Method Article

Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

DOI:

10.3791/65722

⸱

January 12th, 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre mesenquimales (MSC) han sido ampliamente estudiadas como un nuevo enfoque terapéutico, principalmente para detener la inflamación exacerbada debido a su potencial para modular la respuesta inmune. Las MSC son células inmunoprivilegiadas capaces de sobrevivir en receptores de trasplantes alogénicos inmunológicamente incompatibles basados en la baja expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y en el uso de terapia basada en células para el trasplante alogénico. Estas células se pueden aislar de varios tejidos, siendo los más utilizados la médula ósea y los tejidos adiposos. Proporcionamos un protocolo sencillo para aislar, cultivar y caracterizar MSC a partir de tejido adiposo epididimario de ratones. El tejido adiposo del epidídimo se extirpa quirúrgicamente, se fragmenta físicamente y se digiere con una solución de colagenasa tipo II al 0,15%. A continuación, se cultivan y expanden in vitro células madre derivadas de tejido adiposo primario (ADSC), y se realiza la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo. También proporcionamos los pasos para diferenciar las ADSC en células osteogénicas, adipogénicas y condrogénicas, seguidas de la caracterización funcional de cada linaje celular. El protocolo proporcionado aquí se puede utilizar para experimentos in vivo y ex vivo y, como alternativa, las células madre derivadas del tejido adiposo se pueden utilizar para generar células inmortalizadas similares a las MSC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre mesenquimales (MSC) son células adultas multipotenciales que se diferencian en células como osteoblasto, condroblasto y adipocito 1,2. Estas células residen en varios órganos, por lo que pueden extraerse de tejidos adultos como la médula ósea, el músculo, la grasa, el folículo piloso, la raíz del diente, la placenta, la dermis, el pericondrio, el cordón umbilical, el pulmón, el hígado y el bazo 3,4.

Se han descrito los efectos de las MSCs sobre la fisiología y el sistema inmune 5,6. Estas células han sido prometedoras para el tratamiento de varias enfermedades, tanto en medicina humana como veterinaria. Las MSCs pueden controlar la inflamación y promover la angiogénesis y la homeostasis tisular a través de diferentes mecanismos, como el contacto célula-célula, los factores solubles y las pequeñas vesículas extracelulares 7,8,9,10. Además, las MSCs son células inmunoprivilegiadas capaces de sobrevivir en receptores de trasplantes alogénicos inmunológicamente incompatibles, ya que estas células muestran una baja expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y se utilizan en la terapia celular para el trasplante alogénico11,12. La baja inmunogenicidad combinada con el potencial regenerativo hace que las MSC sean candidatas ideales para la terapia celular, como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH)13, el lupus eritematoso sistémico (LES)14 y la esclerosis múltiple15, entreotras16,17.

A pesar de que las MSC residen en varios tejidos adultos, el tejido adiposo ofrece ventajas sobre otras fuentes, como la accesibilidad para la recolección, con una intervención quirúrgica mínima; gran número de celdas disponibles con alta tasa de expansión; y fácil expansión in vitro mediante un protocolo fácil de realizar sin necesidad de equipos específicos y materiales de bajo costo 18,19,20. Una vez extraídas, las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) deben ser caracterizadas según lo establecido por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT)21. Así, las MSC deben mostrar una morfología similar a la de los fibroblastos, adherencia al cultivo plástico, expresando un alto porcentaje (≥95%) de marcadores mesenquimales como endoglina (CD105), ecto-5'-nucleotidasa (CD73) y Thy-1 (CD90), y bajo porcentaje (≤2%) de marcadores hematopoyéticos como el antígeno común leucocitario (CD45), la fosfoglicoproteína transmembrana (CD34), la glicoproteína de membrana anclada a glicolípidos (CD14), la integrina alfa M (CD11b), la cadena alfa de la proteína asociada al complejo de antígenos de células B (CD79α) o Antígeno de superficie de linfocitos B B4 (CD19) y antígeno leucocitario humano de clase II (HLA-II). Además, se requiere una caracterización funcional y las células deben ser capaces de diferenciarse en células osteoblásticas, condroblastas o adipoblastas21.

En este trabajo se muestra cómo obtener las MSCs a partir de tejido adiposo del epidídimo mediante disociación mecánica y digestión enzimática para estudios in vitro y la caracterización morfológica preconizada por ISCT.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los lineamientos internacionales de ética animal y fueron aprobados por comités institucionales de cuidado y uso de la Universidad Estatal de Santa Cruz bajo el protocolo número 021/22. Se adquirieron ratones machos suizos (6-8 semanas) del Laboratorio de Crianza, Mantenimiento y Experimentación Animal del Centro de Investigación Animal de la Universidad Estatal de Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos, recibiendo agua y alimento ad libitum con ciclos de luz/oscuridad de 12 h.

NOTA: Se puede utilizar otro linaje de ratones; Recomendamos el uso de ratones adultos (6-8 semanas) ya que tienen más desarrollado tejido adiposo y células con alta actividad proliferativa.

1. Preparación

NOTA: Antes de continuar, prepare los siguientes reactivos que se describen a continuación. Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el proveedor de reactivos y materiales. Se debe usar equipo de protección personal como mascarillas, gorras, batas de laboratorio y guantes en todos los procedimientos prácticos.

  1. Extracción de tejido adiposo epididimario
    1. Reserve los materiales quirúrgicos: tres juegos de pinzas y tijeras estériles, cinco agujas y un vaso de precipitados que contenga 200 ml de etanol al 70%.
    2. Prepare un anestésico terminal, mezclando ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
  2. Cultura de los ADSC
    1. Medio basal: Prepare el medio de alta glucosa Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 50 μg/mL de gentamicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina.
    2. Solución de digestión: Preparar 0,15% de colagenasa tipo II en PBS esterilizado en un filtro de 0,25 μm.
      NOTA: No es necesario utilizar los cuatro antibióticos descritos en el medio basal. Dependerá de las condiciones de cultivo celular del laboratorio donde se realice.
  3. Caracterización fenotípica de ADSCs
    1. Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS.
    2. Diluir los anticuerpos anti-ratón como se menciona en la Tabla 1.
    3. Prepare formaldehído al 2% en PBS.
  4. Diferenciación osteogénica de ADSCs
    1. Medio de diferenciación osteogénica: Preparar DMEM suplementado con ácido ascórbico 5,67 M, dexametasona 10 nM, β-glicerofosfato 0,02 M, FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%.
    2. Para la tinción de Von Kossa, prepare las siguientes soluciones: 70% de etanol en agua, 5% de nitrato de plata en agua, agua destilada, 5% de tiosulfato de sodio en agua y 1% de eosina B en agua.
  5. Diferenciación adipogénica:
    1. Medio de diferenciación adipogénico: Preparar DMEM suplementado con 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, 200 μM de indometacina, 1 μM de dexametasona, 10 μM de insulina, 10% de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina.
    2. Para la tinción de rojo aceite, prepare las siguientes soluciones: 10% de formalina en agua desionizada, 60% de isopropanol en agua desionizada, colorante diazo de lisocromo (colorante soluble en grasa) (solución de aceite rojo O) en 60% de isopropanol y 1% de hematoxilina en agua desionizada.
  6. Diferenciación condrogénica:
    1. Medio de diferenciación condrogénico: Prepare medio condrogénico suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.
    2. Prepare formaldehído al 10% en PBS.
    3. Para la tinción de proteoglicanos y glicosaminoglicanos, prepare las siguientes soluciones: Tinción de heteroglicanos (azul alcián 1%) en ácido acético, pH 2,5, parafina, hematoxilina, dilución de la serie de etanol en agua (100%, 96%, 80% y 70%).

Anticuerpo/FluoróforoDiluciónClonConcentración final (μg/mL)Función y célula en la que se expresa
CD34- PE1:100RAM342Factor de adhesión celular. Células madre hematopoyéticas.
CD45- APC1:10030-F112Asistencia en la activación de leucocitos. Se expresa en los leucocitos.
CD71- FITC1:100C25Controla la absorción de hierro durante la proliferación celular. Células proliferantes, reticulocitos y células precursoras.
CD29- FITC1:100Ha2/55Adhesión y activación, embriogénesis, leucocitos, células dendríticas, plaquetas, mastocitos, fibroblastos y células endoteliales.
CD90- PerCP1:100OX-72Señalización, adhesión. Linfocito T, NK, monocitos, células madre hemtopoyéticas, neurona y fibroblastos.

Tabla 1: Anticuerpos utilizados para la caracterización fenotípica de ADSCs mediante citómetro de flujo. Lista de anticuerpos con sus respectivos fluorocromos, diluciones, clon y concentración final, así como su función en la célula que se expresa.

2. Métodos

NOTA: El tejido adiposo se distribuye por todo el cuerpo en localizaciones subcutáneas o intraabdominales. En ratones, los tejidos adiposos más comunes utilizados para los experimentos incluyen el epidídimo subcutáneo, el mesentérico y el retroperitoneal22. Aquí se muestran los pasos para la obtención de tejido adiposo epididimario (Figura 1).

figure-protocol-1
Figura 1: Diseño experimental para la obtención de células madre derivadas de tejido adiposo a partir de ratones suizos. (A) Usando agujas, coloque el animal sobre el tablero de corcho o espuma de poliestireno; (B) Levante la piel con pinzas, haga un corte en el centro de la región abdominal y separe la piel del peritoneo; (C) identificar el tejido adiposo blanco por encima del epidídimo; (D) transferir el tejido a un medio DMEM suplementado con un 10% de FBS y un 1% de antibióticos, lavar minuciosamente el tejido adiposo del epidídimo con PBS y transferir el tejido a la solución de digestión; (E), fragmentar el tejido y (F) incubar a 37 °C durante 1 h agitando vigorosamente cada 10 min; (G) después de contar las células, coloque placas de 6 pocillos y observe la morfología celular bajo un microscopio invertido. (F) La morfología de la célula cambiará de redonda a fibroblasta. Barra de escala = 22,22 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Extracción de tejido adiposo del epidídimo
    NOTA: Tenga en cuenta que todos los procedimientos deben llevarse a cabo en condiciones estériles en una cabina de flujo laminar para garantizar un cultivo celular puro y libre de contaminación.
    1. Eutanasiar a los animales utilizando una solución de ketamina y xilacina (100 y 10 mg/kg, como se describe en el paso 1.1.2) por vía intraperitoneal.
      NOTA: Se pueden utilizar otros métodos de eutanasia23. Asegúrese de que el animal esté muerto confirmando la ausencia de latidos cardíacos.
    2. Coloque al animal con la cara ventral hacia arriba sobre una tabla de corcho o espuma de poliestireno cubierta con papel de aluminio y fíjelo con agujas estériles (Figura 1A).
      NOTA: Para evitar la contaminación, rocíe alcohol al 70% en la región abdominal. También puedes afeitar el vello con un bisturí.
    3. Levante la piel con unas pinzas en el centro de la región abdominal y haga un corte con tijeras estériles.
      NOTA: Son necesarios dos juegos de pinzas y tijeras estériles para evitar la contaminación. El primero se utiliza para abrir al animal, cortando la piel y la capa peritoneal; El segundo se utiliza para recoger el tejido adiposo del epidídimo. Además, reserve 150 ml de alcohol al 70% en un vaso de precipitados para limpiar tijeras y pinzas entre escalones.
    4. Introducir las tijeras bajo la piel del animal y abrirla para desprenderla del peritoneo (Figura 1B). Levante la capa peritoneal con unas pinzas y corte con tijeras estériles.
    5. Use otro juego de pinzas y tijeras estériles e identifique el epidídimo por encima de los testículos y el tejido adiposo blanco por encima del epidídimo. Extraer todo el tejido adiposo del epidídimo con unas pinzas estériles, de aproximadamente 2 cm de tamaño, y cortar muy cerca del epidídimo (Figura 1C).
    6. Coloque la grasa en un tubo cónico estéril de 50 mL que contenga medio basal y colóquelo en hielo (Figura 1D). En el capó, continúe con los siguientes pasos como se describe a continuación.
  2. Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC)
    NOTA: Procese las muestras en una campana de flujo laminar de clase biológica II, y el personal debe usar una bata de laboratorio, guantes y mascarilla quirúrgica.
    1. Lave bien el tejido adiposo del epidídimo con PBS.
      NOTA: Este paso es esencial para eliminar la sangre y otras partículas de la muestra. La sangre puede inhibir la enzima colagenasa tipo II y comprometer el experimento.
    2. Con una pinza estéril, transfiera el tejido adiposo del epidídimo a un tubo de 50 ml que contenga 15-20 ml de solución digestiva, preparada en el paso 1.2.2. Fragmentar el tejido con unas tijeras estériles e incubar el tejido a 37 °C durante 1 h (Figura 1E, F).
      NOTA: En este paso se puede utilizar un baño de agua o una incubadora a 37 °C. Cada 10 min, la suspensión debe agitarse vigorosamente para facilitar la digestión. No prolongue el tiempo de incubación de 1 hora.
    3. Inactivar la colagenasa diluyendo la muestra 1:1 en medio basal y centrifugar la suspensión a 250 x g durante 10 min a 4 °C para obtener la fracción vascular del estroma. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio basal.
    4. Comprobar la viabilidad y contar las células mediante el método de exclusión del colorante azul de tripano en una cámara de Neubauer utilizando una dilución de 1:10 o 1:100.
      NOTA: El rendimiento esperado es de alrededor de 0,5-1 millón de células/g de tejido adiposo procesado y una viabilidad del 80%.
    5. Coloque las células aisladas (0,3-0,5 millones) en 3 mL de medio basal en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2.
    6. Al día siguiente: Retire el medio del pocillo y lave las celdas con PBS. Añadir 3 mL de medio basal. Repita este proceso cada 2 días hasta que las células se vuelvan 90% confluentes.
      NOTA: Observe siempre la morfología de las células bajo el microscopio invertido, cambiando de redondas a fibroblastos (Figura 1H).
  3. Expansión de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC)
    NOTA: Una vez que las células crezcan ~90% confluentes, proceda al subcultivo como se describe a continuación.
    1. Retire el medio del pocillo y lave las celdas con PBS. Añadir 0,5 mL/pocillo de tripsina/EDTA (0,05 % de tripsina; 200 mg/L de EDTA) e incubar la placa durante 3-5 min a 37 °C para separar las células.
      NOTA: No exceda los 5 min en tripsina/EDTA. El desprendimiento completo de las células debe verificarse bajo el microscopio invertido. El proceso se puede acelerar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con cuidado o golpeando el costado de la placa.
    2. Inactivar la enzima diluyendo la muestra 1:1 en DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibióticos.
    3. Divida la suspensión celular en 2 pocillos y agregue 3 mL de medio basal (DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de antibióticos). Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
    4. Cambie de medio al día siguiente, luego cada 2 días hasta el 90% de confluencia.
    5. Repetir el proceso hasta el tercer paso y proceder a la caracterización fenotípica y funcional.
      NOTA: Observe siempre la morfología de las células bajo el microscopio invertido, cambiando de redondas a fibroblastas.
  4. Caracterización de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC)
    1. Caracterización fenotípica por citometría de flujo
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA, como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2.
      2. Recoja las células en un tubo cónico (50 mL) y centrifugue a 250 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS.
      3. Cuente las células como se describe en el paso 2.2.4 y siembre 0,5-1 x 106 células en 100 μL de PBS en una placa de 96 pocillos.
        NOTA: El número de pocillos dependerá del color del conjugado de fluorocromo y de los filtros/láseres del citómetro.
      4. Añadir anticuerpos (Tabla 1) diluidos en BSA al 1% en PBS.
        NOTA: No es necesario utilizar el bloque Fc para evitar la unión inespecífica porque ya utilizamos BSA para diluir anticuerpos. Reservar una muestra de células sin recibir anticuerpos que se utilizarán como control de la tinción. Los anticuerpos se pueden combinar en el mismo pocillo de acuerdo con el colorante de fluorocromo y el citómetro disponibles en el laboratorio. Todos los anticuerpos descritos en la Tabla 1 se pueden agregar en el mismo pocillo, excepto el CD71 FITC y el CD29 FITC, que deben estar en pocillos diferentes debido al mismo fluorocromo.
      5. Incubar la placa durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad.
      6. Lave las celdas, complete el volumen a 200 μL con PBS, centrifugue la placa a 252 x g durante 10 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Repita este paso una vez más.
      7. Fije las celdas agregando 200 μL por pocillo de formaldehído al 2% en PBS. Almacene las células en la oscuridad a 4 °C hasta el análisis en el citómetro de flujo.
        NOTA: Para obtener los mejores resultados, adquiera las celdas del citómetro de flujo lo antes posible. El brillo de la fluorescencia de los marcadores decae significativamente después de 48 h para la mayoría de los fluorocromos. Por lo tanto, no exceda las 48 h para leer la placa. Se recomienda la adquisición de 30.000 eventos.
      8. Utilice la estrategia de compuerta que se presenta en la Figura 2B para seleccionar la población de ASC.
    2. Caracterización funcional: Diferenciación osteogénica
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA (como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2), recoja y centrifugue las células (como se describe en los pasos 2.4.1.2 y 2.4.1.2) y cuéntelas (como se describe en los pasos 2.2.4).
      2. Placa, por triplicado, 2 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos en medial basal (DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de antibióticos); incubar a 37 °C en 5% de CO2.
        NOTA: Se necesitarán dos placas de 6 pocillos, una para cada tiempo de diferenciación (14 y 21 días).
      3. Al día siguiente, cambie el medio a medio osteogénico (paso 1.4.1).
        NOTA: reservar 3 pozos siendo cultivados únicamente con el medio basal, que será el testigo para la diferenciación.
      4. Cultivo de células durante 14 y 21 días en medios osteogénicos y las células control, cambiando de medio cada 3 días. Proceda a la tinción de Von Kossa (paso 1.4.2) para evaluar los nódulos mineralizados al final de cada período de cultivo.
      5. Aspire el medio de cada pocillo y lave las celdas dos veces con PBS. Fije las celdas con 2 mL de etanol al 70% durante la noche a temperatura ambiente (RT). Lave las celdas cuidadosamente con agua corriente.
      6. Agregue 2 mL de solución de nitrato de plata al 5% e incube la placa en luz ultravioleta durante 1 h. Lave las celdas con agua destilada. Añadir 2 mL de tiosulfato de sodio al 5% e incubar durante 5 min. Lavar con agua destilada.
      7. Contratinción con 2 mL de eosina durante 40 s. Lave con agua destilada hasta que se retire la solución de tinción y visualice la tinción con un microscopio óptico.
    3. Caracterización funcional: Diferenciación adipogénica
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA (como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2), recoja y centrifugue las células (como se describe en los pasos 2.4.1.2 y 2.4.1.2) y cuéntelas (como se describe en los pasos 2.2.4).
      2. Placa 2 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos en medial basal (DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de antibióticos); incubar a 37 °C en 5% de CO2.
        NOTA: Se necesitarán dos placas de 6 pocillos, una para cada tiempo de diferenciación (14 y 21 días).
      3. Al día siguiente, cambie el medio a medio adipogénico (paso 2.5.1).
        NOTA: Reservar 3 pozos siendo cultivados únicamente con el medio basal como testigo.
      4. Cultivo de células durante 14 y 21 días en medio adipogénico, cambiando de medio cada 3 días. Al final de cada período de cultivo, se procede a la tinción con Oil-Red O (pasos 2.4.3.5-2.4.3.7), un indicador de acumulación de lípidos intracelulares.
      5. Aspire los medios de cada pocillo. Lave las celdas dos veces con PBS. Fijar las células en 2 mL de formalina al 10% durante 1 h. Lave una vez con PBS y luego una vez con agua.
      6. Manchar con 2 mL de solución de Oil-Red O en isopropanol al 60% durante 5 min. Lavar una vez con agua destilada.
      7. Contratinción con 2 mL de hematoxilina al 1% diluida 1:2 en agua destilada durante 1 min. Lavar con agua destilada hasta eliminar la solución de tinción y visualizar las muestras teñidas con un microscopio óptico.
    4. Caracterización funcional: Diferenciación condrogénica
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA (como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2), recoja y centrifugue las células (como se describe en los pasos 2.4.1.2 y 2.4.1.2) y cuéntelas (como se describe en los pasos 2.2.4).
      2. Coloque 5 x 105 ADSC en cuatro tubos cónicos de polipropileno y centrifugue a 450 x g durante 5 minutos para formar un pellet. Deseche el sobrenadante.
      3. Cultivar los gránulos en un tubo cónico en un medio condrogénico (paso 1.6.1) o solo en medio basal (control de la diferenciación) durante 14 y 21 días a 37 °C con 5% de CO2. Cambie el medio cada 3 días y evite eliminar los pellets.
        NOTA: Cada pellet celular se refiere a cada tiempo de cultivo, así como a sus respectivos controles cultivados únicamente con medio basal.
      4. Al final de cada punto de tiempo de cultivo, recoja los gránulos con pinzas de punta fina y colóquelos en una placa de 24 pocillos. Proceda a la sección histológica y tinción de proteoglicanos y glicosaminoglicanos (pasos 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        NOTA: Cada pellet se procesa en un pozo separado.
      5. Fije los pellets en 2 mL de formaldehído tamponado al 10% durante 30 min. Deseche la solución de formaldehído y agregue 2 ml de etanol al 70%. Retire el pellet del tubo cónico con una punta e incruste los pellets en parafina.
      6. Con un micrótomo de parafina giratorio, realice cortes histológicos de 5 μm. Incubar las secciones durante 15 min a 60 °C y sumergirlas dos veces en xileno (durante 5 y 15 min).
      7. Rehidrate las muestras sumergiendo las secciones histológicas en baños de alcohol a concentraciones decrecientes (100%, 96%, 80% y 70%) durante 2 minutos cada una, luego enjuague con agua desionizada durante 5 minutos.
      8. Proceder a teñir las muestras con azul alcián 1% en ácido acético, pH 2,5, durante 30 min.
      9. Contramanchar con hematoxilina durante 1 min y lavar con agua destilada. Móntelo con DPX (montante para histología) u otra solución de montaje y visualice las muestras utilizando un microscopio óptico.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células extraídas del tejido adiposo de acuerdo con el protocolo aquí presentado mostraron una morfología que coincidía con los criterios mínimos para las MSC propuestos por el ISCT. En la Figura 1 se muestra una descripción general del protocolo. Fenotípicamente, las ADSC mostraron adherencia a la morfología plástica y similar a la de los fibroblastos en los primeros días de cultivo celular (Figura 2A). Además, crecieron de forma homogénea y formaron colonias. Además, las ADSCs mostraron baja expresión de CD34 (2,12%) y CD45 (1,81%), ambos marcadores hematopoyéticos, y alta expresión de CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) y CD90 (55,1%), todos marcadores de células mesenquimales (Figura 2B).

figure-results-1
Figura 2: Caracterización fenotípica de células derivadas de tejido adiposo. (A) La morfología de las ADSC cambia de redonda a similar a un fibroblasto en los días 2, 4 y 8 de cultivo; barra de escala = 22,22 μm. (B) Histogramas de marcadores expresados (CD71, CD29 y CD90) o no (CD34 y CD45) por ASC. Esta figura ha sido reproducida con permiso de Miranda et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Funcionalmente, las ADSC mostraron multipotencia para diferenciarse en osteoblasto, adipoblasto y condroblasto cuando se cultivaron en medios acondicionados para cada linaje durante 14 o 21 días (Figura 3). La tinción de Von Kossa reveló nódulos mineralizados en la matriz extracelular, característicos del proceso de osteogénesis (Figura 3). La tinción con Oil-red O evidenció vacuolas lipídicas en el citoplasma de las ADSC, y la tinción con azul alcián confirmó la presencia de glicosaminoglicanos en la matriz extracelular (Figura 3). En conjunto, las características fenotípicas y funcionales han confirmado la población de células extraídas del tejido adiposo del epidídimo como MSC.

figure-results-2
Figura 3: Caracterización funcional de células derivadas del tejido adiposo. Potencial multilinaje osteogénico, adipogénico y condrogénico de ADSC después de 14 y 21 días de cultivo. Barra de escala = 50 μm (panel superior), 100 μm (paneles central e inferior). Esta figura ha sido reproducida con permiso de Miranda et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las MSCs pueden extraerse de diferentes tejidos. A pesar de que la médula ósea representa una fuente común de MSCs tanto en murinos como en humanos25,26, hemos optado por trabajar con tejido adiposo en este estudio debido a su riqueza en MSCs, su distribución en el organismo y su facilidad de acceso. Como alternativa, las células madre derivadas del tejido adiposo pueden utilizarse para generar células inmortalizadas similares a las MSC27.

Algunos puntos de la extracción merecen especial atención para el éxito de los protocolos aquí compartidos. En primer lugar, destacamos el cuidado para recoger el tejido que debe realizarse en condiciones asépticas. Por lo tanto, asegúrese de que los ratones se desinfecten adecuadamente con alcohol al 70% antes de comenzar la cirugía. Otro punto importante es no utilizar el mismo juego de pinzas y tijeras para recoger el tejido adiposo del epidídimo, evitando así cualquier fuente de contaminación.

Una segunda preocupación es el procesamiento de los tejidos. Los fragmentos en el tubo cónico deben agitarse adecuada y vigorosamente con 10 min de incubación a 37 °C. Es muy importante cambiar el medio al día siguiente y luego cada 2-3 días. Se recomienda observar el cultivo diariamente, verificando el color del medio, la forma de la célula y cualquier interferencia en el entorno del cultivo.

Una tercera preocupación se refiere al mejor tiempo/paso para la caracterización de MSC. Aquí, recomendamos hacerlo en el tercer paso de las celdas, pero esto no es obligatorio. Depende del objetivo del estudio. En el tercer pasaje, tenemos alrededor del 80% de las células caracterizadas como MSC, lo que es suficiente para los objetivos de este estudio, por ejemplo. La caracterización fenotípica se realiza mediante el análisis de la expresión de marcadores hematopoyéticos (CD34 y CD45, por ejemplo) y marcadores mesenquimales (CD29, CD73, CD90 y CD105, por ejemplo). Además, la International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)21 destaca que las ADSCs deben tener una morfología similar a la de los fibroblastos y adherirse al plástico de la plataforma de cultivo. La morfología se puede observar bajo un microscopio durante el cultivo. La caracterización funcional se realiza analizando el potencial de las ADSC para diferenciarse en células osteoblásticas, adipoblastas y condrobástas. En la caracterización fenotípica, el porcentaje de marcadores mesenquimales y hematopoyéticos puede variar según la especie animal y la fuente celular, no cumpliendo plenamente con los números recomendados por el ISCT. Por ejemplo, el ISCT recomienda para las MSC humanas ≥95% de CD105, CD73, CD90 y ≤2% de CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19, Antígeno leucocitario humano - Isotipo DR (HLA-DR)21. Además, es importante hacer la caracterización funcional y confirmar la multipotencia de las células que se diferencian en linajes de osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Se recomiendan al menos dos de estos linajes para demostrar la multipotencia.

Además de estos puntos destacados, algunos ensayos sugeridos aquí pueden sustituirse, por ejemplo, el rojo de alizarina S en lugar de la tinción de Von Kossa, el shiff de ácido peritorio en lugar de azul alcián y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en lugar de citometría de flujo.

Entre los tres tipos de tejido adiposo descritos en humanos (blanco, marrón y beige), el tejido adiposo blanco tiene la mayor fuente deMSCs 28. Este tejido se puede obtener de las regiones subcutáneas, abdominales e inguinales, como la grasa sobre el epidídimo que se describe aquí. La fragmentación física y la digestión enzimática por colagenasa utilizadas en el protocolo aquí compartido derivan la fracción vascular estromal (FSV) compuesta por muchos tipos de células, a excepción de los adipocitos, que se agotan durante el procesamiento.

En conclusión, las principales ventajas de utilizar el tejido adiposo como fuente de MSCs incluyen su abundancia y facilidad de métodos para el aislamiento celular, asociado al potencial terapéutico de las MSCs como propiedades antiinflamatorias y regenerativas.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigación financiada por una beca del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) y de la Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Este estudio fue financiado en parte por la UESC PROPP (073.6764.2019.0021079-85). MGAG y URS gracias a la beca otorgada por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) y la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), respectivamente.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
140 ° C Esterilización por alta temperatura CO2 IncubadoraRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutil-1-metilxantinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.I7018
Ácido acético glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.PHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UUA9186BioReactivo, adecuado para la detección de glicoproteínas. 1% en ácido acético, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% en agua
Anfotericina BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Anticuerpos anti-ratón anti-CD29 FITC (Clon Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, EE. UU. 555005Funciones en la célula: Adhesión y activación, embriogénesis, Leucocitos, DC, plaquetas, mastocitos, fibroblastos y células endoteliales
Anticuerpos anti-ratón anti-CD34 PE (Clon RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Funciones en la célula: Factor de adhesión celular. Células madre hematopoyéticas
Anticuerpos anti-ratón anti-CD45 APC (Clon 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, EE. UU. 559864Funciones en la célula: Ayuda en la activación de leucocitos
Anticuerpos anti-ratón anti-CD71 FITC (Clon C2)BD Biosciences, San Diego, CA, EE. UU. 553266 Funciones en la célula: Controla la absorción de hierro durante la proliferación celular. Células proliferantes, reticulocitos y precursores Anticuerpos
anti-ratón anti-CD90 PerCP (Clon OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Funciones en la célula: Señalización, adhesión. Linfocito T, NK, monocito, HSC, neurona, fibroblasto
Ácido ascórbicoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Estados UnidosPHR1008
Pipetas automáticasThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
vaso de precipitadosNo aplicable1 unidad
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE.UUA7906
Placas de cultivo celular (6 pocillos)Merck, Darmstadt, AlemaniaZ70775907 unidades estériles. Placas de cultivo de tejidos TPP
Placas de cultivo celular (96 pocillos. Redondo o fondo en V)Merck, Darmstadt, AlemaniaCLS35307701 unidad estéril. Pocillos, 96, superficie tratada con cultivo de tejidos (TC), pozos transparentes de fondo redondo,
medio condrogénicoTallo Pro Condrogénesis Diferenciación– Life TechnologiesA1007101TGF-β 2, TGF-y beta; 3, dexametasona, insulina, transferrina, ITS, sodio-l - ascorbato, piruvato de sodio, ascorbato-2-fosfato
Colagenasa tipo IILife Technologies, California, EE. UU.17101015
corcho o tablero de espuma de poliestireno recubierto de aluminioNo aplicable1 unidad
algodónNo aplicable50 g
DexametasonaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.D4902
Tijera de disecciónNo aplicable03 unidades
estéril DPX Mountant para histologíaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.D5523Con 1000 mg/L de glucosa y L-glutamina, sin bicarbonato de sodio, en polvo, apto para cultivo celular
Eosina BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.861006
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UUF4135
FormaldehídoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU47608
FormalinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.HT501128
GentamicinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.G1397
HematoxilinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UUH3136
Aguja hipodérmica (0.3mm x 13mm)No aplicable5 unidades
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.I0200000
InsulinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.I3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.56393570% en
solución de clorhidrato de ketamina-D4Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UUK-0061,0 mg/mL en metanol (como base libre), material de referencia certificado, Cerilliant®
Cámara de NeubauerSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE.UU. BR718620 Cámara de conteo de marca BLAUBRAND Neubauer modelo. Con clips,
puntas de pipeta Nichiryo de doble regla (0.1– 10 μ L)Merck, Darmstadt, AlemaniaZ645540Rango de volumen 0.1– 10 μ L, alargado, paquete a granel. Puntas de
pipeta Nichiryo estériles (1– 10 mL)Merck, Darmstadt, AlemaniaZ717401Rango de volumen 1– 10 mL, universal, paquete a granel. Puntas de
pipeta Nichiryo estériles (200 μ L)Merck, Darmstadt, AlemaniaZ645516Volumen máximo 200 μ L, graduado, ministack. Aceite estéril-solución
de O rojoSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UUO13910.5% en parafina de isopropanol
Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU107.15146– 48, en forma de bloque
Penicilina/EstreptomicinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solución estabilizada, con 10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina/mL, 0,1 μ m filtrado, BioReactivo, apto para cultivo celular
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Polvo, pH 7.4, para preparar soluciones de 1 L. Tubos cónicos de polipropileno balanceados y estériles
(15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53A
Tubos cónicos de polipropileno estériles (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 unidades
bisturí estéril (opcional)No aplicable1 unidad
Nitrato de plataSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Tiosulfato de sodioSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Pinza quirúrgica (15 cm)No aplicable3 unidades
ratones machos suizos estériles (6– 8 semanas)Bioterio, Universidad Estatal de Santa Cruz021/22
jeringa (1 mL)No aplicable1 unidad
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular
Tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XilacinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.PHR3263
β-glicerofosfato hidrato de sal disódicaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UUG9422BioUltra, adecuado para cultivo celular, adecuado para cultivo de células vegetales, ≥ 99% (valoración)
. de . estéril de . . . H2O . . . de .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsAdipose TissueStem Cell IsolationIn Vitro ExpansionFlow CytometryOsteogenic DifferentiationAdipogenic DifferentiationChondrogenic DifferentiationCollagenase DigestionMouse Epididymal Tissue

Related Articles