Un método eficiente y reproducible para producir plantas compuestas mediante la transformación de raíces peludas basadas en Agrobacterium rhizogenes

Summary

Aquí, proporcionamos el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por Agrobacterium tumefaciens para producir plantas compuestas.

Abstract

La producción de plantas compuestas con raíces transgénicas y tallos y yemas no transgénicos utilizando la transformación de raíces pilosas mediada por Agrobacterium rhizogenes es una herramienta poderosa para estudiar la biología relacionada con las raíces. La transformación de la raíz pilosa se establece en una amplia gama de dicotiledóneas y en varias especies de monocotiledóneas y es casi independiente del genotipo. El método tradicional de inyección de hipocótilo con A. rhizogenes para obtener plantas compuestas es ineficiente, requiere mucho tiempo, es laborioso y con frecuencia causa la muerte de plantas de hipocótilo tiernas y diminutas. Previamente se estableció una transformación de raíz pilosa altamente eficiente de un solo paso mediada por A. rhizogenes , lo que elimina la necesidad de trasplante después de producir raíces pilosas. En este estudio, se extirpó un hipocótilo parcial y una raíz primaria, se recubrió el sitio de incisión del hipocótilo con A. rhizogenes y luego se plantaron hipocótilos en vermiculita estéril. Después de 12 días de cultivo, la incisión del hipocótilo se expandió y se indujeron nuevas raíces pilosas. Este artículo proporciona el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por A. rhizogenes, cuya eficacia se ha demostrado mediante la producción de plantas compuestas de soja silvestre, Solanum americanum y calabaza.

Introduction

Agrobacterium rhizogenes es una bacteria gramnegativa del suelo de la familia Rhizobiaceae. A. rhizogenes puede infectar casi todas las dicotiledóneas, algunas monocotiledóneas y gimnospermas individuales a través de heridas, produciendo raíces pilosas en las plantas infectadas. La bacteria es portadora del plásmido Ri (inductor de raíces), y el ADN-T del plásmido Ri es portador del gen de síntesis de opina y de los genes de rol (genes del locus de la raíz). Después de que el ADN-T del plásmido Ri entra en una célula vegetal y se integra en un cromosoma huésped, la expresión de los genes del rol induce la producción^{de raíces} pilosas. Un vector de expresión binaria de una planta portador de un gen diana se transforma en A. rhizogenes, y el A. rhizogenes transformado se utiliza para infectar una planta. Las raíces transgénicas pueden ser inducidas en plantas infectadas, produciendo plantas compuestas que contienen raíces transgénicas y tallos y yemas no transgénicos. Generalmente, una planta compuesta se puede obtener en un plazo de 14 a 20 días. La transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes generalmente no está limitada por el genotipo en las plantas dicotiledóneas². Las raíces peludas producidas por plantas infectadas con A. rizogenes se caracterizan por una tasa de crecimiento rápida, una herencia estable y una fácil operación. La transformación de la raíz pilosa mediada por A. rhizogenes se utiliza actualmente ampliamente para estudiar la biología relacionada con la raíz. Además, la transformación de las raíces pilosas también se puede utilizar para validar y optimizar la eficiencia de edición de objetivos del sistema CRISPR/Cas9 ^3,4,5 y la localización subcelular de proteínas. Por lo tanto, la transformación de la raíz pilosa es una herramienta importante en la investigación sobre la función de los genes de las plantas, la ingeniería metabólica y las interacciones entre las raíces y los microorganismos de la rizosfera ^6,7,8.

Las plantas compuestas que contienen raíces transgénicas obtenidas a través de la transformación de raíces pilosas se han producido ampliamente en plantas dicotiledóneas, especialmente en leguminosas. El método tradicional de inyectar el hipocótilo con A. rhizogenes se ha utilizado para producir Lotus corniculatus⁹, soja 10, tomate¹¹, batata¹² y muchas otras plantas ^5,8. El método de inyección de hipocótilo es ineficiente y es probable que cause la muerte de plantas jóvenes o diminutas de hipocótilo. Por lo tanto, el método se mejoró cortando las raíces embrionarias, cubriendo la incisión de la plántula con A. rhizogenes y luego colocando el hipocótilo en un medio de cultivo estéril para el cultivo de enraizamiento¹³. Sin embargo, esos pasos se realizan en un entorno estéril y los pasos de la operación son relativamente engorrosos. En particular, las plantas compuestas resultantes deben trasplantarse, lo que aumenta la cantidad de trabajo. En trabajos anteriores, se estableció la transformación de la raíz pilosa mediada por A. rizogenes (ARM) en un solo paso en pepino, soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula y tomate 2,14,15,16,17. Se eliminaron la raíz primaria y el hipocótilo parcial, el sitio de incisión del hipocótilo restante se recubrió con A. rizogenes transformado y la plántula se plantó en vermiculita estéril húmeda. Después de 12 días de cultivo, se produjeron raíces pilosas en el sitio de la incisión. El método ARM de un solo paso es altamente eficiente y requiere menos tiempo para producir raíces pilosas. Tampoco es necesario trasplantar después de formar raíces peludas. Debido a que la contaminación microbiana se puede evitar sin trasplante, el método ARM de un solo paso puede ser particularmente útil cuando se estudian las interacciones entre plantas y microorganismos, como la fijación simbiótica de nitrógeno entre plantas leguminosas y rizobios, y simbiosis entre plantas y hongos micorrícicos arbusculares. En este artículo, se proporciona un protocolo detallado de transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes de un solo paso con ejemplos de plantas compuestas producidas en soja silvestre, Solanum americanum y calabaza. Con el protocolo, los investigadores pueden realizar sin problemas la transformación de ARM en un solo paso.

Protocol

1. Condiciones de crecimiento de las plantas y cultivo de A. rhizogenes

1. Siembra de semillas
   NOTA: Se recolectaron semillas de soja silvestre en el condado de Yanggu, Liaocheng, China; Las semillas de S. americanum y la variedad local de calabaza Yinsu se compraron en un mercado.
   1. Recoja semillas de soja silvestre , S. americanum y la variedad local de calabaza, siémbralas en vermiculita a una profundidad de 1 cm y riéguelas bien. Planta 20 semillas en cajas de plástico de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivar las plantas en una cámara de crecimiento a 24 ± 2 °C con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad a aproximadamente un 70% de humedad relativa.
      NOTA: Las capas de semillas de soja silvestre deben romperse antes de la siembra. Si la pregunta de investigación se centra en las interacciones entre las plantas y los microorganismos, las semillas, la vermiculita, las cajas de plástico y el agua deben esterilizarse antes de su uso.
   2. Activación y cultivo de A. rhizogenes K599
      NOTA: La cepa K599 de A. rhizogenes tenía un vector binario pRed1305² portador de un gen reportero fluorescente rojo DsRed2.
      1. Retirar la cepa K599 de A. rhizogenes de un congelador a -80 °C y activar las bacterias en medio LB sólido (con 50 mg/L de kanamicina y 50 mg/L de estreptomicina) a 28 °C durante 48 h.
      2. Seleccionar un solo clon de la cepa K599 y cultivarlo en 1 mL de medio LB líquido que contenga antibióticos durante 12 h.
      3. Distribuir uniformemente 500 μL de la suspensión bacteriana en un medio LB sólido que contenga antibióticos, seguido de una incubación a 28 °C durante 24 h.

2. Método de transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes en un solo paso

1. Incisión de hipocótilo
   1. Después de 7 días (defina la siembra de las semillas como el día 0), los cotiledones de las plántulas acaban de desplegarse (Figura 1A), use un bisturí esterilizado y afilado para cortar aproximadamente 0,5-1 cm del hipocótilo (Figura 1B). Deseche la raíz primaria y parte del hipocótilo parcial.
      NOTA: Utilice el bisturí con cuidado.
2. Inoculación de K599
   1. Cubra la incisión del hipocótilo con la bacteria K599 (Figura 1C).
   2. Plante las plántulas en vermiculita húmeda (Figura 1D).
   3. Infecta 30 plantas de cada especie a través de la transformación de la raíz peluda mediada por A. rhizogenes. Riegue cada planta con 5 mL de suspensión bacteriana K599 resuspendida (OD₆₀₀ = 0.5-0.6) en un medio básico Gamborg B-5 de concentración de un cuarto (0.25x) (Figura 1E).
   4. Cubra las macetas con una bolsa de plástico muy transparente (Figura 1F) y colóquelas en una cámara de crecimiento.

3. Producción de raíces pilosas

1. Cultive las plantas durante ~ 12 días después de la inoculación, se inducirán y generarán nuevas raíces peludas en el sitio de la incisión. Después de 15 días, la longitud de las raíces pilosas suele alcanzar los 2-5 cm (Figura 2).
2. Para determinar si las raíces pilosas producidas son transgénicas, se examina la expresión de genes reporteros dependientes del vector transformado en K599.
   1. Detecte la expresión del gen reportero DsRed2 utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia con luz de excitación verde a 540 nm y emisión a 600 nm (Figura 2B, Figura 2D y Figura 2F).

Results

Transformación de raíces pilosas mediada por A. rizogenes en un solo paso altamente eficiente
Las raíces pilosas se produjeron en el sitio de incisión del hipocótilo 12 días después de la inoculación con K599 diseñado. Las raíces pilosas transgénicas se determinaron a partir de la expresión del gen reportero contenido en el vector binario. Se observaron raíces transgénicas transformadas con el gen reportero DsRed2 de soja silvestre compuesta, S. americanum y calabaza bajo lu...

Discussion

El método de raíz pilosa mediada por A. rizogenes en un solo paso es un método más simple y eficiente para producir plantas compuestas que el método de inyección de hipocótilo. El método ARM de un solo paso mejora significativamente la eficiencia de la transformación de las raíces pilosas, acorta el tiempo para producir raíces pilosas, aumenta el número de raíces pilosas y reduce la cantidad de trabajo involucrado. El protocolo de transformación mejorado es óptimo para estudios de simbiosis entre leguminosas y r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
kanamicina	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
LB medio	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
caja de plástico	LiaoSu		8 cm x 11 cm x 9 cm
calabaza			variedad local Yinsu
estreptomicina	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610494
Tanon-5200Multi máquina	Tanon Co., Ltd., China	5200Sistema	imagen de quimioluminiscencia
tomate			variedad local Zhongshu4
soja			recolectada en el condado de Yanggu, Liaocheng, China