Clasificación unicelular de células madre mesenquimales inmunofenotipadas de dientes deciduos exfoliados humanos

Resumen

Este protocolo describe el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia de células madre mesenquimales humanas utilizando el método de clasificación de una sola célula. Específicamente, el uso de la clasificación de una sola célula puede lograr una pureza del 99% de las células inmunofenotipadas de una población heterogénea cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) de un organismo poseen una extraordinaria capacidad para diferenciarse en múltiples linajes de células adultas en el cuerpo y son conocidas por sus propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias. El uso de estas células madre es una bendición para el campo de la biología regenerativa, pero al mismo tiempo, una pesadilla para la medicina regenerativa y la terapéutica debido a las múltiples ambigüedades celulares asociadas con ellas. Estas ambigüedades pueden surgir de la diversidad en la fuente de estas células madre y de sus condiciones de crecimiento in vitro , las cuales reflejan su heterogeneidad funcional.

Esto justifica metodologías para proporcionar poblaciones purificadas y homogéneas de MSC para aplicaciones terapéuticas. Los avances en el campo de la citometría de flujo han permitido la detección de poblaciones unicelulares mediante un enfoque multiparamétrico. Este protocolo describe una forma de identificar y purificar las células madre de los dientes deciduos exfoliados humanos (SHED) a través de la clasificación de células individuales asistida por fluorescencia. La expresión simultánea de marcadores de superficie, a saber, el isotiocianato de fluoresceína CD90 (FITC), la proteína CD73-peridinina-clorofila (PerCP-Cy5.5), la aloficocianina CD105 (APC) y la CD44-V450, identificó los expresores positivos "brillantes" de las MSC mediante citometría de flujo multiparamétrica. Sin embargo, se observó una disminución significativa en los porcentajes de expresores cuádruples de estos marcadores positivos desde el pasaje 7 en adelante hasta los pasajes posteriores.

Las subpoblaciones inmunofenotipadas se clasificaron utilizando el modo de clasificación de una sola célula, donde solo dos marcadores positivos y uno negativo constituyeron los criterios de inclusión. Esta metodología garantizó la viabilidad celular de las poblaciones clasificadas y mantuvo la proliferación celular después de la clasificación. La aplicación posterior para dicha clasificación se puede utilizar para evaluar la diferenciación específica del linaje para las subpoblaciones cerradas. Este enfoque se puede aplicar a otros sistemas de una sola célula para mejorar las condiciones de aislamiento y para adquirir información de marcadores de superficie celular múltiple.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSC) pueden considerarse como una fuente escalable de células adecuadas para terapias basadas en células y pueden considerarse un sistema de referencia en medicina regenerativa. Estas células se pueden aislar de una variedad de fuentes en el cuerpo con diferentes orígenes tisulares¹. Dependiendo de su tejido de origen, cada tipo de MSC muestra un comportamiento in vitro ambiguo². Esto se observa bien en sus propiedades morfológicas y funcionales³. Múltiples estudios han demostrado variación intraclonal en las dimensiones, incluyendo la diferenciación tisul....

Protocolo

Aprobación ética y consentimiento para participar: Se recibieron muestras de pulpa dental caducifolia exfoliada humana después de obtener el consentimiento informado y la aprobación ética completa por parte del Departamento Oral y Maxilofacial del Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bangalore, de acuerdo con los estándares establecidos por el Comité de Autorización Ética Hospitalaria, SRGCDS. Después de lo cual el aislamiento, el cultivo, el mantenimiento y la aplicación de SHEDs fueron aprobados y en cumplimiento de las directrices recomendadas por el Comité Institucional para la Investigación con Células Madre (IC-SCR) en el Instituto Manipal de M....

Resultados

Los SHEDs se caracterizaron con ensayos de inmunofluorescencia estándar que mostraron la expresión de vimentina (rojo, filamentos intermedios tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) y núcleos teñidos con DAPI (Figura 1A). Para estimar sus capacidades proliferativas y formadoras de colonias, se realizaron ensayos estándar de crecimiento celular a corto plazo. En la Figura 1B se muestra un aumento de 14,3 veces en la tasa de proliferaci.......

Discusión

En el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, entre las fuentes postnatales, las MSC derivadas de tejidos orales han atraído un profundo interés debido a sus obligaciones éticas mínimas y a su notable potencial de diferenciación multilinaje²¹. Las células madre de la pulpa dental (CPD) del tercer molar impactado y las SHEDs han atraído la mayor atención entre las MSC dentales por su potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y traumáticas²²

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tinción azul alcián HiMedia		CCK029-1KT
Antibiótico-Antimicótico (100x)	Gibco de ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µ m) Juego de partículas	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Se utiliza para configurar el retardo láser cuando se abre el módulo de clasificación.
BD FACS Aria Fusion Citómetro de flujo	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Utilizado como fluido de vaina para experimentos de análisis y clasificación en el BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS& T Research Beads	BD Biosciences	655050	Se utiliza para la configuración de instrumentos en función del tamaño de la boquilla.
BD Horizon V450 Ratón Anti-Humano CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Ratón IgG2b, κ Control de isotipo	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotipo
BD Pharmingen APC Ratón Anti-humano CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Ratón IgG1, κ Control de isotipo	BD Biosciences	555751	Isotipo CD105-APC
BD Pharmingen Solución DAPI BD	Biosciences	564907	DAPI Solución madre de 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Ratón Anti-Humano CD90 BD	Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Ratón IgG1, κ Control de isotipo	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotipo
BD Pharmingen PE Ratón Anti-humano CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Ratón IgG1, κ Control de isotipo	BD Biosciences	555749	Isotipo CD45-PE
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Ratón Anti-Humano CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Ratón IgG1, κ Control de isotipo	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotipo
BD Pharmingen Anti-Vimentina purificada para ratones	BD Biosciences	550513
Albúmina sérica bovina	Hi-Media	TC548-5G
Cristal violeta	Niza químico pvt ltd	C33809
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS utilizado para trabajos de cultivo y mantenimiento.
Etanol	---	---	Se utiliza para la esterilización general.
Suero fetal bovino	Gibco de ThermoFisher	10270-106
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco de ThermoFisher	10829018	Medio basal para hESCs indiferenciadas, utilizado en la preparación de medios de cultivo
L-glutamina 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Metanol, para Biología Molecular	Hi-Media	MB113
Aceite rojo O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehído	loba chemie	30525-89-4
Penicilina Estreptomicina (100x)	Gibco de ThermoFisher	15140- 122
Faloidina (reactivo ActinGreen 488 ReadyProbes)	Invitrogen	R37110
Nitrato de plata	HiMedia	MB156-25G
Tiosulfato de sodio pentahidratado	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Partículas fluorescentes, 3.0 - 3.4 y micro; m	BD Biosciences	556291
Tampón de tinción	Preparado en MIRM	----	Se preparó utilizando 2% de FBS en PBS
StemPro Diferenciación de Adipogénesis Media Basal	Gibco de ThermoFisher	A10410-01	Medios basales para medios adipogénicos
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco de ThermoFisher	A10065-01 Medios de	inducción para medios adipogénicos
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco de ThermoFisher	A10064-01 Medios de	inducción para medios condrogénicos
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco de ThermoFisher	A10066-01	Medios de inducción para medios osteogénicos
StemPro Osteogénesis/Condrogénesis Diferenciación Medios basales	Gibco de ThermoFisher	A10069-01	Medios basales para medios osteogénicos y condrogénicos
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Azul de tripano	Gibco por life technologies	15250-061
Tripsina - Solución de EDTA 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5