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Artículo de método

Enfoques complementarios para interrogar el flujo de mitofagia en las células β pancreáticas

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DOI:

10.3791/65789

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15 de septiembre de 2023

 ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe dos métodos para el análisis cuantitativo de la mitofagia en las células β pancreáticas: en primer lugar, una combinación de colorantes específicos de mitocondrias permeables a las células y, en segundo lugar, un indicador de mitofagia codificado genéticamente. Estas dos técnicas son complementarias y pueden implementarse en función de necesidades específicas, lo que permite flexibilidad y precisión para abordar cuantitativamente el control de calidad mitocondrial.

Resumen

La mitofagia es un mecanismo de control de calidad necesario para mantener una función mitocondrial óptima. La mitofagia disfuncional de las células β da como resultado una liberación insuficiente de insulina. Las evaluaciones cuantitativas avanzadas de la mitofagia a menudo requieren el uso de indicadores genéticos. El modelo de ratón mt-Keima, que expresa una sonda radiométrica de doble excitación sensible al pH dirigida a las mitocondrias para cuantificar la mitofagia mediante citometría de flujo, se ha optimizado en células β. La relación entre las emisiones de longitud de onda de mt-Keima ácidas y neutras se puede utilizar para cuantificar de forma robusta la mitofagia. Sin embargo, el uso de reporteros genéticos de mitofagia puede ser un desafío cuando se trabaja con modelos genéticos complejos de ratones o células difíciles de transfectar, como los islotes humanos primarios. Este protocolo describe un nuevo método complementario basado en colorantes para cuantificar la mitofagia de células β en islotes primarios mediante MtPhagy. MtPhagy es un colorante sensible al pH y permeable a las células que se acumula en las mitocondrias y aumenta su intensidad de fluorescencia cuando las mitocondrias se encuentran en entornos de pH bajo, como los lisosomas durante la mitofagia. Al combinar el colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicador de Zn2+ que selecciona para las células β, y tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, el flujo de mitofagia se puede cuantificar específicamente en las células β mediante citometría de flujo. Estos dos enfoques son altamente complementarios, lo que permite flexibilidad y precisión en la evaluación del control de calidad mitocondrial en numerosos modelos de células β.

Introducción

Las células β pancreáticas producen y secretan insulina para satisfacer las demandas metabólicas, y la disfunción de las células β es responsable de la hiperglucemia y la aparición de diabetes tanto en la diabetes tipo 1 como en la diabetes tipo 2. Las células β acoplan el metabolismo de la glucosa con la secreción de insulina a través de la energía mitocondrial y la producción metabólica, que dependen de una reserva de masa mitocondrial funcional 1,2,3. Para mantener una función óptima de las células β, las células β dependen de los mecanismos de control de calidad mitocondrial para eliminar las mitocondrias envejecidas o dañadas y preservarla masa mitocondrial funcional. La autofagia mitocondrial selectiva, también conocida como mitofagia, es un componente clave de la vía de control de calidad mitocondrial.

Las evaluaciones de la mitofagia en células vivas a menudo se basan en los cambios en el pH mitocondrial que ocurren durante la mitofagia. Las mitocondrias tienen un pH ligeramente alcalino, y las mitocondrias sanas normalmente residen en el citosol de pH neutro. Durante la mitofagia, las mitocondrias dañadas o disfuncionales se incorporan selectivamente a los autofagosomas y, finalmente, se eliminan dentro de los lisosomas ácidos5. Varios modelos de ratones reporteros de mitofagia transgénica in vivo, como mt-Keima6, mitoQC7 y CMMR8, así como sondas de mitofagia transfectables, como el plásmido Cox8-EGFP-mCherry9, utilizan este cambio de pH para proporcionar evaluaciones cuantitativas de la mitofagia. El uso de ratones transgénicos que expresan la sonda radiométrica de doble excitación sensible al pH mt-Keima se ha optimizado para las evaluaciones de mitofagia en islotes y células β mediante citometría de flujo10,11. La relación entre las emisiones de longitud de onda mt-Keima ácidas y neutras (la relación entre la excitación ácida de 561 nm y la neutra de 480 nm) puede utilizarse para cuantificar de forma robusta la mitofagia 6,12.

Este protocolo describe un enfoque optimizado para evaluar el flujo mitofagia en islotes primarios y células β aisladas de ratones transgénicos mt-Keima10,11. Si bien mt-Keima es una sonda altamente sensible, requiere complicados esquemas de cría de animales o la transfección de células, lo que a menudo puede ser un desafío cuando se trabaja en combinación con otros modelos genéticos o con islotes humanos primarios. Además, el uso de múltiples láseres y detectores de fluorescencia para identificar poblaciones celulares neutras y ácidas puede limitar el uso combinatorio de otros reporteros fluorescentes.

Para superar estos desafíos, este protocolo también describe un método complementario, basado en colorantes de un solo canal fluorescente, para la detección robusta de mitofagia en células β de islotes de ratón aislados. Este enfoque, conocido como el método MtPhagy, utiliza una combinación de tres colorantes permeables a las células para seleccionar las células β, cuantificar las poblaciones celulares que se someten activamente a la mitofagia y evaluar el potencial de membrana mitocondrial (MMP o Δψm) simultáneamente.

El primero de estos colorantes es Fluozin-3-AM, un indicador de Zn2+ permeable a las células con un Ex/Em 494/516 nm13. Los islotes de ratón comprenden una población heterogénea de células funcionalmente distintas, incluidas las células α, β, δ y PP. Las células β comprenden aproximadamente el 80% de las células dentro del islote de ratón y se pueden distinguir de otros tipos de células de islotes debido a su alta concentración de Zn2+ dentro de los gránulos de insulina14,15, lo que permite la identificación de las células β como laalta población de Fluozin-3-AM. El colorante MtPhagy, un colorante sensible al pH que se inmoviliza en las mitocondrias a través de un enlace químico y emite fluorescencia débil, también se utiliza en este protocolo16. Tras la inducción de la mitofagia, las mitocondrias dañadas se incorporan al lisosoma ácido, y el colorante MtPhagy aumenta su intensidad de fluorescencia en el entorno de pH bajo (Ex/Em 561/570-700 nm).

Además, la tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), se utiliza para evaluar la MMP. TMRE es un colorante permeable a las células con carga positiva (Ex/Em 552/575 nm) que es secuestrado por las mitocondrias sanas debido a la carga negativa relativa sostenida por su potencial de membrana17. Las mitocondrias dañadas o poco saludables disipan su potencial de membrana, lo que resulta en una disminución de la capacidad para secuestrar TMRE. Utilizando estos colorantes juntos, las células de β que se someten a mitofagia se pueden identificar como la poblaciónaltade Fluozin MtPhagyaltaTMREbaja a través de la citometría de flujo. Dado que la mitofagia es un proceso dinámico y no estático, este protocolo se optimizó para evaluar el flujo de mitofagia utilizando valinomicina, un ionóforo de K+ que induce la mitofagia después de la disipación de MMP18. La comparación de la mitofagia en presencia y ausencia de valinomicina permite evaluar el flujo de mitofagia en diferentes grupos de muestras.

La naturaleza basada en colorantes del enfoque actual permite extrapolarlo a islotes humanos y otros tipos de células difíciles de transfectar y evita la necesidad de complicados esquemas de cría de animales, a diferencia del protocolo mt-Keima. El objetivo general de este protocolo es cuantificar la mitofagia en células β a nivel de una sola célula a través de dos métodos independientes basados en citometría de flujo. En conjunto, este protocolo describe dos métodos potentes y complementarios que permiten tanto precisión como flexibilidad en el estudio cuantitativo del control de calidad mitocondrial.

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Protocolo

Los estudios en animales presentados en este protocolo fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Para este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de veinte semanas de edad, ya sea con una dieta regular de grasas (RFD) de 15 semanas o una dieta alta en grasas (HFD).

1. Evaluación de la mitofagia a través del enfoque MtPhagy basado en colorantes (Método 1)

  1. Preparación y tratamiento de los islotes de ratón
    1. Realice el cultivo de islotes y la exposición a valinomicina siguiendo los pasos que se indican a continuación.
      1. Aislar islotes de ratones con dieta regular en grasas (RFD) o en ratones con dieta alta en grasas (HFD, 60 kcal% Fat19), siguiendo los métodos descritos anteriormente 2,10.
      2. Muestras de islotes de cultivo durante la noche a 37 °C en medio RPMI suplementado con 100 unidades/mL de antibiótico-antibiótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES y 10% de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales). Este medio se denominará "medio de islotes".
      3. Con una pipeta, recoja 100 islotes por afección en placas de Petri de 6 cm en 2 ml de medio de islote.
        NOTA: Condiciones utilizadas para este protocolo: (1) Control sin teñir: islotes de RFD sin teñir; (2) Control solo DAPI: islotes RFD teñidos con DAPI; (3) Control de Fluozin-3-AM solamente: islotes de RFD teñidos con Fluozin-3-AM; (4) Control de MtPhagy solamente: islotes de RFD teñidos con MtPhagy; (5) Control solo de TMRE: islotes de RFD teñidos con TMRE; (6) RFD sin tratar: islotes de RFD teñidos con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM y DAPI; (7) Islotes de RFD expuestos a valinomicina: islotes de RFD expuestos a valinomicina y teñidos con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM y DAPI; (8) HFD no tratada: islotes HFD teñidos con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM y DAPI; (9) Islotes HFD expuestos a valinomicina: islotes HFD expuestos a valinomicina y teñidos con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM y DAPI.
      4. Para las condiciones (7) y (9) (ver NOTA anterior) expuestas a valinomicina, añadir 2 μL de 250 nΜ de stock de valinomicina (ver Tabla de Materiales) a los islotes en la placa de Petri durante 3 h para inducir la mitofagia.
    2. Realice la disociación de una sola célula.
      1. Después de 3 h de exposición a la valinomicina, recoja 100 islotes de cada afección en tubos de microcentrífuga separados con una pipeta.
      2. Centrifugar los islotes a 350 x g durante 1 min a 10 °C y desechar el sobrenadante con una pipeta.
      3. Lavar las muestras 2 veces con 1 ml 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS), con pasos de centrifugado (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavado. Deseche el sobrenadante con una pipeta después de cada lavado.
      4. Para disociar los islotes en células individuales, añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (precalentada a 37 °C) al tubo de microcentrífuga de una muestra para evitar la digestión excesiva de los islotes. Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente hasta que los islotes estén visiblemente dispersos.
      5. Agregue inmediatamente 1 ml de medio de islote precalentado para neutralizar la tripsina. Repita la tripsinización y neutralización para cada muestra, una a la vez.
      6. Centrifugar las muestras a 500 x g durante 5 min a 10 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta, con cuidado de no alterar el gránulo.
        NOTA: El gránulo será delicado para las muestras expuestas a valinomicina.
      7. Lave las muestras 2 veces con medio RPMI, sin rojo de fenol, suplementado con 100 unidades/ml de antibiótico-antibiótico, 50 unidades/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de HEPES y 10% de albúmina sérica bovina (BSA). Este medio se denominará "medio de flujo de islotes". Incluye pasos de centrifugado (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavado. Deseche el sobrenadante con una pipeta después de cada lavado.
    3. Tiña las células con MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM y DAPI para prepararlas para la citometría de flujo.
      1. Vuelva a suspender las muestras de islotes en 500 μL de medio de flujo de islotes.
      2. Agregue 0,25 μL de 100 μM de material de MtPhagy (consulte la Tabla de materiales) a los tubos que reciben colorante MtPhagy (condiciones 4, 6, 7, 8 y 9, NOTA al paso 1.1.1).
      3. Agregue 0,25 μL de 100 μM de material TMRE (consulte la Tabla de materiales) a los tubos que reciben colorante TMRE (condiciones 5, 6, 7, 8 y 9).
      4. Agregue 0,25 μL de 1 mM de material de Fluozin-3-AM (ver Tabla de Materiales) a los tubos que reciben colorante de Fluozin-3-AM (condiciones 3, 6, 7, 8 y 9).
      5. Tubos de vórtice a baja velocidad durante 5 s para mezclar.
      6. Envuelva los tubos de microcentrífuga en papel de aluminio para protegerlos de la luz e incube a 37 °C durante 30 min. A mitad de la incubación, los tubos de vórtice se mezclan a baja velocidad durante 5-10 s.
      7. Después de la incubación, centrifugar las muestras a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
      8. Vuelva a suspender las muestras en un medio de flujo de islotes de 500 μL. Agregue 0,2 μg/mL DAPI (consulte la tabla de materiales) a las condiciones 2, 6, 7, 8 y 9.
      9. Centrifugar las muestras a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender en 500 μL de medio de flujo de islotes.
      10. Coloque las muestras en hielo.
  2. Citometría de flujo
    1. Ponga en marcha el instrumento (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Cualquier citómetro de flujo con los filtros apropiados funcionará. En este estudio se utilizaron los siguientes filtros: (1) VL1 para DAPI: Excitación/Emisión - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitación/Emisión - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 para colorante MtPhagy: Excitación/Emisión - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 para TMRE: Excitación/Emisión - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Ajuste los voltajes para la dispersión directa (FSC) y lateral (SSC) para asegurarse de que las poblaciones celulares estén en el centro del diagrama de dispersión. Para este protocolo, los voltajes utilizados fueron de 120 V para FSC y 260 V para SSC para garantizar que las celdas caigan uniformemente dentro del FSC-A vs. Gráfico SSC-A (Figura 1A).
    3. Para excluir celdas no individuales, agregue una puerta rectangular en FSC-H vs. FSC-W seguido de SSC-H vs. SSC-W (Figura 1B,C).
    4. Ajuste los voltajes y la compensación de DAPI para filtrar las celdas β activas. Establezca las puertas de fluorescencia para cada fluoróforo utilizado en función de la muestra de RFD sin teñir (Figuras 1D-F).
      NOTA: Voltajes utilizados para cada canal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. Una vez establecidas las puertas, recopile 10 000 eventos por muestra.
      NOTA: Utilizando este enfoque de compuerta, se evaluaron los niveles de mitofagia en condiciones basales y tras la inducción de valinomicina en los islotes de RFD y HFD (Figura 2).
    6. Guarde los datos como archivos FCS para su análisis.

2. Evaluación de la mitofagia utilizando el reportero mt-Keima codificado genéticamente (Método 2)

  1. Preparación de islotes de ratón y disociación de una sola célula
    1. Realice el cultivo de islotes y la exposición a valinomicina siguiendo los pasos que se indican a continuación.
      1. Aislar islotes pancreáticos de ratones de tipo salvaje (WT) y mt-Keima/+ (mt-Keima)6. En este método, se utilizaron ratones machos WT o MT-Keima/+ alimentados con RFD de 20 semanas de edad.
      2. Muestreo de islotes de cultivo durante la noche a 37 °C en medio de islotes.
      3. Con una pipeta, recoja 100 islotes por afección en placas de Petri de 6 cm con 2 ml de medio de islote.
        NOTA: Condiciones utilizadas para este protocolo: (1) Control sin teñir: islotes WT sin teñir; (2) Control solo DAPI: islotes WT teñidos con DAPI; (3) Control de Fluozin-3-AM solamente: islotes WT teñidos con Fluozin-3-AM; (4) control solo mt-Keima: islotes mt-Keima/+ no teñidos; (5) Sin tratar: islotes mt-Keima/+ teñidos con Fluozin-3-AM y DAPI; (6) Valinomicina: islotes mt-Keima/+ expuestos a valinomicina y teñidos con Fluozin-3-AM y DAPI.
      4. Para la condición (6) con exposición a valinomicina, añadir 2 μL de stock de valinomicina de 250 nM a los islotes en la placa de Petri durante 3 h para inducir la mitofagia.
    2. Realice la disociación de una sola célula.
      1. Realice los pasos de disociación de una sola célula, como se describe en el paso 1.1.2.
    3. Tiñe las células con Fluozin-3-AM y DAPI.
      1. Vuelva a suspender las muestras de islotes en 500 μL de medio de flujo de islotes.
      2. Agregue 0,25 μL de 1 mM de material de Fluozin-3-AM a los tubos que reciben colorante de Fluozin-3-AM (condiciones 3, 5 y 6).
      3. Incubar las células a 37 °C y proceder al tratamiento con DAPI, tal como se describe en los pasos 1.1.3.5-1.3.10.
  2. Citometría de flujo
    1. Inicie el instrumento. Cualquier citómetro de flujo con los filtros apropiados funcionará.
      NOTA: En este estudio se utilizaron los siguientes filtros: (1) VL1 para DAPI: Excitación/Emisión - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitación/Emisión - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 para mt-Keima neutro: Excitación/Emisión - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 para ácido mt-keima: Excitación/Emisión - 561 nm/620 nm (15 nm).
    2. Ajuste los voltajes FSC y SSC y excluya las celdas que no sean individuales como se describe en los pasos 1.2.2-1.2.3 (Figuras 3A-C).
    3. Ajuste los voltajes y la compensación para DAPI, Fluozin-3-AM y mt-Keima utilizando controles positivos únicos y sin tinción (condiciones 1-4) para garantizar que las poblaciones celulares positivas de fluorescencia se distingan de las células no teñidas. Una vez que se haya aplicado la compensación adecuada a cada canal, configure la puerta negativa DAPI y las puertas positivas Fluozin-3-AM para filtrar las células β activas (Figuras 3D-E).
    4. Establezca un esquema de compuerta triangular utilizando la muestra positiva mt-Keima (condición 4) para identificar poblaciones celulares ácidas y neutras (Figura 3F).
      NOTA: Voltajes típicamente utilizados para cada canal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. Una vez establecidas las puertas, recopile 10 000 eventos por muestra. Los esquemas de compuerta para las condiciones 5 y 6 se ilustran en la Figura 3A-G.
    6. Guarde los datos como archivos FCS para su análisis.

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Resultados

Evaluación de la mitofagia a través del enfoque MtPhagy basado en colorantes
Este enfoque basado en colorantes se optimizó para analizar el flujo de mitofagia dentro de las células primarias de ratón β sin la necesidad de un reportero genético, utilizando Fluozin-3-AM, TMRE y MtPhagy, así como DAPI para excluir las células muertas. Al combinar estos colorantes con valinomicina para inducir la mitofagia, este protocolo describe un método basado en colorantes para medir selectivamente el flujo de mitofa...

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Discusión

Este protocolo describe dos métodos complementarios para cuantificar el flujo mitofagia en islotes primarios disociados de ratón. Utilizando el método mt-Keima, un aumento en la mitofagia se cuantificó como un aumento de la proporción de células ácidas (561 nm)/neutras (405 nm), mientras que en el método MtPhagy, el aumento del flujo de mitofagia se cuantificó como un aumento en la población de célulasbajas de FluozinaltaMtPhagyaltaTMRE. Estos métodos permiten realizar evaluaciones rápida...

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Divulgaciones

SAS ha recibido subvenciones de Ono Pharmaceutical Co., Ltd. y es consultor de Novo Nordisk.

Agradecimientos

E.L-D. agradece el apoyo de los NIH (T32-AI007413 y T32-AG000114). SAS agradece el apoyo de la JDRF (COE-2019-861), los NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), el Departamento de Asuntos de Veteranos (I01 BX004444), la familia Brehm y la familia Anthony.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antibiótico-AntimicóticoLife Technologies15240-062
Attune NxT Citómetro de flujoThermofisher ScientificA24858
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich317275
Choque térmico libre de ácidos grasos BSApolvo EquitechBAH66
Suero fetal bovinoGemini Bio900-108
Fluozina-3AM Thermofisher Scientific F24195100 μ g Fluozin-3AM polvo reconstituido en 51 μ L DMSO y 51 μ L Pluronic F-127 para alcanzar 1 mM de stock.
Gibco  RPMI 1640 MedioFisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MtPhagy tinteDojindoMT02-105 μ g MtPhagy en polvo reconstituido con 50 μ L DMSO para llegar a 100 μ M de acciones. 
Tinte MtPhagyDojindoMT02-10
Penicilina-Estreptomicina (100x)Life Technologies15140-1221x Solución utilizada en procotol diluyendo 1:10 en ddH2O
Solución salina tamponada con fosfato, 10xFisher ScientificBP399-201x Solución utilizada en procotol diluyendo 1:10 en ddH2O
Piruvato de sodio (100x)Life Tecnologías11360-0705 μ g MtPhagy en polvo reconstituido con 50 μ L DMSO para llegar a 100 μ M de acciones. 
TMRE [Tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato]AnaspecAS-88061TMRE polvo reconstituido en DMSO para alcanzar 100 μ M stock.
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenolThermofisher Scientific25300054
ValinomycinSigmaV0627Valinomicina en polvo reconstituido en DMSO para alcanzar un stock de 250 nM.

Referencias

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