Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Resumen

La red de microtúbulos es un componente esencial del sistema nervioso. Las mutaciones en muchas proteínas reguladoras de los microtúbulos se asocian con trastornos del neurodesarrollo y enfermedades neurológicas, como la proteína Tau asociada a microtúbulos a enfermedades neurodegenerativas, la proteína cortante de microtúbulos Spastin y Katanin 60 causan paraplejia espástica hereditaria y anomalías del neurodesarrollo, respectivamente. La detección de redes de microtúbulos en las neuronas es ventajosa para dilucidar la patogénesis de los trastornos neurológicos. Sin embargo, el pequeño tamaño de las neuronas y la densa disposición de los haces de microtúbulos axonales dificultan la visualización de las redes de microtúbulos. En este estudio, describimos un método para la disección de la unión neuromuscular larvaria y las células musculares, así como la inmunotinción de α-tubulina y la proteína Futsch asociada a microtúbulos para visualizar redes de microtúbulos en Drosophila melanogaster. La unión neuromuscular nos permite observar los microtúbulos pre y postsinápticos, y el gran tamaño de las células musculares en la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Aquí, mutando y sobreexpresando Katanin 60 en Drosophila melanogaster, y luego examinando las redes de microtúbulos en la unión neuromuscular y las células musculares, revelamos con precisión el papel regulador de Katanin 60 en el neurodesarrollo. Por lo tanto, combinado con las poderosas herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Introducción

Los microtúbulos (MT), como uno de los componentes estructurales del citoesqueleto, desempeñan un papel importante en diversos procesos biológicos, incluida la división celular, el crecimiento y la motilidad celular, el transporte intracelular y el mantenimiento de la forma celular. La dinámica y la función de los microtúbulos están moduladas por interacciones con otras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin y Kinesin 1,2,3,4,5.

En las neuronas, los microtúbulos son esenciales ....

Protocolo

1. Disección de larvas

NOTA: La solución diseccionadora de solución salina similar a la hemolinfa (HL3.1)¹⁸ y la solución de fijación al 4% de paraformaldehído (PFA)^19,20 se utilizan a temperatura ambiente porque los microtúbulos se despolimerizan cuando la temperatura es demasiado baja.

1. Escoge una larva errante de^3er estadio con pinzas largas y romas. Lávelo con HL3.1 y colóquelo en la placa de disección bajo el microscopio estereoscópico.
   NOTA: La larva errante del^3er estadio se identifica por el espirácul....

Resultados

Demostramos un procedimiento paso a paso para visualizar la red de microtúbulos tanto en las uniones neuromusculares (NMJ) como en las células musculares. Después de la disección de acuerdo con el diagrama esquemático (Figura 1A-E), se realiza la inmunotinción y posteriormente se observan las imágenes y se recogen bajo un microscopio confocal láser o un microscopio de fluorescencia estereoscópica (Figura 1F, G).

Discusión

Aquí se describe un protocolo para la disección e inmunotinción de las uniones neuromusculares y las células musculares de las larvas de Drosophila . Hay varios puntos esenciales a tener en cuenta. En primer lugar, evitar lesiones en los músculos observados es crucial durante el proceso de disección. Puede valer la pena arreglar el filete antes de extraer los órganos internos para evitar el contacto directo entre las pinzas y los músculos. Para evitar daños musculares o la separación de la epidermis larvaria, es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	diluido 1:200
Medio de montaje antidecoloración mejorado	Beyotime	P0128M
FV10-ASW Microscopio confocal	Olympus Goat
Fluor 488 conjugado	Thermo Fisher	A-11001	diluido 1:1.000
Microscopio confocal láser LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Anticuerpo anti-Futsch de ratón	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	22C10	diluido 1:50
Anticuerpo anti-&alfa;-tubulina de ratón	Sigma	T5168	diluido 1:1.000
Paraformaldehído	Wako	168-20955	Concentración final: 4% en PB Tampón
de acero inoxidable Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm
Diam Microscopio estereoscópico SMZ161	Motic
fluorescencia estereoscópica microscopio BX41	Olympus
Texas Cabra conjugada roja anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		diluido 1:100
TO-PRO(R) 3 yoduro	Invitrogen	T3605	diluido 1:1.000
Transfer agitador decolorante TS-8	Kylin-Bell instrumentos de laboratorio	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Pinzas	Dumont	500342

anti-Mouse, Alexa