En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.
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Artículo de método
Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz
En este artículo
Resumen
Resumen
Hemos optimizado un protocolo para inocular vainas foliares de maíz con hongos patógenos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. El método es una modificación de uno aplicado originalmente a las vainas de las hojas de arroz y permite la observación microscópica directa del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas. Las vainas foliares recolectadas de plántulas de maíz con dos collares foliares completamente emergidos se inoculan con 20 μL de suspensiones de esporas fúngicas de 5 x 105 esporas/mL y se incuban en cámaras de humedad a 23 °C bajo luz fluorescente continua. Después de 24-72 h, el exceso de tejido se elimina con una cuchilla de afeitar para dejar una sola capa de células epidérmicas, una muestra ópticamente clara que se puede obtener directamente sin necesidad de fijación química o aclaramiento. Las células vegetales y fúngicas permanecen vivas durante la duración del experimento y las interacciones se pueden visualizar en tiempo real. Las vainas pueden teñirse o someterse a plasmólisis para estudiar la citología del desarrollo y la viabilidad de las células huésped y patógena durante la infección y la colonización. Las cepas fúngicas transformadas para expresar proteínas fluorescentes pueden ser inoculadas o co-inoculadas en las vainas para aumentar la resolución y facilitar la evaluación de interacciones competitivas o sinérgicas. Las cepas fúngicas que expresan proteínas de fusión fluorescentes se pueden utilizar para rastrear y cuantificar la producción y el objetivo de estas proteínas individuales en la planta. Los tejidos de la vaina inoculados se pueden extraer para caracterizar ácidos nucleicos, proteínas o metabolitos. El uso de estos ensayos de vaina ha hecho avanzar en gran medida los estudios detallados de los mecanismos de patogenicidad fúngica en el maíz y también de los efectores proteicos fúngicos y los metabolitos secundarios que contribuyen a la patogenicidad.
Introducción
Los análisis espaciales y temporales a nivel celular son fundamentales para comprender la fisiología y la citología de las interacciones entre hongos y plantas. Los tejidos foliares que han sido fijados químicamente 1,2,3 o aclarados y teñidos4, así como las membranas artificiales5, se han utilizado en el pasado para investigar la citología del desarrollo de patógenos foliares y las interacciones planta-hongo. Sin embargo, la investigación de eventos de infección en tejidos vivos del huésped en tiempo real sin fijación o aclaram....
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Protocolo
NOTA: El flujo de trabajo del método se muestra en la Figura 1.
Figura 1: Pasos del protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas de hojas de maíz desprendidas. La preparación de la suspensión de esporas, la inoculación de la vaina foliar y la preparación de la muestra para la microscopía de células vivas se resaltan en los cuadros verde (A), púrpura (B) y naranja....
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Resultados
En los ejemplos siguientes se describen resultados representativos tras el uso del método de inoculación de la vaina foliar de maíz. Estos ejemplos demuestran la facilidad, velocidad y precisión con la que se puede observar y comparar las interacciones maíz-hongo en tiempo real con este ensayo optimizado. Las imágenes de células vivas también permiten la extracción de información cuantitativa, proporcionando una herramienta útil para estudios moleculares, citológicos y fisiológicos comparativos. Se pueden encontrar más d.......
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Discusión
El método optimizado de inoculación de la vaina foliar descrito aquí es una modificación de un protocolo original que se desarrolló y se ha aplicado a las vainas foliares de arroz 6,8,36. Permite observaciones directas y detalladas del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas con microscopía de campo amplio o confocal. El protocolo es adecuado para la caracterización, comparación y cuantificación de una vari.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos y nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al USDA-NIFA por su apoyo financiero (números de subvención 2018-67013-28489 y 2020-70410-32901). Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este manuscrito pertenecen exclusivamente a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Agradecemos a la estudiante visitante de Ciencia Sin Fronteras de Brasil, Mayara de Silva, por las imágenes que aparecen en la Figura 6A y en la Figura 7D. También reconocemos al Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Kentucky por proporcionar acceso a los microscopios....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara microscópica monocromática Axiocam | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible con el microscopio Axioplan 2; Proporciona un bajo ruido de lectura y alta velocidad para la obtención de imágenes de células vivas |
| Microscopio de epifluorescencia Axioplan 2 | ZEISS | N/A | Permite la visualización en directo y la captura de imágenes/vídeos de muestras biológicas |
| Centrífuga de sobremesa 24 X 1,5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; Velocidad máxima: 13.300 rpm (17.000 x g) |
| Placa de Petri bacteriológica Falcon con tapa | Fisher Scientific | 08-757-105 Material de | poliestireno; superficie hidrofóbica |
| Papel de filtro | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grado 1 para cámaras húmedas de placa de Petri |
| FV 3000 microscopio confocal de barrido láser | Olympus | N/A | Para la visualización de transformadores fúngicos' |
| Papel de germinación | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76 # peso pesado para cámaras húmedas de caja de plástico |
| Placas de Petri de vidrio | VWR International | 75845-542 | Tipo 1 clase A, vidrio de borosilicato de 33 expansiones; juego completo (tapa + fondo), para cámaras húmedas de placa de Petri |
| Lana de vidrio | Especialidad química del valle de Ohio | 3350 | Para unidades de filtro de lana de vidrio |
| Hemocitómetro/cámara de recuento de Neubauer y cubreobjetos | VWR International | 15170-172 | 0,1 mm de profundidad de la cámara; viene con dos cubreobjetos de 0,4 mm cubreobjetos de |
| microscopio | Fisher Scientific | 12-553-457 | Vidrio de borosilicato; 100/paquete; 22 mm de largo, 22 mm de ancho |
| Cultivar de maíz Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canadá | CN361 | Matures en 95-105 días; tipo de semilla: Tubos |
| microcentrífuga F1 | Científico de EE. UU. | 1415-2500 | Capacidad de 1,5 mL |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-123 | Corredera de lengüeta blanca Superfrost; 76 mm de largo, 25 mm de ancho |
| Agar de avena (OA) | VWR International | 255210 | Agar de avena Difco, BD; 500 g |
| Esmalte de uñas | Revlon | 43671 | Esmalte de uñas transparente para sellar portaobjetos de microscopio; color 771 Transparente |
| Placa de PCR de 96 pocillos sin faldón | USA Sientific | 1402-9500 Volumen de | placa de 100 uL |
| Mortero para tubos de microcentrífuga | USA Scientific | 1415-5390 | Punta cónica; material de polipropileno |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM objetivo de agua | Olympus | 1-UB933 | Compatible con el microscopio confocal Olympus FV 3000 |
| Agar patata dextrosa (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Medios de dextrosa patata, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Medio de cultivo premium de uso general formulado para proporcionar a equilibrio entre la retención de agua y el drenaje adecuado |
| los conos SC10 | Megatienda de invernaderos | CN-SS-SC-10B | 1,5 pulgadas de diámetro, 8,25 pulgadas de profundidad y un volumen de 164 mL |
| Bandeja de conos SC10 | Invernadero Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 pulgadas de largo x 12 pulgadas de ancho x 6.75 pulgadas de alto; Sostiene hasta 98 de los conos SC10 Hoja de |
| afeitar de un solo filo Thermo | Fisher Scientific | 17-989-145 | Hoja AccuTec; material de acero; hoja de 38 mm de longitud |
| Contenedores/cajas de almacenamiento con cierre de pestillo | Objetivo | 002-02-0405 | Cajas de almacenamiento de visión clara para cámara de humedad; Dimensiones exteriores: 23 5/8 pulgadas x 16 3/8 pulgadas x 6 1/2 pulgadas; Capacidad de 32 cuartos de galón |
Referencias
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D.
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Reimpresiones y permisos
