochondriale (MMP) à l’aide du colorant JC-1

  1. Semez 1,2 × 106 cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
  2. Incuber avec 1x solution de coloration JC-1 pendant 15 à 20 min sous 5 % de CO2 à 37 °C à l’aide d’un kit de dosage du potentiel de la membrane mitochondriale selon les instructions du fabricant.
  3. Lavez les cellules et examinez-les au microscope fluorescent à un grossissement de 200x en utilisant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour JC-1 à ~490 nm et 590 nm, respectivement. Pour visualiser la fluorescence JC-1, utilisez des filtres appropriés, tels qu’un filtre d’excitation bleu (450-490 nm) et un filtre d’émission rouge (passe-long > 590 nm) pour capturer sélectivement le signal de fluorescence émis.

8. Analyse par cytométrie en flux du mPTP

  1. Semez 1,2 × 106 cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
  2. Retirez le milieu de culture des cellules, remettez les cellules en suspension dans du PBS et ajoutez 300 μL chacune (1x volume) de solution de coloration Calcein AM et de solution de travail de trempe par fluorescence pour couvrir uniformément les cellules. Incuber les cellules à 37 °C dans un environnement à l’abri de la lumière pendant 30 à 45 min et remplacer le milieu par un milieu de culture frais préchauffé à 37 °C. Incuber les cellules à 37 °C dans un environnement protégé de la lumière pendant 30 minutes supplémentaires pour assurer l’hydrolyse complète de la calcéine AM par les estérases intracellulaires, ce qui entraîne la génération de calcéine fluorescente verte intracellulaire.
  3. Retirez le milieu de culture, lavez les cellules 2 à 3 fois avec du PBS et ajoutez un tampon de détection. Détectez le mPTP cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et d’une longueur d’onde d’excitation de 488 nm.

9. Cytométrie en flux

  1. Semez 1,2 × 106 cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
  2. Après 24 h de traitement médicamenteux, remettre les cellules en suspension dans 200 μL de solution tampon de liaison et mélanger délicatement 10 μL d’annexine V-FITC et 5 μL d’iodure de propidium (IP) dans la suspension cellulaire. Incuber le mélange pendant 15 min en évitant la lumière et ajouter 300 μL de solution tampon de liaison aux cellules. Détecter l’apoptose cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm.

10. Analyse RT-PCR

  1. Semez 1,2 × 106 cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
  2. Extraire l’ARN total des cellules tumorales à l’aide du réactif d’extraction d’ARN et convertir l’ARN extrait en ADN complémentaire (ADNc) avec le mélange de synthèse d’ADNc en incubant à 42 °C pendant 45 min, puis à 95 °C pendant 5 min.
  3. Préparez le mélange réactionnel PCR contenant l’ADN polymérase, les nucléotides, le tampon et les amorces spécifiques au gène conçues. Ajouter le modèle d’ADNc au mélange réactionnel pour la réaction de PCR en temps réel et effectuer la PCR sur l’instrument de PCR quantitatif en temps réel avec les conditions de thermocyclage suivantes : dénaturation à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s, et de l’étape de la courbe de fusion à 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min et 95 °C pendant 15 s. Quantifier les niveaux d’ARNm à l’aide de la méthode 2−ΔΔCq en utilisant GAPDH comme contrôle interne.
    REMARQUE : Le système de réaction RT-PCR est illustré dans le tableau 1 et les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau 1.
    1. Pour calculer la valeur 2−ΔΔCq , mesurez les valeurs de Cq pour le gène cible et le gène de référence (GAPDH) dans les échantillons. Calculez le ΔCq en soustrayant la valeur Cq du gène de référence de la valeur Cq du gène cible pour chaque échantillon. Calculer le ΔΔCq en soustrayant le ΔCq d’un échantillon témoin du ΔCq de chaque échantillon expérimental. Enfin, calculez la valeur 2−ΔΔCq en élevant 2 à la puissance de la valeur ΔΔCq.
      REMARQUE : La valeur Cq représente le numéro de cycle auquel le signal de fluorescence atteint le seuil défini.

11. Analyse par transfert Western

  1. Semez 1,2 × 106 cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
  2. Collectez les cellules cultivées et lavez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour éliminer tout milieu de croissance ou sérum résiduel. Lyser les cellules à l’aide d’un tampon de lyse RIPA contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) pour libérer les protéines cellulaires. Incuber les cellules sur de la glace pendant quelques minutes pour assurer une lyse complète et centrifuger à 4 °C, 12 000 × g pendant 15 min. Prélever le surnageant pour déterminer sa concentration en protéines.
  3. Déterminer la concentration de protéines dans le lysat cellulaire à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA selon les instructions du fabricant. Mélangez le lysat cellulaire avec un tampon de charge et chauffez le mélange à 95-100 °C pendant 5-10 min pour dénaturer les protéines et assurer une séparation uniforme sur le gel.
  4. À partir de chaque échantillon, chargez 30 μg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE et faites fonctionner le SDS-PAGE sous une tension constante de 80 V. Arrêtez l’électrophorèse lorsque le bleu de bromophénol atteint le fond du gel de séparation.
  5. Transférer les protéines séparées du gel sur une membrane de polyfluorure de vinyle à l’aide d’un système de transfert humide sur un bain de glace avec un courant de 200 mA pendant 1,5 h.
  6. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris avec un tampon Tween-20 à 0,05 % (TBST) pendant 1 h à RT et incuber pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps respectifs indiqués dans le tableau des matériaux.
  7. Laver la membrane plusieurs fois avec TBST et incuber avec les anticorps secondaires (Table des matériaux) pendant 1 h à RT, suivi d’un lavage avec TBST. Visualisez les bandes protéiques à l’aide d’un kit de détection de chimiluminescence amélioré et d’un système d’imagerie.

12. Analyse statistique

  1. Étant donné que tous les points de données expérimentaux seront indépendants, présentez les données sous la forme de la moyenne ±écart-type.
  2. Utilisez l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour les comparaisons multiples et le test de Dunnett pour comparer chaque groupe avec le groupe témoin. Utilisez le test t de Student (bilatéral non apparié) pour comparer deux groupes ; considèrent que P < 0,05 sont significatifs.

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Representative Results

Analyse de la base de données TCGA et validation PCR

À partir de l’analyse de la base de données TCGA, nous avons effectué une analyse comparative des niveaux d’expression de l’ARNm dans 306 échantillons de cellules cancéreuses du col de l’utérus et 13 échantillons de cellules normales afin d’étudier l’expression différentielle de FAM83A. FAM83A a été régulé à la hausse dans le cancer du col de l’utérus, tandis que son expression dans le tissu cervical normal était négligeable (Figure 1A). Pour mieux comprendre les implications pronostiques de l’expression de FAM83A , nous avons effectué une analyse de la courbe de Kaplan-Meier. Il est frappant de constater que les patients présentant une expression plus élevée de FAM83A présentaient une survie globale nettement inférieure (Figure 1B). Pour déterminer le rôle de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus, nous avons examiné les niveaux d’expression de FAM83A dans deux lignées cellulaires de cancer du col de l’utérus, HeLa et C33a, ainsi que dans une lignée cellulaire cervicale immortalisée, End1/E6E7. En utilisant la qRT-PCR, nous avons observé une surexpression significative de FAM83A dans les lignées cellulaires HeLa et C33a par rapport à la lignée cellulaire End1/E6E7 (Figure 1C). Ces résultats soulignent l’importance de FAM83A dans le contexte du cancer du col de l’utérus.

Expériences de prolifération et d’apoptose pour vérifier la fonction biologique de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus

Pour étudier le rôle fonctionnel de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus, nous avons utilisé l’inactivation de FAM83A médiée par l’ARNi dans les cellules C33a et HeLa (Figure 2A,B). Nous avons ensuite évalué l’impact de la suppression de FAM83A sur la prolifération cellulaire. La coloration EdU a révélé que la diminution de l’expression de FAM83A inhibait significativement la prolifération cellulaire dans les cellules C33a et HeLa (Figure 2C-F). Les cellules malignes immortelles sont associées à des taux d’apoptose extrêmement faibles10. Par conséquent, les niveaux de protéines anti- et pro-apoptotiques ont été évalués dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus témoins et traitées au si-FAM83A. Les analyses par transfert Western ont révélé que la suppression de l’expression de FAM83A augmentait l’expression des protéines Bax et caspase3 clivées (protéines proapoptotiques), diminuait l’expression de Bcl-2 (protéine anti-apoptotique) et augmentait la libération de Cytc (Figure 2C-E), ce qui est cohérent avec l’observation selon laquelle les protéines anti-apoptotiques régulent l’apoptose en bloquant la libération mitochondriale de Cytc (Figure 2G-J)10. Collectivement, ces données suggèrent que FAM83A joue un rôle important dans la régulation de la prolifération et de l’apoptose des cellules cancéreuses du col de l’utérus.

Essais de cicatrisation et d’insertion de membranes poreuses pour vérifier la fonction biologique de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus

Des tests de cicatrisation et d’insertion membranaire ont été effectués pour explorer les effets de la suppression de FAM83A sur la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus. Les résultats ont révélé que les cellules cancéreuses du col de l’utérus dont l’expression de FAM83A était supprimée migraient (Figure 3A-D) et envahissaient (Figure 3E-H) moins efficacement que les cellules témoins.

Effets sur la fonction mitochondriale et la voie de signalisation PI3K/AKT

Compte tenu du rôle de PI3K/AKT dans l’induction de l’apoptose cellulaire, nous avons cherché à déterminer si la suppression de l’expression de FAM83A inhiberait la phosphorylation constitutive de la voie PI3K/Akt/mTOR dans le cancer du col de l’utérus. La suppression de FAM83A a inhibé de manière significative les niveaux de protéines phosphorylées clés dans la voie PI3K/Akt/mTOR, y compris p-PI3K, p-Akt et p-mTOR dans les cellules c333a et HeLa (Figure 4A-D). Les mitochondries sont les organites responsables du métabolisme cellulaire et de l’induction de l’apoptose cellulaire. L’accumulation de preuves indique que l’apoptose des cellules cancéreuses implique un dysfonctionnement mitochondrial par la voie mitochondriale intrinsèque en raison de l’augmentation de la perméabilité mitochondriale et de la libération de molécules proapoptotiques telles que Cytc dans le cytoplasme10. La voie PI3K/AKT pourrait réguler la translocation de Bax dans les mitochondries, induisant la libération de Cytc en réponse à des stimuli apoptotiques. Par conséquent, il est concevable que les composants oncogènes de la voie de signalisation PI3K-AKT régulent directement l’apoptose cellulaire en influençant le comportement mitochondrial. Ainsi, un test de pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) sur des cellules vivantes a été effectué pour déterminer le statut mitochondrial. L’ouverture de mPTP est associée à la mort cellulaire apoptotique et nécrotique11. Dans ce test, un colorant fluorescent vert (calcéine AM) est retenu dans le cytoplasme et les mitochondries lorsque le mPTP est fermé, tandis que le colorant dans le cytoplasme est éteint par CoCl2, ne laissant que la fluorescence intensive dans les mitochondries. Les résultats ont révélé que les populations cellulaires avec une fluorescence verte intense dans les mitochondries ont diminué de manière significative après la suppression de FAM83A, indiquant une mPTP ouverte (Figure 4E,F). De plus, nous avons examiné les changements dans le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) à l’aide de la coloration JC-1. JC-1 forme des agrégats (fluorescence rouge) dans des cellules vivantes contenant des mitochondries intactes à fort potentiel membranaire et des monomères (fluorescence verte) sous MMP faible dans les cellules apoptotiques. La suppression de FAM83A a graduellement diminué la MMP (figure 4G).

Analyse de la sensibilité aux médicaments pour la prolifération et l’invasion

La chimiothérapie à base de cisplatine (DDP) est une stratégie de traitement standard du cancer du col de l’utérus. Cependant, la chimiorésistance reste un défi. Nous avons étudié le rôle de FAM83A dans le traitement du cancer du col de l’utérus à l’aide de cisplatine. Les cellules HeLa témoins, traitées au si-NC et traitées au si-FAM83A ont été traitées avec ou sans 5 μM de cisplatine12. De plus, les effets de la suppression de FAM83A sur la viabilité cellulaire ont été évalués. Le DDP a induit un effet inhibiteur plus significatif sur la prolifération des cellules HeLa après suppression de FAM83A , par rapport au traitement par DDP seul (Figure 5A et Figure 5C). Après avoir traité les cellules cancéreuses du col de l’utérus avec 5 μM de cisplatine, la suppression de FAM83A a également inhibé l’invasion cellulaire (Figure 5B et Figure 5D).

Analyse de la sensibilité aux médicaments pour la fonction mitochondriale

En traitant les cellules HeLa traitées au Si-NC et au Si-FAM83A avec ou sans cisplatine (DDP) à 5 μM, nous avons évalué le potentiel membranaire mitochondrial (MMP) et évalué les dommages mitochondriaux causés par la mort cellulaire à l’aide de la coloration JC-1. Le DDP a induit plus de dommages mitochondriaux, comme l’a révélé une diminution du pourcentage de monomères JC-1 après l’inactivation de FAM83A , par rapport au traitement DDP uniquement (Figure 6A et Figure 6D). Après avoir traité les cellules cancéreuses du col de l’utérus avec du cisplatine à 5 μM, l’inactivation de FAM83A a également inhibé la formation de colonies (Figure 6B et Figure 6E) et amélioré l’apoptose cellulaire (Figure 6C et Figure 6F). De plus, l’inhibition de FAM83A en présence de DDP a nettement augmenté l’expression des protéines proapoptotiques, du Bax et de la caspase clivée3, a favorisé la libération de Cytc et a diminué l’expression de Bcl-2 (Figure 6G, H). Ces résultats ont indiqué que le knockdown FAM83A sensibilisait les cellules cancéreuses du col de l’utérus au DDP via l’induction de l’apoptose.

Figure 1
Figure 1 : Surexpression de FAM83A dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus et corrélation avec un pronostic plus sombre. (A) Boîte à moustaches des niveaux d’ARNm de FAM83A dans des échantillons de cancer du col de l’utérus. (B) Analyse de Kaplan-Meier de l’expression de FAM83A pour la détermination de la survie globale chez les patientes atteintes d’un cancer du col de l’utérus. (C) Concentrations relatives d’ARNm de FAM83A dans les lignées cellulaires de cancer du col de l’utérus HeLa et C33a et dans la lignée cellulaire cervicale immortalisée chez l’homme End1/E6E7. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type pour trois expériences indépendantes. *P < 0,05, par rapport aux cellules End1/E6E7 utilisant l’ANOVA à un facteur. Abréviations : CESE = carcinome épidermoïde cervical et adénocarcinome endocervical ; HR = rapport de risque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Effets de la suppression de FAM83A sur la prolifération et l’apoptose du cancer du col de l’utérus. Les cellules C33a et HeLa ont été transfectées avec des siARN spécifiques de FAM83A. Les niveaux d’ARNm (A,B) de FAM83A ont été évalués dans des lignées cellulaires de cancer du col de l’utérus à l’aide de la qRT-PCR.La prolifération cellulaire dans les cellules (C) C33a et (D) HeLa a été déterminée à l’aide du test EdU. (E,F) Les images de fluorescence EDU des cellules C33a et Hela. (G-J) Analyse par transfert Western pour examiner les niveaux de protéines liées à l’apoptose, y compris Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 et caspase-3 clivée ; Le GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type pour trois expériences indépendantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; **P < 0,001, par rapport aux cellules témoins utilisant l’ANOVA à un facteur. Abréviations : NC = contrôle négatif ; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine ; CytC = cytochrome C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effet de FAM83A sur la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus in vitro. (A-D) Un test de cicatrisation a été effectué pour évaluer la migration cellulaire. Des images ont été prises à 0, 24 et 48 h. (E-H) Des tests Transwell ont été effectués pour examiner l’invasion cellulaire. Barres d’échelle = 100 μm (E,F). Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type pour trois expériences indépendantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; **P < 0,001, par rapport aux cellules témoins utilisant l’ANOVA à un facteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Effet de la suppression de FAM83A sur la voie PI3K/AKT/mTOR et la fonction mitochondriale. (A-D) Analyse par transfert Western pour déterminer les niveaux de protéines de la voie PI3K/AKT/mTOR dans les cellules C33a et HeLa après suppression de FAM83A. (E-H) Analyse du potentiel membranaire mitochondrial par coloration JC-1. Les agrégats JC-1 ont été colorés en rouge, et les monomères JC-1 ont été colorés en vert, ce qui indique une MMP plus faible. (I,J) La perméabilité mitochondriale a été évaluée à l’aide d’un kit mPTP et d’une cytométrie en flux. Barres d’échelle = 50 μm (E, F). Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type pour trois expériences indépendantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; P < 0,001, par rapport aux cellules témoins utilisant l’ANOVA à un facteur. Abréviations : MMP = potentiel membranaire mitochondrial ; mPTP = pore de transition de perméabilité mitochondriale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Effets de la suppression de FAM83A sur l’inhibition par le DDP sur la prolifération cellulaire et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus. Les cellules HeLa ont été transfectées avec du si-NC ou du si-FAM83A et traitées avec ou sans DDP de 5 μM. (A,C) Effet du DDP sur la prolifération cellulaire dans les cellules HeLa témoins, traitées au si-NC et traitées au si-FAM83. (B,D) Effet du DDP sur l’invasion cellulaire dans les cellules HeLa témoins, traitées au si-NC et traitées au si-FAM83. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type pour trois expériences indépendantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; P < 0,001, par rapport aux cellules témoins. &&P < 0,01 ; &&&P < 0,001, par rapport à DDP utilisant l’ANOVA à un facteur. Abréviations : DDP = diaminedichloroplatine ; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Effets de la suppression de FAM83A sur les effets de la DDP sur l’apoptose dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus. Les cellules HeLa ont été transfectées avec du si-NC ou du si-FAM83A et traitées avec ou sans DDP de 5 μM. (A,D) Analyse MMP par coloration JC-1. (B,E) Résultats du clonage de plaques. (C,F) Cytométrie en flux détectant les taux d’apoptose dans différents groupes de traitement. (G,H) Analyse par transfert Western des protéines apoptotiques liées aux mitochondries, y compris Bcl-2, Bax, Cytc et la caspase-3 clivée en aval. Le GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ±écart-type pour trois expériences indépendantes. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; P < 0,001, par rapport aux cellules témoins. &P < 0,05 ; &&P < 0,01 ; &&&P < 0,001, par rapport à DDP utilisant l’ANOVA à un facteur. Abréviations : DDP = diaminedichloroplatine ; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : siRNA, amorces qRTPCR et configuration de réaction qRT-PCR utilisée dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’étude des gènes cibles de la tumeur est de la plus haute importance pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. La compréhension des gènes spécifiques qui jouent un rôle important dans le développement et la progression du cancer du col de l’utérus fournit des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie. De plus, l’identification de ces gènes cibles peut conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et de thérapies ciblées. Dans cette étude, nous décrivons l’utilisation de l’analyse de l’ensemble de données TCGA pour identifier FAM83A comme gène cible et étudier ses rôles mécanistiques dans le cancer du col de l’utérus. Nous observons une expression significativement élevée de FAM83A dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus, ce qui est associé à un mauvais pronostic des patientes atteintes d’un cancer du col de l’utérus. Une série d’expériences cellulaires a révélé une expression élevée de FAM83A dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus, qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la prolifération, de la migration et de l’invasion cellulaires. La suppression de l’expression de FAM83A a inhibé la prolifération et la migration et favorisé l’apoptose dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus.

La construction de lignées cellulaires de cancer du col de l’utérus FAM83A-knockdown est l’étape la plus critique de cette étude. Les siARN sont conçus et validés en fonction des séquences de gènes cibles afin d’assurer leur efficacité. De plus, les lignées cellulaires du cancer du col de l’utérus sont transfectées à l’aide de siRNA. Le taux de réussite de la transfection des plasmides est crucial pour les expériences ultérieures, qui nécessitent un contrôle strict de la densité cellulaire et de la densité plasmidique. De plus, l’efficacité de la transfection est observée au microscope à fluorescence afin de s’assurer que des expériences ultérieures peuvent être menées. Les résultats du Western blot et de la qRT-PCR confirment que l’inhibition de FAM83A a supprimé la voie PI3K/AKT et induit un dysfonctionnement mitochondrial. Nous émettons l’hypothèse que le mécanisme implique l’inhibition de la translocation de Bax du cytoplasme vers les mitochondries par PI3K/AKT, ce qui favorise la survie cellulaire13.

Les progrès dans le traitement du cancer du col de l’utérus ont permis de développer de nouvelles molécules cibles. L’identification d’un nouvel oncogène peut être appliquée à des fins thérapeutiques pour améliorer le pronostic clinique des tumeurs malignes du col de l’utérus14,15. Dans cette étude, nous avons réussi à construire un système de knockdown FAM83A dans les cellules HeLa et C33a et vérifié les effets du knockdown FAM83A sur les cellules cancéreuses du col de l’utérus au niveau cellulaire. Nous proposons que l’inhibition de FAM83A puisse être utilisée pour traiter le cancer du col de l’utérus.

Cependant, cette étude présente certaines limites. Tout d’abord, cette étude n’effectue que le criblage génétique par le biais de la base de données et manque de données pathologiques sur les patients cliniques. Deuxièmement, cette étude n’a validé l’effet qu’in vitro, et d’autres études in vivo étaient nécessaires pour vérifier les résultats. Néanmoins, les méthodes d’identification des gènes cibles, d’inactivation des gènes et de validation cellulaire pour identifier les loci thérapeutiques ciblés élaborées dans cette étude peuvent fournir des idées de recherche pour la découverte et la validation de gènes cibles pour d’autres maladies.

En résumé, FAM83A était surexprimé et corrélé à un pronostic plus sombre dans le cancer du col de l’utérus. FAM83A régule la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus. Suppression du dysfonctionnement mitochondrial induit par FAM83A et de l’apoptose, sensibilisant les cellules cancéreuses du col de l’utérus au cisplatine. Ces résultats indiquent que FAM83A est une cible de recherche appropriée pour le traitement du cancer du col de l’utérus. Cette étude a contribué aux progrès de la chimiothérapie adjuvante visant à améliorer le pronostic des patientes atteintes d’un cancer du col de l’utérus.

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Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par la Fondation du Bureau des sciences et de la technologie de Jingzhou (n° 2020HC06).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and Medium Formulation
C33a American Type Culture Collection
Hela American Type Culture Collection
Modified medium 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT 4691, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Bcl2  26593-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:1,000
Caspase 3 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:2,000
cleaved-caspase3 abs132005; Absin Bioscience Inc. ‘1:1,000
Cytc 10993-1-AP; Proteintech Group ‘1:1,000
GAPDH  10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. ‘1:8,000
mTOR 2983, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
PI3K 4292, Cell Signaling Technology Inc ‘1:1,000
p-AKT  4060, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448) #5536, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit 17366, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Secondary antibodies GB23303, Servicebio ‘1:2,000
Materials
6-well plate Corning, NPY
Alexa Fluor 555 Beyotime
BCA Protein assay kit  Beyotime, China  P0011
ChemiDoc XRS Imager System  BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit  Servicebio, Inc.,China cat. no. G2014
Fluorescence microscope  Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix  11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope  Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts  Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit  Beyotime, China
PMSF  ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China #ST506
Real-time quantitative PCR instrument  Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer  Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent Invitrogen 15596026
TRIzol reagent  Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro  plus 6.0  

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References

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Knockdown de <em>FAM83A</em> pour vérifier son rôle dans la croissance des cellules cancéreuses du col de l’utérus et la sensibilité au cisplatine
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Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang, Y. Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity. J. Vis. Exp. (204), e65667, doi:10.3791/65667 (2024).

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