La fracción vascular estromal (FSV) aislada mecánicamente en combinación con un hidrogel de fibrina ofrece un portador fácil y eficiente de células estromales viables derivadas del tejido adiposo para diversas indicaciones, incluida la ingeniería de tejidos o la cicatrización de heridas. Aquí, presentamos la preparación de una construcción mecánica de hidrogel de fibrina SVF (mSVF) para investigación traslacional y aplicación clínica.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La combinación de fracción vascular estromal aislada mecánicamente e hidrogel de fibrina: un protocolo de procesamiento
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El potencial regenerativo de las células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) ha ganado una atención significativa en la investigación regenerativa y traslacional. En el pasado, la extracción de estas células del tejido adiposo requería un proceso basado en enzimas de varios pasos, lo que daba como resultado una mezcla celular heterogénea formada por ACS y otras células, que se denominan conjuntamente fracción vascular estromal (SVF). Los protocolos de aislamiento SVF mecánico (mSVF) introducidos más recientemente requieren menos tiempo y evitan las preocupaciones regulatorias. Recientemente propusimos un protocolo que genera mSVF rico en células estromales basado en una combinación de emulsificación y centrifugación. Un problema actual en la aplicación de mSVF para la aplicación de terapia de heridas es la falta de un andamio que brinde protección contra la manipulación mecánica y la desecación. En el pasado, se ha demostrado que los hidrogeles de fibrina son un complemento útil en la transferencia celular para la cicatrización de heridas. En el presente trabajo, delineamos los pasos de preparación de una construcción de hidrogel de fibrina mSVF como un enfoque novedoso para la investigación traslacional y la aplicación clínica.
Introducción
En los últimos años, la cirugía plástica regenerativa se ha convertido en un pilar adicional de la cirugía plástica1. La cirugía plástica regenerativa tiene como objetivo restaurar el tejido dañado mediante la transferencia de factores solubles, células y tejido extraído del paciente para promover la restauración del tejido de una manera mínimamente invasiva2. Las células madre derivadas del tejido adiposo (ASC) han ganado atención debido a su capacidad para diferenciarse en múltiples linajes mesenquimales, lo que las convierte en un candidato prometedor parala investigación de la medicina regenerativa. Su perfil de citocinas muestra efectos angiogénicos, inmunosupresores y antioxidantes4.
Tradicionalmente, las ASC se aislaban del tejido adiposo mediante un abordaje enzimático con colagenasa, lo que daba lugar a una fracción vascular estromal (FSV), que posteriormente se cultivaba para obtener las ASC. Estas tecnologías de laboratorio son costosas, lentas y, lo que es más importante, están sujetas a estrictas restricciones regulatorias, lo que complica la traducción clínica 5,6,7. Por el contrario, los protocolos de fracción vascular estromal (mSVF) aislados mecánicamente ofrecen los beneficios clínicos no solo de evitar los problemas regulatorios, sino también de minimizar los riesgos de contaminación 8,9.
Se han descrito numerosos protocolos para aislar mecánicamente la FSV10. Entre estos, el protocolo de cambio publicado por Tonnard et al. ha ganado la mayor atención entre los cirujanos regenerativos11. La grasa recolectada a través de los procedimientos estándar de liposucción, conocidos como lipoaspirados, se puede transferir entre dos jeringas de mano conectadas a un dispositivo de conexión, lo que da como resultado una forma líquida conocida como nanograsa. Los beneficios obvios de estos protocolos de aislamiento de mSVF incluyen la reducción del tiempo de procesamiento, el riesgo mínimo de contaminación, ya que todo el procedimiento se realiza en un entorno bien controlado, y la posible traducción clínica inmediata12.
La evidencia preclínica y clínica indica que las propiedades de mSVF, incluyendo la viabilidad celular y las propiedades de cicatrización de heridas, son comparables a los métodos estándar de aislamiento enzimático12. El potencial de mSVF para promover la cicatrización de heridas en modelos de rata y murinos fue validado a través de estudios in vivo por Chen et al. y Sun et al.13,14. Sin embargo, hay una falta de datos disponibles sobre la cicatrización de heridas en el entorno clínico. Se reportaron resultados prometedores cuando un grupo de estudio realizó un trasplante autólogo de grasa en un paciente de 83 años que tenía una herida con un implante expuesto en una fractura abierta de la extremidad inferior15. Además, Lu et al. realizaron una comparación entre la fSVF y el tratamiento de heridas con presión negativa en una cohorte de 20 pacientes con heridas crónicas16. Sus hallazgos revelaron que el tratamiento con mSVF resultó en una mayor tasa de cicatrización de heridas en comparación con la terapia de heridas con presión negativa16. En ambos estudios mencionados se inyectó mSVF solo o en combinación con un gel en el área de la herida objetivo15,16.
En el escenario del mundo real, la aplicación clínica de mSVF es limitada debido a las tasas de absorción impredecibles en los sitios receptores17,18. Los andamios prometen un remedio para este problema, ya que ayudan en la retención celular, la vascularización y la integración en el tejido circundante 19,20,21. Los hidrogeles de fibrina son una herramienta de uso común, aprobada por la FDA y utilizada en disciplinas quirúrgicas y se ha demostrado que son un portador eficaz de mSVF19. El gel de fibrina es un material biopolimérico que ofrece varias ventajas para funcionar como portador celular: presenta una excelente biocompatibilidad, promueve la adhesión celular y es capaz de degradarse de manera controlable 22,24,25. Además, muestra una reacción inflamatoria y de cuerpo extraño mínima y se absorbe fácilmente durante el curso natural de la cicatrización de heridas22. Creemos que las diversas capacidades regenerativas de las células mSVF mencionadas y la ventajosa combinación con un hidrogel de fibrina pueden proporcionar un enfoque innovador para mejorar los procesos de cicatrización de heridas. En general, este enfoque permite una administración tópica eficiente de células mSVF viables. Presentamos el protocolo que combina mSVF con un hidrogel de fibrina destinado a la aplicación en la cicatrización de heridas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los donantes adultos dieron su consentimiento informado por escrito para permitir el uso posterior de las muestras de tejido recolectadas. El protocolo sigue los lineamientos del comité de ética en investigación en humanos de nuestra institución.
1. Recolección de tejido adiposo
- Recolección del tejido adiposo mediante la realización de una liposucción estándar en una técnica convencional de recolección de grasa descrita en publicaciones anteriores26,27. Asegúrese de usar una solución tumescente que consista en lactato de ringer regular y epinefrina en una proporción de 1: 200,000.
- Realizar la liposucción con una cánula de aspiración de 4 mm, bajo presión negativa y vibración, en una bolsa estéril. Transfiera la grasa recolectada al laboratorio de inmediato.
2. Aislamiento mSVF
- Realice los siguientes pasos (secciones 2 y 3) en una campana de cultivo celular para proporcionar un área de trabajo aséptica. Use una bata de laboratorio regular y guantes para garantizar el nivel de seguridad biológica 2.
- Preparar el medio de cultivo: Complemente 500 mL de Medio de Águilas Modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa con 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 5 mL de penicilina-estreptomicina.
- Transfiera el lipoaspirado a un tubo centrífugo de 50 mL.
- Transfiera el lipoaspirado a una jeringa estéril Luer-lock de 20 ml y conecte un conector de 1,4 mm. Asegúrese de que no haya aire dentro de la jeringa.
- Conecte una segunda jeringa Luer-lock de 20 ml al lado contralateral del conector de 1,4 mm.
- Empuje el tejido adiposo de una jeringa a la otra un total de 30 veces.
- Transfiera la grasa emulsionada a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mL.
- Centrifugar la grasa emulsionada a 500 x g durante 10 min.
- Después de la centrifugación, deseche la capa superior aceitosa. A continuación, recoja la capa central purificada de mSV. Transfiéralo a un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml y deseche la fase acuosa.
- Llene el tubo de centrífuga con medio de cultivo (desde el paso 2.2) hasta la marca de 40 mL.
- Coloque el tubo de centrífuga en la centrífuga y vuelva a centrifugar a 500 x g durante 5 min.
- Recoja la capa mSVF resultante y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL.
3. Fabricación de hidrogel mSVF-fibrina
- Combine 100 μL de mSVF con 10 μL de trombina (100 U/mL), 10 μL de CaCl2 (80 mM) y 70 μL de ácido tranexámico (100 mg/mL) en un tubo estéril de 1,5 mL.
- Utilice una punta de pipeta nueva para añadir 10 μL de fibrinógeno (100 mg/mL) como último componente, poco antes de la aplicación. Tenga en cuenta que la polimerización en hidrogel se observa en aproximadamente 10-30 s.
- Para la aplicación clínica, realice este último paso poco antes de la administración tópica, preferiblemente al lado de la cama. Para fines analíticos, transfiéralo a una placa de 12 pocillos mediante pipeteo.
4. Ensayo de viabilidad e histología
- Pipetear 200 μL de la mezcla de mSVF-hidrogel del paso 3.3 en un pocillo de una placa de 12 pocillos.
- Pipetear 100 μL de la colección mSVF (paso 2.12.) en un pocillo y un control positivo.
- Pipetear 200 μL de hidrogel de fibrina solo en un pocillo como control negativo.
- Coloque la placa de 12 pocillos en una incubadora normal a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min.
- Pasado este tiempo, añadir 1 mL de resazurina (azul de alamar, 10% de concentración, diluido en medio de cultivo) a cada pocillo.
- Después de la adición, incubar la placa de 12 pocillos a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- Después de 24 h, mida la primera intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas multimodo de imágenes celulares con una longitud de onda de excitación de 555 nm y una longitud de onda de emisión de 596 nm.
- Realice mediciones consecutivas de la intensidad de fluorescencia en los días 3 y 7.
- Si es necesaria una evaluación histológica, detener el experimento los días 1, 3 y 7 y fijar el hidrogel de fibrina en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24 h. Después de la fijación, añadir un 1% de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y almacenar a 4 °C.
- Incrustar los hidrogeles en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y seccionar bloques congelados de 10 μm de espesor con un criostato. Teñir las secciones con una solución de hematoxilina y eosina (H&E) de acuerdo con los protocolos estándar28.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Ensayo de resazurina
En primer lugar, examinamos la viabilidad celular in vitro de las células mSVF. Para ello, realizamos un ensayo de viabilidad de células de resazurina en los días 0, 3 y 7. La viabilidad celular a los días 0, 3 y 7 de un total de cuatro muestras se muestra en la Figura 1. Los valores del día 0 sirven como referencia y se establecieron como 100%. Al día 3, el control positivo (mSVF) mostró una ligera disminución hasta el 78,92% (± 5,33%), mien...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El aislamiento mecánico de SVF proporciona una alternativa elegante al enfoque enzimático tradicional y ofrece un amplio acceso para la aplicación clínica29. De hecho, la mSVF, tal como se propone en el presente manuscrito, ya está en uso clínico para el tratamiento de tejidos blandos de cicatrices o como complemento para procedimientos cosméticos30. El protocolo presentado aquí proporciona un método sencillo para la administración tópica e...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Bong-Sung Kim cuenta con el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (KI 1973/2-1) y la Fundación Novartis para la Investigación Médico-Biológica (#22A046).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 12 pocillos | Sarstedt | 83.3921 | |
| 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Biochemica | A1001.0010 | |
| 50 mL-Falcon | Falcon | 352070 | |
| Toallas Absorbentes, Paquete de Dos | Driza | 89701 | |
| Alamar azul 25 mL | Invitrogen | DAL1025 | |
| Albúmina, Bovino (BSA) | VWR | 0332-500G | |
| Biotek Cytation 5 | Lector de microplacas multimodo de imágenes celulares de | Agilent | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Microtomo | criostato | ||
| DMEM con 4,5 g/L de glucosa, con L-Glutamina, con piruvato de sodio | VWR | 392-0416 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Epinefrina | Sigma-Aldrich | E4250 | |
| Suero Fetal Bovino | Biowest | S181H-500 | |
| Fibrinógeno Plasma Humano 100 mg | Sigma-Aldrich | 341576-100MG | |
| Formalina | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Formalina 4% | Formafix | 1308069 | |
| FSC 22-Einbettmedium, blau | Biosystems | 3801481S | |
| Hematoxilina & Solución de eosina | Sigma-Aldrich | H3136 / HT110132 | |
| Timbre lactato s Solución 1000 mL | B Braun | R5410-01 | |
| Cánula Mercedes 4mm | MicroAire | PAL-R404LL | |
| NaCl 0.9% | Bbraun | 570160 | |
| OCT Matriz de Inclusión 125 mL | CellPath | KMA-0100-00A | |
| Paraformaldehído | Fisher Scientific 10342243 | ||
| PBS 1% | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| PenStrep | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Petridish 150mm | Sarstedt | 83.1803 | |
| Phalloidin-iFluor 488 Reactivo | Abcam | ab176753 | |
| Jeringa Estéril 20 mL Luer | HENKE-JECT | 5200-000V0 | |
| Jeringa Estéril 30 mL Luer-Lock | BD | 10521 | |
| Trombina de Plasma Humano | Sigma-Aldrich | T6884-100UN | |
| Ácido tranexámico | Orpha Swiss | 6837093 | |
| Tulipfilter 1.2 | Lencion Surgical | ATLLLL | |
| Tulipfilter 1.4 | Lencion Surgical | ATLLLL |
Referencias
- Daar, A. S., Greenwood, H. L. A proposed definition of regenerative medicine. J Tissue Eng Regen Med. 1 (3), 179-184 (2007).
- Machens, H. G., Mailänder, P. Regenerative medicine and plastic surgery. Chirurg. 76 (5), 474-480 (2005).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
- Gir, P., Oni, G., Brown, S. A., Mojallal, A., Rohrich, R. J. Human adipose stem cells: current clinical applications. Plast Reconstr Surg. 129 (6), 1277-1290 (2012).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Raposio, E., Ciliberti, R. Clinical use of adipose-derived stem cells: European legislative issues. Ann Med Surg (Lond). 24, 61-64 (2017).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plast Reconstr Surg Glob Open. 4 (9), e1017(2016).
- Dykstra, J. A., et al. Concise review: Fat and furious: Harnessing the full potential of adipose-derived stromal vascular fraction. Stem Cells Transl Med. 6 (4), 1096-1108 (2017).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4, 713(2015).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plast Reconstr Surg. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Tiryaki, K. T., Cohen, S., Kocak, P., Canikyan Turkay, S., Hewett, S. In-vitro comparative examination of the effect of stromal vascular fraction isolated by mechanical and enzymatic methods on wound healing. Aesthet Surg J. 40 (11), 1232-1240 (2020).
- Sun, M., et al. Adipose extracellular matrix/stromal vascular fraction gel secretes angiogenic factors and enhances skin wound healing in a murine model. Biomed Res Int. 2017, 3105780(2017).
- Chen, L., et al. Autologous nanofat transplantation accelerates foot wound healing in diabetic rats. Regen Med. 14 (3), 231-241 (2019).
- Lin, Y. N., et al. Fat grafting for resurfacing an exposed implant in lower extremity: A case report. Medicine (Baltimore). 96 (48), e8901(2017).
- Deng, C., Wang, L., Feng, J., Lu, F. Treatment of human chronic wounds with autologous extracellular matrix/stromal vascular fraction gel: A STROBE-compliant study. Medicine (Baltimore). 97 (32), e11667(2018).
- Chung, M. T., et al. Micro-computed tomography evaluation of human fat grafts in nude mice. Tissue Eng Part C Methods. 19 (3), 227-232 (2013).
- Gonzalez, A. M., Lobocki, C., Kelly, C. P., Jackson, I. T. An alternative method for harvest and processing fat grafts: an in vitro study of cell viability and survival. Plast Reconstr Surg. 120 (1), 285-294 (2007).
- Kim, B. S., et al. In vivo evaluation of mechanically processed stromal vascular fraction in a chamber vascularized by an arteriovenous shunt. Pharmaceutics. 14 (2), 417(2022).
- Dryden, G. W., Boland, E., Yajnik, V., Williams, S. Comparison of stromal vascular fraction with or without a novel bioscaffold to fibrin glue in a porcine model of mechanically induced anorectal fistula. Inflamm Bowel Dis. 23 (11), 1962-1971 (2017).
- Mahoney, C. M., Imbarlina, C., Yates, C. C., Marra, K. G. Current therapeutic strategies for adipose tissue defects/repair using engineered biomaterials and biomolecule formulations. Front Pharmacol. 9, 507(2018).
- Li, Y., Meng, H., Liu, Y., Lee, B. P. Fibrin gel as an injectable biodegradable scaffold and cell carrier for tissue engineering. ScientificWorldJournal. 2015, 685690(2015).
- Malafaya, P. B., Silva, G. A., Reis, R. L. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications. Adv Drug Deliv Rev. 59 (4-5), 207-233 (2007).
- Jackson, M. R. Fibrin sealants in surgical practice: An overview. Am J Surg. 182 (2 Suppl), 1s-7s (2001).
- Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (3), H1451-H1460 (2005).
- Alharbi, Z., et al. Conventional vs. micro-fat harvesting: how fat harvesting technique affects tissue-engineering approaches using adipose tissue-derived stem/stromal cells. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 66 (9), 1271-1278 (2013).
- Coleman, S. R. Structural fat grafts: the ideal filler. Clin Plast Surg. 28 (1), 111-119 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
- Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 21 (18), 4252-4260 (2017).
- Pallua, N., Kim, B. S. Microfat and lipoconcentrate for the treatment of facial scars. Clin Plast Surg. 47 (1), 139-145 (2020).
- Pallua, N., Grasys, J., Kim, B. S. Enhancement of progenitor cells by two-step centrifugation of emulsified lipoaspirates. Plast Reconstr Surg. 142 (1), 99-109 (2018).
- Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plast Reconstr Surg. 121 (6), 396e-403e (2008).
- Shoshani, O., et al. The effect of lidocaine and adrenaline on the viability of injected adipose tissue--an experimental study in nude mice. J Drugs Dermatol. 4 (3), 311-316 (2005).
- Girard, A. C., et al. New insights into lidocaine and adrenaline effects on human adipose stem cells. Aesthetic Plast Surg. 37 (1), 144-152 (2013).
- Grambow, F., et al. The impact of lidocaine on adipose-derived stem cells in human adipose tissue harvested by liposuction and used for lipotransfer. Int J Mol Sci. 21 (8), 2869(2020).
- Xiao, S., et al. Mechanical micronization of lipoaspirates combined with fractional CO2 laser for the treatment of hypertrophic scars. Plast Reconstr Surg. 151 (3), 549-559 (2023).
- Zhang, J., et al. Adipose tissue-derived pericytes for cartilage tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 513-521 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose extracellular matrix/stromal vascular fraction gel: A novel adipose tissue-derived injectable for stem cell therapy. Plast Reconstr Surg. 139 (4), 867-879 (2017).
- Williams, S. K., Touroo, J. S., Church, K. H., Hoying, J. B. Encapsulation of adipose stromal vascular fraction cells in alginate hydrogel spheroids using a direct-write three-dimensional printing system. Biores Open Access. 2 (6), 448-454 (2013).
- Denost, Q., et al. Colorectal wall regeneration resulting from the association of chitosan hydrogel and stromal vascular fraction from adipose tissue. J Biomed Mater Res A. 106 (2), 460-467 (2018).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Engineered skin graft with stromal vascular fraction cells encapsulated in fibrin-collagen hydrogel: A clinical study for diabetic wound healing. J Tissue Eng Regen Med. 14 (3), 424-440 (2020).
- Lin, S. D., et al. Injected implant of uncultured stromal vascular fraction loaded onto a collagen gel: In vivo study of adipogenesis and long-term outcomes. Ann Plast Surg. 76 (Suppl 1), S108-S116 (2016).
- Lv, X., et al. Comparative efficacy of autologous stromal vascular fraction and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells combined with hyaluronic acid for the treatment of sheep osteoarthritis. Cell Transplant. 27 (7), 1111-1125 (2018).
- de Boer, M. T., Boonstra, E. A., Lisman, T., Porte, R. J. Role of fibrin sealants in liver surgery. Dig Surg. 29 (1), 54-61 (2012).
- Fuller, C. Reduction of intraoperative air leaks with Progel in pulmonary resection: a comprehensive review. J Cardiothorac Surg. 8, 90(2013).
- Ratnalingam, V., Eu, A. L., Ng, G. L., Taharin, R., John, E. Fibrin adhesive is better than sutures in pterygium surgery. Cornea. 29 (5), 485-489 (2010).
- Sierra, D. H. Fibrin sealant adhesive systems: a review of their chemistry, material properties and clinical applications. J Biomater Appl. 7 (4), 309-352 (1993).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
