Method Article

Modelado de nicho neurovascular de organoides cerebrales humanos tempranos no guiados en la membrana corioalantoidea permisiva del embrión de pollo

DOI:

10.3791/65710

⸱

February 16th, 2024

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1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

In This Article

Summary

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Aquí, presentamos un protocolo para injertar organoides cerebrales humanos en múltiples etapas de maduración en la membrana corioalantoidea (CAM) del pollo. Los organoides cerebrales se cultivaron siguiendo protocolos estandarizados no guiados.

Abstract

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El injerto de organoides en tejidos vascularizados en animales modelo, como la membrana corioalantoidea (CAM) inmunodeficiente de ratones o embriones de pollo, ha demostrado ser eficaz para el modelado de la neovascularización. La MCA es una membrana extraembrionaria ricamente vascularizada, que muestra una inmunorreactividad limitada, convirtiéndose así en un excelente modelo de hospedaje para trasplantes de células de origen humano.

En este trabajo se describe la estrategia para injertar organoides cerebrales humanos diferenciados en múltiples etapas de maduración en la CAM. La composición celular de los organoides cerebrales cambia con el tiempo, reflejando los hitos del desarrollo del cerebro humano. Injertamos organoides cerebrales en etapas de maduración relevantes: expansión neuroepitelial (18 DIV), neurogénesis temprana (60 DIV) y gliogénesis temprana (180 DIV) en la MCA de embriones embrionarios de pollo del día (E)7. Los organoides cerebrales injertados se recolectaron 5 días después y se analizaron sus características histológicas.

No se detectaron signos histológicos de neovascularización en los organoides injertados ni vasos sanguíneos anormales adyacentes a los injertos. Además, se observaron cambios notables en la composición celular de los organoides injertados, a saber, un aumento en el número de astrocitos gliales fibrilares ácidos positivos reactivos a proteínas. Sin embargo, los cambios citoarquitectónicos dependieron de la etapa de maduración de los organoides. En conjunto, estos resultados sugieren que los organoides cerebrales pueden crecer en la MCA y muestran diferencias en la citoarquitectura dependiendo de su etapa de maduración en el momento del injerto.

Introduction

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Los organoides cerebrales humanos son una técnica emergente que permite recapitular in vitro el desarrollo temprano del cerebro humano 1,2,3. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este modelo es la falta de vascularización, que desempeña un papel indispensable no solo en la homeostasis cerebral, sino también en el desarrollo cerebral4. Además del suministro de oxígeno y nutrientes, la evidencia acumulada sugiere que el sistema vascular del cerebro regula la diferenciación neuronal, la migración y la sinaptogénesis durante el desarrollo 5,6. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer modelos confiables que puedan proporcionar la señalización vascular y la estructura faltantes a los organoides cerebrales, lo que aumenta la complejidad de la generación de organoides cerebrales humanos7.

Entre los métodos propuestos para la vascularización, se pueden considerar dos líneas principales: el injerto de organoides en un organismo vivo y las tecnologías puramente in vitro que cocultivan células endoteliales y células neurales 8,9,10,11,12. El trasplante intracerebral en ratones es costoso y requiere mucho tiempo, lo que hace que otras tecnologías sean relevantes para modelos más simples. El ensayo de membrana corioalantoidea de pollitos (CAM) se ha utilizado ampliamente para estudiar la angiogénesis 13,14,15. En la última década, varios grupos han injertado con éxito diferentes tipos de organoides, incluidos el riñón16,17, el cardíaco18 y los organoides tumorales19,20, en CAM. Sin embargo, se sabe poco sobre la eficacia, la toxicidad/rechazo, el efecto fisiológico y los métodos para injertar organoides cerebrales humanos en la MCA. Otro aspecto interesante y aún inexplorado es la formación de una barrera hematoencefálica quimérica (BHE) entre la MCA y la interfase astrocítica organoide. Trabajos pioneros previos sugirieron la viabilidad putativa de generar una BHE en la MCA mediante el trasplante de astrocitos y medio condicionado por astrocitos 21,22,23. Sin embargo, los astrocitos maduros parecen ser incapaces de lograrlo24,25. Por lo tanto, la formación de la BHE inducida por astrocitos sigue siendo discutible, y el trasplante de organoides cerebrales humanos nos permitiría arrojar luz sobre esta controversia.

Este artículo de video describe un protocolo para un trasplante in ovo de organoides cerebrales humanos en MCA que promueve el crecimiento, la mejora y la vascularización, lo que da como resultado organoides que abarcan elementos de BHE histológicamente compatibles. Aquí, presentamos un protocolo que garantiza la supervivencia del embrión de pollo e informamos sobre la permisividad de la MCA para mantener el crecimiento de organoides cerebrales.

Protocol

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Los embriones de pollo Leghorn blanco (Gallus gallus) fueron tratados siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos para Animales de Laboratorio, Comisión de Ciencias de la Vida, Consejo Nacional de Investigación, EE.UU., y los experimentos fueron aprobados por el Consejo para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación de la Universidad de Barcelona.

1. Preparación no guiada de organoides cerebrales

  1. Mantener células madre embrionarias humanas (hESCs) H9 en mTESR1 precalentadas a temperatura ambiente (RT) bajo una confluencia del 70% en placas de 6 pocillos recubiertas con Matrigel disueltas en DMEM (1:40) en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.
    NOTA: Matrigel debe mantenerse en hielo hasta su uso como recubrimiento para evitar su polimerización.
  2. Generar organoides cerebrales siguiendo el protocolo cerebral no guiado 2.
    1. Disociar las hESCs H9 utilizando 500 μL de la solución de disociación celular e incubar durante 3-5 min a 37 °C. Resuspender en mTESR1 que contiene un inhibidor de ROCK Y27632 (concentración final 50 μM) y sembrar 9.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos pretratada de baja adherencia.
    2. Una vez que los organoides se agregan en mTESR1 que contiene un inhibidor de ROCK Y27632 (concentración final de 50 μM), transfiéralos a un medio de inducción durante 5-6 días.
    3. Siguiendo el protocolo de organoides cerebrales no guiados26, transfiera los organoides a los medios de inducción neural a los ~ días 4-5.
    4. Una vez que adquieran el tamaño y el anillo de neuroepitelio, transfiéralos a una gota de Matrigel helada. Una vez polimerizado el Matrigel, transfiera los organoides a una placa de Petri de baja adherencia de 5 cm con 5 mL de medio de maduración precalentado.
    5. Después de 4 días, ponga los organoides cerebrales bajo agitación orbital.
  3. Recoja los organoides para cosecharlos en DPBS frescos inmediatamente antes del injerto.

2. Mantenimiento del huevo, activación del desarrollo y punción de la cáscara del huevo

  1. Almacenar los óvulos fecundados (en el día 0) en una incubadora a 18 °C hasta su uso.
    NOTA: A esta temperatura, no se desarrollan, permaneciendo en la misma etapa de maduración.
  2. Cuando sea necesario para su uso, incubarlos a 38 °C y 60% de humedad relativa con una rotación de balanceo suave en un ángulo de 45 °C.
  3. El día 1, limpie la superficie de la cáscara de huevo con etanol al 70% y séquela con una toalla de papel para esterilizarla.
  4. Coloque un vendaje adhesivo de papel quirúrgico, en lo sucesivo denominado "vendaje", encima del huevo, cubriendo la cámara de aire del huevo.
    NOTA: Esto evitará que el polvo de la cáscara de huevo caiga en el CAM donde se atasca.
  5. Realice la punción de perforación de la cámara de aire, en lo sucesivo denominada orificio de la cámara de aire (ACH), con una aguja estéril de 21 G x 11/2 '', perforando suavemente la cáscara del huevo. Abra el ACH en la punta superior del huevo para evitar perturbar el CAM, que en este punto se encuentra separado de la cáscara.
  6. Para encontrar la mejor posición para perforar el ACH, use una lámpara para determinar la superficie más delgada de la cáscara del huevo en la punta superior del huevo. La transmisión directa del haz de luz indica la mejor posición para perforar.
  7. Cubra la ACH con un vendaje nuevo para proteger el embrión del ambiente externo y vuelva a colocar el huevo en la incubadora.
  8. A partir de este momento, cesa la rotación en la incubadora y mantén los huevos en posición vertical con la ventana en la parte superior.
    NOTA: Esto facilitará el desarrollo del embrión, y la MCA estará disponible en la parte superior con una cámara de aire entre el embrión y la cáscara del huevo, lo que permitirá el injerto posterior.
  9. Abra el ACH desde el día 1 hasta el día 4. La viabilidad aumenta el día 4 (3 días antes del día del injerto).

3. Injerto de organoide cerebral

  1. Realizar el injerto en el día 7 cuando la MCA esté bien desarrollada y vascularizada, cubriendo el óvulo por todo el embrión.
  2. Retire el vendaje y limpie la superficie de la cáscara de huevo con etanol al 70% para esterilizar la cáscara de huevo, antes de ensanchar cuidadosamente la ACH en una ventana de injerto.
  3. Coloque un vendaje nuevo y más grande que cubra la extensión más allá de la ventana de injerto final para evitar que los fragmentos de cáscara de huevo caigan en la CAM mientras se agranda la ventana de injerto.
    NOTA: Esta ventana más grande es necesaria para seleccionar la mejor posición de injerto y para el injerto posterior.
  4. Amplíe la ventana de injerto perforando suavemente la cáscara del huevo hasta que la ventana alcance un diámetro de aproximadamente 2 cm. Retire suavemente los bordes de la ventana de cáscara de huevo con unas pinzas hasta que la ventana se agrande. Retire el polvo restante y los trozos de cáscara de huevo que permanecerán adheridos al vendaje despegando suavemente el vendaje.
  5. Coloque el organoide con una pipeta automática P200. Corte las puntas con tijeras estériles y afiladas para agrandar la abertura de acuerdo con el tamaño del organoide y evitar daños al organoide o use puntas estériles de transferencia de calibre ancho. Recoger el organoide en un volumen máximo de 50 μL de PBS y transferirlo directamente al CAM, en un lado opuesto a la ubicación del embrión.
  6. Asegúrese de que la posición del injerto esté alejada de la yema para evitar su ruptura durante la recolección y, preferiblemente, colóquelo cerca de un vaso sanguíneo.
  7. Coloque una gota de 7 μL de Matrigel alrededor del organoide después de colocar el organoide en el CAM.
    NOTA: Esto evitará que el organoide se mueva alrededor de la membrana.
  8. Cierre la ventana con un pequeño trozo de parafilm que se ajuste al tamaño exacto de la ventana y fíjelo a la carcasa con un vendaje adhesivo.
    NOTA: Es importante cubrir completamente la ventana con el parafilm para evitar que el embrión se seque y permitir el intercambio de gases. Delimitar adecuadamente la extensión de la cobertura de la ventana, evitando exceder la ventana, ya que podría dificultar el intercambio gaseoso necesario para el correcto desarrollo embrionario27.

4. Recolección de organoides trasplantados

  1. Cosechar los organoides injertados y la CAM circundante en el día 12 de desarrollo de los pollos, correspondiente a la etapa de desarrollo de 38 Hamburguesas y Hamilton (HH38)28, 5 días después del injerto. En esta etapa, la MCA está completamente diferenciada con la vasculatura madura, mientras que los gérmenes de las plumas cubren las alas y el párpado superior del embrión.
  2. Al retirar el vendaje adhesivo, amplíe aún más la ventana para facilitar la recolección de muestras con tijeras y pinzas finas.
  3. Visualice el organoide con la ayuda de una microscopía de disección binocular si es necesario, seguido de un paso de prefijación de 2 minutos con paraformaldehído (PFA) al 4% para ayudar a la recolección del organoide y CAM.
  4. Recoja una sección de1,5 cm 2 del CAM que contenga el organoide.
  5. Fijación de la muestra
    1. Lavar las muestras con 1x PBS y fijarlas con PFA al 4% (en PBS, pH 7,2) durante 30 min a 4 °C. A continuación, lave las muestras durante 3 x 5 min en PBS.
    2. Almacenar las muestras a 4 °C en PBS con azida sódica o crioprotegerlas directamente en sacarosa-PBS al 30% durante la noche a 4 °C.
    3. Tras la crioprotección, incruste las muestras en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y guárdelas a -20 °C hasta el corte. Cortar rodajas de tejido de 20 μm de grosor con un criostato y recogerlas en portaobjetos xilanizados. Guarde los portaobjetos a -20 °C hasta que se utilicen para teñir.

5. Inmunofluorescencia

  1. Retire la OCT de las secciones con una solución de PBS con Triton X-100 (PBS-T) al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
  2. Tratar las secciones con una solución de bloqueo (BS) con una solución de PBS-T al 0,01% de suero de burro al 2% y al 3% durante 1 h en RT.
  3. Diluir el anticuerpo primario seleccionado (ver la Tabla de Materiales) en BS e incubar las muestras durante la noche a 4 °C.
  4. Al día siguiente, lave las muestras 3 x 10 min en 1x PBS en RT.
  5. Diluir el anticuerpo secundario en BS e incubar durante 2 h a RT (ver Tabla de Materiales).
  6. Incubar las muestras durante 10 min con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar los núcleos celulares en RT, diluido en PBS-T a una dilución de 1:1.000.
  7. Monte las guías con un medio de montaje y cúbralas con cubreobjetos de vidrio.
  8. Tome todas las imágenes con un microscopio de fluorescencia de campo amplio a 2,5, 10, 20 y 40x.
  9. Conservar las lonchas a 4 °C.

6. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

NOTA: Para comprobar que el injerto funcionó, realice la tinción H&E.

  1. Eliminar OCT con PBS-T 0.1% durante 10 min en RT.
  2. Realice la deshidratación en serie en una campana de la siguiente manera: 10 min en agua destilada (DW), 45 s en hematoxilina, 1 min en DW, 20 s en PBS, 2 x 30 s en EtOH al 70%, 2 x 30 s en EtOH al 80%, 2 x 30 s en EtOH al 96%, 30 s en eosina, 2 x 15 s en EtOH al 96%, 2 x 15 s en 100% EtOH, 1 min en xilol-100% ETOH, 1 min en xilol, 1 min en xilol (fresco).
  3. Monte los cubreobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de xileno.

Results

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Selección del programa de maduración embrionaria para el trasplante
El experimento comienza en D0 cuando los huevos fertilizados se incuban a 38 °C y 60% de humedad relativa. La membrana corioalantoidea (MCA) es una membrana extraembrionaria altamente vascularizada que se desarrolla después de la incubación de los huevos. Está formado por la fusión de los alantoides y el corion. En D1, después de 24 h de incubación, la cámara de aire se perfora para evitar que el CAM se adhiera a la membrana interna de la capa. La perforación de la cámara de aire en D1 mejora la calidad de la cámara de aire en comparación con la punción en etapas posteriores (D4). El CAM continúa creciendo hasta D12, cuando envuelve todo el contenido del huevo y se adhiere firmemente a la membrana interna de la cáscara (Figura 1). El orificio realizado en D7 se amplía para facilitar la recolección de muestras. D7 es el momento óptimo para el injerto cuando la MCA alcanza la madurez y cubre el saco vitelino y la superficie embrionaria. En esta etapa, el orificio de la cámara de aire se agranda y los organoides se transfieren a la CAM con la ayuda de una pipeta automática.

Injerto de organoide cerebral
A lo largo de la maduración inherente de los organoides cerebrales in vitro, su composición celular cambia de progenitores neurales a neuronas maduras y células gliales. La neurovasculatura y la neurogénesis son procesos de desarrollo entremezclados e interdependientes en los vertebrados, y la señalización que conduce a esta diafonía depende en gran medida de la etapa de maduración de la contraparte neural29. Los progenitores neurales son la principal fuente de factores proangiogénicos en el cerebro en desarrollo29,30. Por el contrario, las neuronas y los astrocitos apoyan la neoangiogénesis en etapas maduras y en la edad adulta a través de la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular31,32. Estos cambios en la citoarquitectura cerebral, que también se reflejan en los organoides cerebrales, podrían conducir a cambios diferenciales en la integración y respuesta al injerto CAM, dependiendo de la etapa de maduración de los organoides cerebrales. Por lo tanto, injertamos organoides cerebrales en el día 13 de diferenciación in vitro (DIV), cuando las células neuroepiteliales y la glía radial se expanden; en la DIV 37, al inicio de la neurogénesis; en la DIV 60, cuando la neurogénesis es robusta y las neuronas de diferentes identidades están terminalmente diferenciadas; y en DIV 120, cuando una plétora de neuronas maduras está poblando el organoide, generando una red neuronal bien desarrollada y la astrogénesis también está muy extendida.

En todos los casos, las muestras se recolectaron después de 5 días de incubación in ovo (DIO). Para evitar sesgos debidos al efecto lote en organoides cerebrales, todas las comparaciones entre organoides injertados y no injertados se realizaron en el mismo lote de manera por pares. Los organoides se derivaron de al menos dos experimentos independientes por punto de tiempo y un total de seis diferenciaciones independientes. El injerto de múltiples etapas de maduración se realizó en paralelo en cada experimento de injerto. Tras el injerto, los organoides continuaron el proceso de maduración adyacente a los vasos CAM sin ninguna evidencia de infiltración de vasos sanguíneos en el organoide (Figura 2).

La supervivencia de los organoides tras el injerto oscila entre el 80% en los más jóvenes y desciende a ~66% en los organoides maduros después de 5 días después del injerto, lo que sugiere que la permisividad y la plasticidad del injerto de organoides pueden cambiar con el tiempo (Tabla 1). La viabilidad del organoide se determinó por la presencia de núcleos picnóticos en las tinciones de H&E. El número de núcleos picnóticos fue similar entre los organoides de control trasplantados y no trasplantados (Figura 3), lo que sugiere que la MCA es permisiva para mantener el organoide vivo tras el trasplante. Además, no se detectó ninguna liberación histológica o hemogénica en el MCA, y los embriones permanecen vivos, lo que sugiere que ni el procedimiento de injerto ni el organoide alteran la integridad del MCA ni afectan significativamente el desarrollo embrionario.

Composición celular en organoides cerebrales injertados
Los organoides cerebrales no guiados tienen una marcada variabilidad celular inter e intraorganoide. Sin embargo, son predominantemente neuronales, generando ondas de progenitores, neuronas y astrocitos a un ritmo secuencial 2,26. A continuación, evaluamos si el injerto altera la composición neuronal en los organoides cerebrales. Los organoides más jóvenes (13 DIV + 5 DIO: 18 días) no muestran diferencias con respecto a sus organoides control no injertados en presencia de neuronas (TUBB3+). En etapas de maduración más tardías (60 DIV + 5 DIO: 65 días y 120 DIV + 5 DIO: 125 días), la proporción de neuronas (TUBB3+) disminuye drásticamente en comparación con la de los organoides no injertados (Figura 4). En los organoides no injertados madurados para 60 DIV, las neuronas están ampliamente distribuidas alrededor de los organoides.

Cabe destacar que el número y localización de astrocitos gliales fibrilares positivos para proteínas ácidas (GFAP+), evidenció un aumento en comparación con los observados en los controles no injertados. Además, estos astrocitos GFAP+ adquirieron una localización inesperada en la cara externa del organoide. En 18 DIV, organoides libres (no injertados), se observan pocos astrocitos y no se detecta distribución estructural; por el contrario, aparecen distribuidos homogéneamente por todo el organoide (Figura 3).

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Figura 1: Cronograma de la configuración del ensayo CAM para el trasplante de organoides. (A) Aplicación de vendaje adhesivo de papel quirúrgico en la parte superior del óvulo. (B) Hacer un agujero en la carcasa con una aguja sobre el vendaje adhesivo. (C) Abra la ventana de la cáscara del huevo, vista desde arriba, lista para el trasplante de un organoide cerebral humano (D) (día 60). Barra de escala = 100 μm. (E) Visualización del organoide injertado en la CAM después de 5 días de incubación in ovo . (F) Características del desarrollo de organoides cerebrales desde el día 0 hasta el día 120. La flecha indica la ubicación del organoide. Abreviatura: CAM = membrana corioalantoidea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Tinción de hematoxilina y eosina de organoides injertados en la membrana corioalantoidea. (A) 13 organoides DIV + 5 DIO; (B) organoide 37 DIV + 5 DIO; (C) organoide 60 DIV + 5 DIO; y (D) organoide 120 DIV + 5 DIO; Los cuadrados rojos marcan el organoide. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: DIV = día in vitro; DIO = día en ovo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Inmunocitoquímica de organoides en diferentes etapas de desarrollo. Se utilizó GFAP para la tinción y DAPI para los núcleos. Barra de escala = 100 μm. (A,B) Imágenes del mismo organoide injertado de 13 DIV + 5 DIO donde se ven astrocitos alrededor del borde del organoide. (C) Imagen de 18 organoides libres de DIV donde los astrocitos son apenas visibles. La diferencia entre organoides libres e injertados es muy notable. (D,E) Imágenes de organoide injertado de 37 DIV + 5 DIO donde se aprecian pocos astrocitos. (F) Imagen de 42 organoides libres de DIV. Las flechas amarillas indican la ubicación de los astrocitos. Abreviaturas: DIV = día in vitro; DIO = día en ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFAP = proteína ácida fibrilar glial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Inmunocitoquímica de 120 organoides DIV. Se utilizó TUBB3 para teñir las neuronas y DAPI para los núcleos. Barra de escala = 100 μm; Las imágenes se tomaron a 20x. (A) Un organoide injertado de 120 DIV +5 DIO donde se pueden ver pocas neuronas. (B) Un organoide libre de 125 DIV con muchas neuronas. El asterisco indica la ubicación del organoide, mientras que la línea discontinua representa el límite entre el organoide y la MCA (determinado por análisis histológico). Abreviaturas: DIV = día in vitro; DIO = día en ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; CAM = membrana corioalantoidea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Organoides13 DIV37 DIV60 DIV120 DIV
Vivo6 (75%)10 (83%)6 (66%)6 (66%)
Muerto2 (25%)2 (16%)3 (34%)3 (34%)

Tabla 1: Tasas de supervivencia embrionaria tras el injerto de organoides CAM. Abreviaturas: DIV = día in vitro; DIO = día en ovo; CAM = membrana corioalantoidea.

Discussion

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En este estudio, describimos un protocolo detallado con numerosos pasos clave que proporcionan un crecimiento y desarrollo favorable de los organoides del cerebro humano tras el injerto sin perturbar la supervivencia de los embriones de pollo. Se recomendó el uso de agujas estériles para perforar la cámara de aire del huevo después de 24 h de incubación (día 1). Además, también intentamos hacer la punción en el día 4 (después de revisar la cáscara del huevo con luz para probar el desarrollo de la vasculatura y asegurarnos de que estábamos trabajando solo con embriones sanos). Sin embargo, esto resultó en una disminución de la viabilidad embrionaria debido a la proximidad de los vasos CAM a la cáscara del huevo. Hay que tener en cuenta que aplicar demasiada fuerza puede provocar la rotura de la cáscara del huevo con el consiguiente daño de la vasculatura CAM. El uso de una fuente de luz para detectar áreas adelgazadas de la cáscara del huevo fue útil para hacer agujeros romos y, al mismo tiempo, evitar la sobrepenetración y el paso a través del huevo, lo que llevó a la invasión de la CAM.

A pesar de que la rotación de los huevos parece obligatoria para el correcto desarrollo de los embriones de pollo durante la incubación, es necesario evitarla después de perforar la cámara de aire. La eliminación de la albúmina no estaba justificada para este modelo, ni tampoco la adición de PBS para evitar la deshidratación del óvulo. Además, el uso de una solución de etanol al 70% debe hacerse con prudencia, con especial cuidado de secar cualquier solución de etanol restante en la cáscara para preservar la viabilidad embrionaria. Otro punto crítico es el tamaño del orificio de la cáscara de huevo utilizado para el injerto, que requiere equilibrar el orificio más pequeño posible que permita la comodidad de la manipulación del injerto. La selección del estadio embrionario para los injertos (E7) fue impulsada por el estadio de maduración de la MCA y su tamaño relativo, favoreciendo la integración del trasplante. Sin embargo, en el eventual caso de que los organoides trasplantados requieran más tiempo en la ovomaduración, el injerto se puede realizar en el día E5.5/6. Se controla la variabilidad de los organoides cerebrales para garantizar la viabilidad experimental. Los organoides de la misma edad presentan tamaños similares, y es importante tener en cuenta que, independientemente de la edad de los organoides, todos fueron incubados durante 5 días después del trasplante. Además, para mantener la consistencia, los organoides de control se eligieron meticulosamente para que coincidieran con el tamaño exacto de sus homólogos injertados. Otro aspecto técnico, relevante para apoyar la supervivencia tanto de los organoides injertados como del embrión, es cerrar el orificio de injerto con una pieza cuadrada de parafilm, para mantener un ambiente in ovo controlado.

Contrariamente a nuestras hipótesis iniciales, los organoides jóvenes sobrevivieron mejor después del proceso de injerto y la integración de CAM que los más viejos. Planteamos la hipótesis de que los organoides más jóvenes son más plásticos debido a su presencia enriquecida en los progenitores en etapa temprana33, mientras que las neuronas maduras requieren un entorno neuronal permisivo para su mantenimiento. Además, se detectaron cambios citoarquitectónicos en los injertos tempranos (D18) de organoides cerebrales en la distribución de los astrocitos. En particular, detectamos que los astrocitos se diferenciaban en esta etapa temprana solo cuando se injertaban y se distribuían para generar una pseudocápsula debajo de la superficie del organoide. Esta estructura podría ser una reminiscencia del potencial del organoide para generar una interfaz neurovascular que podría imitar a la BHE. Alternativamente, el aumento de la reactividad de los astrocitos, colocados en una estructura similar a una barrera, podría ser indicativo de una respuesta inmunogénica del organoide a la señalización secretada por el CAM. Sin embargo, se necesita más trabajo para demostrar esta hipótesis. En resumen, en este trabajo se describen los pasos para injertar organoides de múltiples etapas de desarrollo en la MCA de pollo, siendo una situación más permisiva para organoides de desarrollo temprano, y el efecto celular de estos injertos en neuronas y GFAP.

Disclosures

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Los autores no reportan ningún conflicto de intereses.

Acknowledgements

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Agradecemos al Dr. Alcántara y al Dr. Ortega de la UB y al resto de los miembros del laboratorio del Dr. Acosta por las esclarecedoras discusiones. S.A. es profesor ayudante doctor de la Generalitat de Catalunya en la Universitat de Barcelona.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-TUBB3 [Tuj1], ratón BioLegend8012011:1.000
Anti-GFAP, conejoGeneTexGTX1087111:500
Anti-conejo AlexaFluor 488, cabra.InvitrogenA-212061:1.000
Anti-ratón AlexaFluor 594, cabraJackson ImmunoResearch715-585-1501:500
Huevos fertilizados de gallina Leghorn Blanco (Gallus gallus)Granja Gibert (Cambrils, España)
DAPIInvitrogenD13061:10.000
DPXSigma100579medio de montaje a base de xileno 
Solución de disociación suaveCreativeBiolabsITS-0622-YT187solución de disociación celular
MatrigelBD Biosciences356234
Mowiol 4-88 medios de montajeMerk81381
Toalla de papel, de laboratorioSigma-AldrichZ188956
inhibidor de ROCK Y27632MilliporeSCM07510 nM
tijera quirúrgica de punta afiladaVWR470106-340
Superfrost Plus portaobjetos de microscopio de adherenciaEprediaJ1800AMNZ

References

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