Aquí, presentamos un protocolo para injertar organoides cerebrales humanos en múltiples etapas de maduración en la membrana corioalantoidea (CAM) del pollo. Los organoides cerebrales se cultivaron siguiendo protocolos estandarizados no guiados.
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Artículo de método
Modelado de nicho neurovascular de organoides cerebrales humanos tempranos no guiados en la membrana corioalantoidea permisiva del embrión de pollo
En este artículo
Resumen
Resumen
El injerto de organoides en tejidos vascularizados en animales modelo, como la membrana corioalantoidea (CAM) inmunodeficiente de ratones o embriones de pollo, ha demostrado ser eficaz para el modelado de la neovascularización. La MCA es una membrana extraembrionaria ricamente vascularizada, que muestra una inmunorreactividad limitada, convirtiéndose así en un excelente modelo de hospedaje para trasplantes de células de origen humano.
En este trabajo se describe la estrategia para injertar organoides cerebrales humanos diferenciados en múltiples etapas de maduración en la CAM. La composición celular de los organoides cerebrales cambia con el tiempo, reflejando los hitos del desarrollo del cerebro humano. Injertamos organoides cerebrales en etapas de maduración relevantes: expansión neuroepitelial (18 DIV), neurogénesis temprana (60 DIV) y gliogénesis temprana (180 DIV) en la MCA de embriones embrionarios de pollo del día (E)7. Los organoides cerebrales injertados se recolectaron 5 días después y se analizaron sus características histológicas.
No se detectaron signos histológicos de neovascularización en los organoides injertados ni vasos sanguíneos anormales adyacentes a los injertos. Además, se observaron cambios notables en la composición celular de los organoides injertados, a saber, un aumento en el número de astrocitos gliales fibrilares ácidos positivos reactivos a proteínas. Sin embargo, los cambios citoarquitectónicos dependieron de la etapa de maduración de los organoides. En conjunto, estos resultados sugieren que los organoides cerebrales pueden crecer en la MCA y muestran diferencias en la citoarquitectura dependiendo de su etapa de maduración en el momento del injerto.
Introducción
Los organoides cerebrales humanos son una técnica emergente que permite recapitular in vitro el desarrollo temprano del cerebro humano 1,2,3. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este modelo es la falta de vascularización, que desempeña un papel indispensable no solo en la homeostasis cerebral, sino también en el desarrollo cerebral4. Además del suministro de oxígeno y nutrientes, la evidencia acumulada sugiere que el sistema vascular del cerebro regula la diferenciación neuronal, la migración y la sinaptogénesis durante el desa....
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Protocolo
Los embriones de pollo Leghorn blanco (Gallus gallus) fueron tratados siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos para Animales de Laboratorio, Comisión de Ciencias de la Vida, Consejo Nacional de Investigación, EE.UU., y los experimentos fueron aprobados por el Consejo para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación de la Universidad de Barcelona.
1. Preparación no guiada de organoides cerebrales
- Mantener células madre embrionarias humanas (hESCs) H9 en mTESR1 precalentadas a temperatura ambiente (RT) bajo una confluencia del 70% en placas de 6 pocill....
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Resultados
Selección del programa de maduración embrionaria para el trasplante
El experimento comienza en D0 cuando los huevos fertilizados se incuban a 38 °C y 60% de humedad relativa. La membrana corioalantoidea (MCA) es una membrana extraembrionaria altamente vascularizada que se desarrolla después de la incubación de los huevos. Está formado por la fusión de los alantoides y el corion. En D1, después de 24 h de incubación, la cámara de aire se perfora para evitar que el CAM se adhiera a la membrana interna d.......
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Discusión
En este estudio, describimos un protocolo detallado con numerosos pasos clave que proporcionan un crecimiento y desarrollo favorable de los organoides del cerebro humano tras el injerto sin perturbar la supervivencia de los embriones de pollo. Se recomendó el uso de agujas estériles para perforar la cámara de aire del huevo después de 24 h de incubación (día 1). Además, también intentamos hacer la punción en el día 4 (después de revisar la cáscara del huevo con luz para probar el desarrollo de la vasculatura y asegurarno.......
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Divulgaciones
Los autores no reportan ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Alcántara y al Dr. Ortega de la UB y al resto de los miembros del laboratorio del Dr. Acosta por las esclarecedoras discusiones. S.A. es profesor ayudante doctor de la Generalitat de Catalunya en la Universitat de Barcelona.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-TUBB3 [Tuj1], ratón | BioLegend | 801201 | 1:1.000 |
| Anti-GFAP, conejo | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-conejo AlexaFluor 488, cabra. | Invitrogen | A-21206 | 1:1.000 |
| Anti-ratón AlexaFluor 594, cabra | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Huevos fertilizados de gallina Leghorn Blanco (Gallus gallus) | Granja Gibert (Cambrils, España) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10.000 |
| DPX | Sigma | 100579 | medio de montaje a base de xileno |
| Solución de disociación suave | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | solución de disociación celular |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 medios de montaje | Merk | 81381 | |
| Toalla de papel, de laboratorio | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| inhibidor de ROCK Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| tijera quirúrgica de punta afilada | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus portaobjetos de microscopio de adherencia | Epredia | J1800AMNZ |
Referencias
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in....
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Reimpresiones y permisos
