Artículo de método

Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

DOI:

10.3791/65865

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15 de septiembre de 2023

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

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Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La falta de modelos de cáncer validados que recapitulen el microambiente tumoral de los cánceres sólidos in vitro sigue siendo un obstáculo importante para la investigación preclínica del cáncer y el desarrollo terapéutico. Para superar este problema, hemos desarrollado el microtumor vascularizado (VMT), o chip tumoral, un sistema microfisiológico que modela de forma realista el complejo microambiente tumoral humano. El VMT se forma de novo dentro de una plataforma microfluídica mediante el cocultivo de múltiples tipos de células humanas en condiciones dinámicas de flujo fisiológico. Esta construcción microtumoral de ingeniería tisular incorpora una red vascular perfundida viva que soporta la creciente masa tumoral al igual que lo hacen los vasos recién formados in vivo. Es importante destacar que los fármacos y las células inmunitarias deben atravesar la capa endotelial para llegar al tumor, modelando in vivo las barreras fisiológicas para la administración y eficacia terapéuticas. Dado que la plataforma VMT es ópticamente transparente, se pueden lograr imágenes de alta resolución de procesos dinámicos como la extravasación de células inmunitarias y la metástasis con la visualización directa de células marcadas con fluorescencia dentro del tejido. Además, el VMT conserva la heterogeneidad tumoral in vivo , las firmas de expresión génica y las respuestas a fármacos. Prácticamente cualquier tipo de tumor se puede adaptar a la plataforma, y las células primarias de los tejidos quirúrgicos frescos crecen y responden al tratamiento farmacológico en el VMT, allanando el camino hacia una medicina verdaderamente personalizada. Aquí, se describen los métodos para establecer el VMT y utilizarlo para la investigación oncológica. Este enfoque innovador abre nuevas posibilidades para el estudio de los tumores y las respuestas a los fármacos, proporcionando a los investigadores una poderosa herramienta para avanzar en la investigación del cáncer.

Introducción

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El cáncer sigue siendo un importante problema de salud en todo el mundo y es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Solo para el año 2023, el Centro Nacional de Estadísticas de Salud anticipa más de 1.9 millones de nuevos casos de cáncer y más de 600,000 muertes por cáncer en los EE. UU.1, lo que destaca la necesidad urgente de enfoques de tratamiento efectivos. Sin embargo, en la actualidad, solo el 5,1% de las terapias contra el cáncer que entran en ensayos clínicos finalmente obtienen la aprobación de la FDA. El fracaso de los candidatos prometedores para progresar con éxito a través de los ensayos clínicos puede atribuirse parcialmente al uso de sistemas modelo no fisiológicos, como cultivos 2D y esferoides, durante el desarrollo preclínico de fármacos2. Estos modelos clásicos de cáncer carecen de componentes esenciales del microambiente tumoral, como un nicho estromal, células inmunitarias asociadas y vasculatura perfundida, que son determinantes clave de la resistencia terapéutica y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es necesario un nuevo sistema modelo que imite mejor el microambiente tumoral humano in vivo para mejorar la traslación clínica de los hallazgos preclínicos.

El campo de la ingeniería de tejidos está avanzando rápidamente, proporcionando métodos mejorados para estudiar enfermedades humanas en entornos de laboratorio. Un desarrollo significativo es la aparición de los sistemas microfisiológicos (MPS), también conocidos como chips de órganos o chips de tejido, que son órganos humanos funcionales y miniaturizados capaces de replicar condiciones sanas o enfermas 3,4,5. En este contexto, se han desarrollado chips tumorales, que son modelos tumorales humanos in vitro tridimensionales basados en microfluídica, para la investigación oncológica 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estos modelos avanzados incorporan señales bioquímicas y biofísicas dentro de un microambiente tumoral dinámico, lo que permite a los investigadores estudiar el comportamiento tumoral y las respuestas a los tratamientos en un contexto fisiológicamente más relevante. Sin embargo, a pesar de estos avances, pocos grupos han incorporado con éxito una vasculatura viva y funcional, particularmente una que se automodela en respuesta al flujo fisiológico 3,4,5,6. La inclusión de una red vascular funcional es crucial, ya que permite modelar las barreras físicas que afectan a la administración de fármacos o células, la localización celular en distintos microambientes y la migración transendotelial de células tumorales, estromales e inmunitarias. Al incluir esta característica, el chip tumoral puede representar mejor las complejidades observadas en el microambiente tumoral in vivo.

Para hacer frente a esta necesidad insatisfecha, hemos desarrollado una novedosa plataforma de cribado de fármacos que permite la formación de redes de microvasos dentro de un dispositivo microfluídico 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Esta plataforma de chip de órgano base, denominada microórgano vascularizado (VMO), se puede adaptar a prácticamente cualquier sistema de órganos para replicar la fisiología del tejido original para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las aplicaciones de medicina personalizada. Las VMO se establecen mediante el cocultivo de células derivadas de células formadoras de colonias endoteliales (ECFC-EC), HUVEC o iPSC-EC (en adelante, EC) y múltiples células estromales en la cámara, incluidos los fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF), que remodelan la matriz, y los pericitos que envuelven y estabilizan los vasos. El VMO también se puede establecer como un sistema modelo de cáncer mediante el cocultivo de células tumorales con el estroma asociado para crear un modelo de microtumor vascularizado (VMT)8,9,10,11,12,13 o chip tumoral. A través del cocultivo de múltiples tipos celulares en un ambiente de flujo dinámico, las redes microvasculares perfundidas se forman de novo en las cámaras tisulares del dispositivo, donde la vasculogénesis está estrechamente regulada por las tasas de flujo intersticial14,15. El medio es conducido a través de los canales microfluídicos del dispositivo por un cabezal de presión hidrostática que suministra nutrientes a las células circundantes de la cámara tisular exclusivamente a través de los microvasos, con un coeficiente de permeabilidad de 1,2 x 10-7 cm/s, similar al observado para los capilares in vivo8.

La incorporación de microvasos autoorganizados en el modelo VMT representa un avance significativo porque: 1) imita la estructura y función de las masas tumorales vascularizadas in vivo; 2) puede modelar los pasos clave de la metástasis, incluidas las interacciones tumoral-endotelial y de células estromales; 3) establece barreras fisiológicamente selectivas para la administración de nutrientes y fármacos, mejorando el cribado farmacéutico; y 4) permite la evaluación directa de fármacos con capacidades antiangiogénicas y antimetastásicas. Al replicar la administración in vivo de nutrientes, fármacos y células inmunitarias en un complejo microentorno 3D, la plataforma VMO/VMT es un modelo fisiológicamente relevante que puede utilizarse para realizar el cribado de fármacos y estudiar la biología del cáncer, vascular o específica de órganos. Es importante destacar que el VMT apoya el crecimiento de varios tipos de tumores, incluidos el cáncer de colon, el melanoma, el cáncer de mama, el glioblastoma, el cáncer de pulmón, la carcinomatosis peritoneal, el cáncer de ovario y el cáncer de páncreas 8,9,10,11,12,13. Además de ser de bajo costo, fácil de establecer y estar preparada para experimentos de alto rendimiento, la plataforma microfluídica es totalmente compatible ópticamente para el análisis de imágenes en tiempo real de las interacciones tumor-estroma y la respuesta a estímulos o terapias. Cada tipo de célula en el sistema está marcada con un marcador fluorescente diferente para permitir la visualización directa y el seguimiento del comportamiento celular a lo largo de todo el experimento, creando una ventana al microambiente tumoral dinámico. Hemos demostrado previamente que el VMT modela más fielmente el crecimiento tumoral in vivo, la arquitectura, la heterogeneidad, las firmas de expresión génica y las respuestas a los fármacos que las modalidades de cultivo estándar10. Es importante destacar que el VMT apoya el crecimiento y el estudio de las células derivadas de los pacientes, incluidas las células cancerosas, lo que modela mejor la patología de los tumores progenitores que los cultivos esferoides estándar y avanza aún más en los esfuerzos de la medicina personalizada11. Este manuscrito describe los métodos para establecer el VMT, mostrando su utilidad para el estudio de los cánceres humanos.

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Protocolo

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1. Diseño y fabricación

  1. Diseño del dispositivo
    1. Para la fabricación de dispositivos microfluídicos, cree un molde SU-8 utilizando una capa de 200 μm de SU-8 recubierta por centrifugación sobre una oblea de Si (RCA-1 limpia y tratada con fluoruro de hidrógeno (HF) al 2%), seguido de un paso de fotolitografía de máscara única como se describió anteriormente 8,9.
    2. Funda una réplica de polidimetilsiloxano (PDMS) de 4 mm de espesor a partir del molde SU-8 para generar un molde de poliuretano duradero para los pasos de fabricación posteriores. Se pueden utilizar varias iteraciones de diseño 8,9,10,11,12,13,14,15.
    3. En la iteración actual, diseñe el dispositivo microfluídico para que se ajuste a medida en un formato de placa estándar de 96 pocillos y que consista en una capa de características de PDMS de 2 mm de espesor con 12 unidades de dispositivos microfluídicos encerradas por una capa delgada (1/16 de pulgada) de membrana de polímero transparente en la parte inferior (Figura 1A).
    4. Asegúrese de que las unidades de tejido individuales consten de una cámara de tejido flanqueada por una entrada de carga de gel (L1) y una salida (L2), un regulador de presión (PR)16 y canales microfluídicos desacoplados conectados a 2 entradas y salidas de medios a cada lado (M1-M2, M3-M4; Figura 1B).
    5. Coloque cada entrada y salida dentro de un solo pozo que sirva como depósito medio para establecer la presión hidrostática (10 mm H2O) a través del canal microfluídico. Para permitir la anastomosis de la red vascular con los canales externos, conecte los canales microfluídicos a la cámara tisular a través de poros de comunicación de 50 μm de ancho (6 en la parte superior, 6 en la parte inferior).
      NOTA: Las resistencias microfluídicas crean un gradiente de presión intersticial de 5 mm H2O a través de la cámara tisular que se vuelve intraluminal una vez que la red vascular está completamente formada 8,10. Los procedimientos posteriores comienzan con una placa de alto rendimiento completamente ensamblada.

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Figura 1. Diseño de plataforma microfluídica. (A) El esquema del conjunto de la plataforma muestra la capa de características del PDMS con 12 unidades de dispositivo unidas a una placa sin fondo de 96 pocillos y sellada con una delgada membrana de polímero transparente. Cada unidad de dispositivo ocupa una columna de pocillos en la placa. La unidad de dispositivo único delineada en rojo se muestra con los detalles en (B). (B) El esquema de una unidad de dispositivo muestra una sola cámara de tejido colocada dentro de un pocillo de la placa de 96 pocillos y dos puertos de carga con orificio de entrada y salida (L1-L2) perforado para permitir que se introduzca la mezcla de matriz celular. Las entradas y salidas medianas (M1-M2, M3-M4) están perforadas y colocadas dentro de pozos que sirven como depósitos de medios. Diferentes volúmenes de medios establecen un gradiente de presión hidrostática a través de la cámara tisular a través de canales microfluídicos desacoplados. La unidad reguladora de presión (PR) sirve como una válvula de rotura de gel para aumentar la facilidad de carga. Tenga en cuenta que el dispositivo tiene una profundidad de 200 μm y la cámara de tejido mide 2 mm x 6 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparativos previos a la carga

  1. Cultivo celular
    1. Mantenga las células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 .
    2. Matraces de placa T75 de células transducidas de EC, NHLF u otro fibroblasto/célula estromal y células cancerosas deseadas 3-4 días antes de la carga a una densidad informada por el fabricante y los protocolos del usuario. Para este protocolo, coloque 1 x 106 celdas por matraz para cada tipo de célula. Cultivo de EC en medios de crecimiento endotelial 2 (EGM2) completos, NHLF en medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con 10% de FBS y células cancerosas en medios apropiados según el tipo de célula.
    3. Mantenga las células alimentándolas con los medios respectivos cada 2-3 días y reconfirme la eficiencia de transducción o marcaje visualizando las células bajo un microscopio fluorescente. El día de la carga, asegúrese de que la EC tenga una confluente del 80 % al 100 %, mientras que la NHLF es subconfluente del 70 % al 80 %.
  2. Preparación de fibrinógeno
    1. Prepare la solución de fibrinógeno a la concentración deseada (por lo general, 5-8 mg/ml favorece la formación de una red vascular robusta), teniendo en cuenta el porcentaje de coagulación del fibrinógeno. Calcula la cantidad de fibrinógeno necesaria con la siguiente ecuación:
      Fibrinógeno (mg) = (volumen (mL)) x (concentración (mg/mL))/ (% de coagulación)
    2. Disolver el fibrinógeno en un volumen adecuado de medio basal endotelial 2 (EBM2), calentado a 37 °C, agitando suavemente el tubo (no hacer vórtice). Incubar el fibrinógeno en un baño de agua a 37 °C para permitir que se disuelva completamente. Es importante destacar que no utilice un medio completo.
    3. Solución de fibrinógeno de filtro estéril con filtro de 0,22 μm y alícuota al volumen deseado, normalmente 400 μL por tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Otras proteínas de la matriz (p. ej., colágenos, fibronectina o laminina) se pueden agregar a la mezcla de fibrinógeno.

3. Carga de muestras

NOTA: La carga es sensible al tiempo y debe completarse desde el inicio (elevación de la célula) hasta el final (adición de medios a los dispositivos) dentro de aproximadamente 1,5-1,75 h para garantizar resultados óptimos. Cada paso se anota con un temporizador sugerido para ayudar al usuario a mantenerse en el camino.

  1. Preparación de materiales (Día de carga)
    1. Coloque lo siguiente en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 min: solución salina equilibrada de Hank (HBSS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar celdas, reactivo de disociación celular, medios (p. ej., EGM2, DMEM)
    2. Conserve los siguientes reactivos en una nevera a 4 °C hasta que estén listos para su uso: trombina, laminina (descongelada durante la noche a 4 °C).
    3. Descongele la alícuota de fibrinógeno a temperatura ambiente. Prepare 1,5 μL de alícuotas de trombina en tubos de microcentrífuga de 500 μL, con un tubo por unidad de dispositivo. Asegúrese de que la alícuota de trombina esté en la parte inferior de cada tubo para facilitar la carga.
    4. Coloque las placas de alto rendimiento esterilizadas con UV en un desecador durante al menos 30 minutos antes de cargarlas para eliminar el aire atrapado en la microfluídica.
  2. Preparación de la célula (inicio del temporizador = inicio a los 0 minutos)
    1. Compruebe las células bajo el microscopio con un aumento de 4x para confirmar la confluencia y la eficiencia de la transducción.
    2. Lave cada matraz T75 de células 2 veces con 5 ml de HBSS y aspire completamente. Añadir 1 ml de reactivo de disociación a cada matraz e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 1-2 min.
    3. Golpee suavemente la placa con la palma de la mano y compruebe que se han levantado todas las células.
    4. Lave las células del matraz con 9 ml de medios apropiados y recójalas en un recipiente cónico de 15 ml. Retire inmediatamente una pequeña alícuota para el recuento de células.
    5. Centrifugar las células a 300 x g durante 3-5 min a 4 °C. Mientras centrifuga las células, cuente las células. Un matraz T75 confluente de EC o NHLF debe producir al menos 2 x 106 células.
    6. Después de la centrifugación, aspire el medio y vuelva a suspender el gránulo en el medio apropiado a una concentración de 1 x 106 células/ml. Mantenga las células en hielo.
  3. Preparación de la mezcla de células y fibrinógeno (Temporizador = comienza a los 20 min)
    1. Determine cuántos dispositivos se cargarán, sumando 1-2 para tener en cuenta la pérdida de pipeteo, y multiplíquelo por el volumen de mezcla de célula y fibrinógeno necesario por dispositivo. Esto dependerá de la configuración del dispositivo, pero para el diseño del dispositivo presentado en este artículo, se requieren 6 μL por dispositivo.
    2. La concentración de cada tipo de célula debe determinarse experimentalmente. Como punto de partida, cargue la CE a una concentración de aproximadamente 7 x 106 células/ml y el NHLF a una concentración de 3,5 x 106 células/ml. La concentración de células cancerosas puede variar considerablemente en función de su tasa de crecimiento, pero normalmente se encuentra dentro del rango de 0,5-2 x 106 células/ml. Utilice esta ecuación para calcular el número de celdas necesarias:
      Número de células necesarias = (volumen de fibrina (μL))/1000 μL x (concentración de células)
    3. Vuelva a suspender las células a una concentración de 1 x 106 células/ml y utilice la siguiente ecuación para determinar el volumen de células necesario:
      Volumen de células necesarias (μL) = (número de células necesarias)/1000
    4. Mezclar los volúmenes respectivos de EC, NHLF y células cancerosas (solo para VMT) en un tubo cónico y centrifugar a 300 x g durante 3-5 min a 4 °C.
    5. Después de centrifugar, aspire con cuidado el medio y pipetee cualquier medio residual cerca del gránulo. Vuelva a suspender el gránulo de forma suave pero completa en el volumen calculado de fibrinógeno, teniendo especial cuidado de no introducir burbujas de aire. Mantener en hielo.
    6. Coloque las placas esterilizadas y las alícuotas de trombina en la campana de cultivo de tejidos.
  4. Carga de dispositivos (Temporizador = comienza a los 30-35 minutos)
    1. Con una pipeta P20, pipetee 6 μL de volumen de la mezcla de célula y fibrina. Asegúrese de pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces para garantizar una suspensión celular uniforme. Mantenga la mezcla en hielo para que se coagule lentamente.
    2. Mezcle suavemente la célula/fibrina en un tubo de trombina colocando la punta de la pipeta directamente en la alícuota de trombina en la parte inferior del tubo. Pipetear inmediatamente hacia arriba y hacia abajo al menos 2 veces, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. La fibrina comenzará a coagularse una vez mezclada con la trombina, por lo que completa rápida pero deliberadamente los pasos 3.4.3. y 3.4.4. antes de que la fibrina se gelifique en la punta de la pipeta (~3 s).
    3. Levante la placa de alto rendimiento en ángulo e inserte rápidamente la punta de la pipeta en uno de los puertos de carga del dispositivo (L1 o L2). Consulte la Figura 2A para ver el esquema.
    4. Empuje el émbolo de la pipeta hasta el primer tope con un movimiento suave y fluido para inyectar la mezcla de célula y fibrina en la cámara de tejido. Esté atento a que el gel atraviese completamente la cámara.
      NOTA: Aplicar demasiada presión durante este paso puede provocar el estallido del gel en los canales microfluídicos en la parte superior y/o inferior de las cámaras tisulares.
    5. Vuelva a colocar suavemente la placa en posición horizontal en la cubierta de cultivo de tejidos sin quitar la punta de la pipeta, soltar el émbolo de la pipeta ni alterar la pipeta. Utilice la mano para girar y retirar la punta de la pipeta del P20 y déjela en el orificio del puerto de carga. No utilice el botón eyector para quitar la punta, ya que esto causará demasiada presión.
    6. Continúe con los pasos 3.4.1-3.4.5 para los dispositivos restantes.
    7. Cuando se complete la carga, deje reposar la placa durante 2 minutos sin tocarla en la campana de cultivo de tejidos.
    8. Retire las puntas de las pipetas girándolas suavemente y tirando de ellas desde los puertos de carga. Vuelva a colocar la tapa en el plato.
    9. Incubar toda la placa durante 15-20 minutos en una incubadora a 37 °C para permitir que el gel polimerice completamente.
    10. Después de la incubación, revise cada unidad del dispositivo bajo el microscopio. Verifique que las células estén distribuidas uniformemente por toda la cámara sin burbujas de aire y que haya una interfaz de gel claramente visible entre la cámara de tejido y los canales microfluídicos, como se muestra en la Figura 2B-C.
  5. Recubrimiento de canales con laminina (Temporizador = comienza a los 45-50 min)
    1. Una vez que los geles estén completamente sólidos, introduzca laminina en los canales microfluídicos para promover la anastomosis vascular.
    2. Con un P20, introduzca 4 μL de laminina en cada canal microfluídico (superior e inferior) del dispositivo. Inserte la punta de la pipeta en M1 o M3 y expulse la laminina lentamente, vigilando que la laminina cubra todo el canal superior, y luego repita para M2 o M4 para cubrir todo el canal inferior.
    3. Determine la orientación pipeteando la laminina desde el lado opuesto al regulador de presión para permitir que haya suficiente presión para empujarla. Sin embargo, si la laminina no se desplaza fácilmente desde un lado, retire la punta de un lado y empuje la laminina desde el otro lado. Es posible que sea necesario ir a la segunda parada de la pipeta (es decir, empujar el émbolo hasta el fondo) para generar suficiente presión para empujar la laminina a través de todo el canal.
    4. Retire la punta suavemente de la entrada/salida del material. No utilice el botón eyector del P20.
    5. Repita los pasos 3.5.1-3.5.4 para cada dispositivo e incube la placa a 37 °C, 5% de CO2 durante 10 min.
  6. Adición de medios (temporizador = comienza aproximadamente a 1 h 10 min)
    1. Agregue 275 μL de medio completo EGM2 en los depósitos de medios desacoplados de los pocillos en las filas A y B o G y H. Este será el lado alto, y la orientación debe determinarse haciendo que los pozos en el lado opuesto al regulador de presión tengan un volumen alto para comenzar. Los medios serán empujados desde el lado alto por la gravedad.
    2. Con una pipeta P200, introducir 75 μL de medio en las entradas/salidas del medio de los pocillos que contienen los 275 μL de EGM2. Inserte la punta en el orificio de entrada del medio y expulse lentamente el medio, observando que el medio viaja a través del canal y burbujea hacia arriba en el otro lado.
    3. Retire la punta de la pipeta y empuje el medio restante de la punta hacia el depósito del medio de modo que el volumen total en el lado superior sea de 350 μL.
    4. Repita los pasos 3.6.1 a 3.6.3 para cada unidad de dispositivo, canales superior e inferior.
    5. Agregue 50 μL de medio para cubrir completamente el lado bajo, los pocillos en las filas A y B o G y H, según la orientación descrita anteriormente. Asegúrese de que haya una capa uniforme de medios que cubra el fondo del pozo. Consulte la Figura 2D para ver un esquema que muestra los volúmenes de medios en los depósitos.
  7. Eliminación de burbujas de aire (post-carga)
    NOTA: Eliminar las burbujas es un paso fundamental para garantizar un flujo adecuado en cada dispositivo. Para el día 2, las células endoteliales y los fibroblastos comenzarán a estirarse en respuesta al flujo (Figura 2E).
    1. Una vez añadidos todos los medios, incubar las placas durante 1-2 h en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 antes de comprobar si hay burbujas de aire en los canales o en las entradas/salidas del medio.
    2. Visualice las burbujas en los canales de medios en el microscopio y expulse reintroduciendo 75 μL de medios en los canales para expulsar las burbujas.
    3. Visualice las burbujas en las entradas/salidas del medio a simple vista. Utilice una pipeta P200 para eliminar las burbujas de aire atrapadas en las entradas y salidas del medio empujando el émbolo hacia abajo, introduciendo la punta en el orificio y sacando la burbuja levantando el émbolo para aplicar presión negativa y succionar la burbuja.

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Figura 2. Esquema de carga del dispositivo. (A) Utilizando una pipeta P20, la mezcla de célula y fibrina se introduce en la cámara de tejido de cada unidad del dispositivo a través de uno de los puertos de carga. (B) La micrografía de campo claro muestra un dispositivo microfluídico cargado de EC, fibroblastos y células cancerosas para formar un VMT. Barra de escala = 500 μm. (C) Micrografía de fluorescencia del dispositivo en B que muestra CE en rojo, tumor en cian y fibroblastos en azul. (D) El esquema muestra la adición de medio en los depósitos, con 350 μL en el lado alto y 50 μL en el lado bajo para generar la carga de presión hidrostática. (E) El día 2 del cultivo de VMT muestra que los fibroblastos y la CE comienzan a estirarse para formar la red vascular. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Mantenimiento de dispositivos y aplicaciones experimentales

  1. Mantenimiento y tratamiento farmacológico
    NOTA: Para mantener el flujo en el sistema, la presión hidrostática debe restablecerse diariamente pipeteando el volumen de medios desde el lado bajo hacia el lado alto o viceversa, asegurando que el volumen total en el lado alto permanezca en 350 μL. La dirección del flujo se cambia todos los días después del día 2 del establecimiento de VMO o VMT. A continuación se proporcionan detalles adicionales de mantenimiento y tratamiento.
    1. Cambie el medio cada dos días con EGM2 completo hasta que la vasculatura esté completamente establecida (día 5-6). Aspire completamente los medios viejos y reemplace los pocillos de alta presión (350 μL) y los pocillos de baja presión (50 μL).
      NOTA: La determinación experimental de formulaciones de medios optimizadas se puede llevar a cabo para otros tipos de células, a menudo involucrando una mezcla 50:50 o la adición de componentes específicos en EGM2.
    2. Una vez formada la red vascular y completamente desarrollado el tejido (día 4-7), realizar una prueba de perfusión de dextrano antes de utilizar los dispositivos para experimentos (paso 4.2.1.). Utilice únicamente dispositivos que tengan suficiente perfusión en la cámara de tejidos.
    3. En el caso de los experimentos con terapia, el día en que comience el tratamiento, tome imágenes en todos los canales fluorescentes de cada dispositivo. Esto servirá como línea de base.
    4. Trate los dispositivos con la terapéutica deseada reemplazando el medio con medio fresco que contenga el fármaco diluido a la concentración deseada. Asegúrese de que los medicamentos se diluyan en los vehículos apropiados según la recomendación del fabricante, pero no exceda el 0.01% de DMSO en los medios.
    5. Exponga los dispositivos al fármaco durante el tiempo deseado (normalmente 48 horas, pero puede ser informado por la farmacocinética).
    6. Tome imágenes de cada canal de cada dispositivo en el intervalo de tiempo deseado para monitorear la respuesta al tratamiento. Mantenga las placas como se indica en el paso 4.1.1 durante todo el experimento.
    7. Al finalizar el experimento, lejía en placas y colóquelas en un recipiente de riesgo biológico, fíjelas con PFA al 4% para tinción inmunofluorescente (paso 4.3.) o recoja para aislamiento de células vivas o ARN (paso 4.4.).
  2. Ensayos de perfusión
    1. Perfusión de dextrano
      NOTA: La permeabilidad/permeabilidad vascular se puede determinar mediante la perfusión de la red vascular con dextrano marcado con fluorescencia de diferentes pesos moleculares (40 kD, 70 kD o 150 kD). Se puede utilizar FITC- o rodamina-dextrano dependiendo de la etiqueta fluorescente de la CE.
      1. Antes de la perfusión, determine la exposición adecuada del FITC o del canal de rodamina añadiendo unos pocos μL de dextrano dentro del canal fluídico o de la cámara de un dispositivo vacío. Establezca el tiempo de exposición justo por debajo del nivel de saturación mediante el uso de un software de microscopio para mostrar un histograma de intensidades de píxeles, lo que garantiza un rango dinámico caracterizado por píxeles distribuidos uniformemente sin ninguna concentración notable de valores de alta intensidad.
      2. Tome micrografías de todos los dispositivos en los canales de interés, incluida una imagen de fondo de todos los dispositivos en el canal de dextrano fluorescente, para calibrarlas con el fondo. Utilice la misma exposición que la determinada anteriormente y alinee la cámara de tejido en el centro del marco de la imagen para garantizar imágenes consistentes para la cuantificación.
      3. Preparar una reserva principal de FITC-dextrano o rodamina-dextrano a una concentración de 5 mg/ml en 1x DPBS. Este stock se puede mantener a 4 °C.
      4. Para preparar un material de trabajo, diluir 5 mg/ml de material hasta una concentración final de 50 μg/ml en EGM2.
      5. Reemplace el medio en los depósitos con la solución de dextrano diluida como la mitad del volumen máximo (175 μL en un pocillo y el lado alto en el canal superior o inferior de la cámara de tejido). Reemplace los medios en los otros pocillos de modo que el lado superior desacoplado obtenga 175 μL de EGM2 fresco sin dextrano, y los pocillos en el lado bajo solo tengan 50 μL en cada uno.
        NOTA: El dextrano solo debe agregarse a un lado de los canales microfluídicos (superior o inferior) para permitir la visualización del colorante que viaja a través del lado de alta presión, hacia el lecho vascular y hacia afuera por el lado de baja presión.
      6. Bajo el microscopio, observe si el dextrano fluorescente fluye a través de la red vascular. Por lo general, esto ocurrirá aproximadamente 2 minutos después de agregar el tinte al depósito de medios.
      7. Comience a obtener imágenes del canal fluorescente de dextrano (y otros canales, si lo desea). Esto es T = 0 punto de tiempo. Tome imágenes adicionales en varios puntos de tiempo (normalmente cada 10 minutos) o en una sola imagen de punto final.
    2. Perfusión de células
      NOTA: Se pueden perfundir varios tipos de células a través de la vasculatura según el diseño del estudio, incluidos los linfocitos o macrófagos para los estudios de inmunología del cáncer, así como las células cancerosas para los estudios de metástasis. Las células deben marcarse con fluorescencia para facilitar el seguimiento a lo largo del tiempo.
      1. Al menos 2 h antes de la perfusión de células, realice la perfusión de dextrano en todos los dispositivos como se ha descrito anteriormente. Este paso es importante para determinar la permeabilidad vascular antes de agregar células.
      2. Determine la exposición adecuada de la cámara para las células que se van a perfundir. Tome una pequeña muestra de células para verla bajo el microscopio y establezca el tiempo de exposición para ese marcador fluorescente. Ajuste el tiempo de exposición justo por debajo del nivel de saturación.
      3. Tome micrografías de todos los dispositivos en los canales de interés, incluida una imagen de fondo de todos los dispositivos en el canal de dextrano fluorescente, para calibrarlas con el fondo. Utilice la misma exposición que se determina en el paso 4.2.2.1.
      4. Confirme que el dextrano se ha difundido completamente fuera de las cámaras tisulares antes de recolectar las células para su perfusión. Cosecha y cuenta las celdas de interés.
      5. Vuelva a suspender las células a la densidad adecuada en EGM2. Por ejemplo, las células T generalmente se agregan aproximadamente a 1 x 106 células/ml para imitar la concentración en la sangre.
        NOTA: Los EC son sensibles a la composición de los medios, pero pueden tolerar hasta un 50% de mezcla con la mayoría de los demás medios. Pruebe de antemano.
      6. Agregue 175 μL de suspensión celular en un pocillo en el lado alto de cada dispositivo y agregue 175 μL de EGM2 completo al otro pocillo. En el lado bajo, agregue 50 μL de medio completo EGM2 a ambos pocillos.
      7. Bajo el microscopio, observe si las células fluorescentes fluyen a través de la red vascular. Por lo general, esto ocurrirá aproximadamente 2 minutos después de agregar las celdas al depósito de medios.
      8. Una vez que se establece el flujo celular, comience a obtener imágenes del canal celular fluorescente (y otros canales, si lo desea). Esto es T = 0 punto de tiempo. Tome imágenes adicionales en varios puntos de tiempo o en una sola imagen de punto final, según el diseño del estudio. Por ejemplo, la obtención de imágenes cada 10 minutos dará como resultado cursos de tiempo de alta resolución o cada 6-12 h para rastrear los movimientos celulares periódicos.
  3. Tinción inmunofluorescente (IF)
    1. Aspirar medios de los pocillos. Agregue 200 μL de PFA al 4% a ambos pocillos del lado superior de cada unidad de dispositivo y 50 μL al lado bajo. Deje que el PFA fluya a través de las cámaras durante 15 minutos a temperatura ambiente o 30 minutos a 4 °C.
    2. Durante la incubación, prepare una placa de 24 pocillos con 500 μL de 1x PBS por pocillo. Calcule cuántos pocillos se necesitan para teñir cada dispositivo.
    3. Elimine completamente el PFA de los pozos. Dale la vuelta a la placa y retira con cuidado el respaldo de plástico de la membrana.
      NOTA: La tinción IF también se puede realizar in situ sin quitar la membrana y el dispositivo. Para ello, realice los pasos de tinción mediante la perfusión de reactivos a través del VMO/VMT y aumente la duración de cada paso de incubación en aproximadamente 6 veces.
    4. Retire con mucha suavidad y cuidado la capa inferior de la membrana de la capa característica del dispositivo para exponer las cámaras de tejido agarrando ambas esquinas y tirando hacia abajo con un movimiento lento y suave. La mayor parte del tejido debe permanecer en la cámara tisular. Consulte la Figura 3A.
    5. Utilice una cuchilla de afeitar o un bisturí para aplicar la fuerza suficiente para cortar completamente la capa de entidades y corte un pequeño rectángulo alrededor de cada unidad de dispositivo individual, como se muestra en la Figura 3B.
    6. Coloque una espátula entre la capa de características y la placa de pocillos. Aplique una presión suave debajo de la capa de características para eliminar con cuidado toda la capa de entidades que contiene la cámara de tejido de la placa de pocillos.
    7. Coloque cada pieza rectangular de la capa de entidades PDMS que contiene el tejido boca abajo en un solo pocillo que contenga PBS.
    8. Una vez que todas las unidades estén en los pocillos, lávese con PBS colocando la placa en un balancín suave durante 5 minutos, aspirando PBS del pocillo y reemplazándolo con 500 μL de PBS fresco. Repita para un total de 3 lavados.
    9. Aspirar PBS de cada pocillo y permeabilizar los tejidos con 500 μL de Triton-X al 0,5% en PBS, 2 veces durante 10 minutos cada una en un balancín suave. Retire la solución de permeabilización.
    10. Bloquee 500 μL de suero al 10 % en Triton-X al 0,1 % por dispositivo durante 1 h a temperatura ambiente con un balanceo suave.
    11. Diluir los anticuerpos primarios en suero al 3% en Triton-X al 0,1% hasta la concentración y el volumen deseados. Retire la solución de bloqueo y agregue suficiente solución de anticuerpos primarios para cubrir completamente el fondo de cada pocillo y permitir el libre movimiento de los tejidos del dispositivo (~ 200 μL). Cubra el plato con una película transparente.
    12. Incubar la placa meciéndose durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, vuelva a colocar la placa que contiene los pañuelos del dispositivo a temperatura ambiente (~15 min).
    13. Aspire la solución de anticuerpos primarios de cada pocillo y lave las cámaras con 500 μL de PBS, 3 veces durante 5 minutos cada una en un balancín suave.
    14. Añadir 200 μL de anticuerpo secundario en suero al 3% en Triton-X al 0,1% a la concentración deseada. Incubar la placa con un balanceo suave durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    15. Aspire la solución de anticuerpos secundarios y lávese con PBS, 3 veces durante 5 minutos cada una con un balanceo suave. Añade una solución de 1x DAPI en Triton-X al 0,1% durante 10 minutos mientras te meces en la oscuridad.
    16. Retire los recortes rectangulares del dispositivo que contienen pañuelos manchados del plato con unas pinzas y colóquelos con el pañuelo hacia arriba sobre una toalla de papel.
    17. Pipetear unos pocos μL (~10 μL) de solución antidecoloración directamente en cada cámara y cubreobjetos, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Deje que el antidecoloración se cure en las cámaras durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad y luego proceda con la obtención de imágenes.
  4. Aislamiento de tejidos y células para ensayos moleculares
    NOTA: Cada placa de alto rendimiento contendrá aproximadamente 1-2 x 105 celdas, dependiendo del momento de la cosecha. Escale el número de réplicas experimentales para tener en cuenta el total de células, así como la posible pérdida durante la recolección.
    1. Análisis de una sola célula
      1. Aspire los medios de cada pocillo e invierta la placa de alto rendimiento de modo que la capa del dispositivo quede hacia arriba.
      2. Retire el respaldo de plástico de la membrana. Retire con mucha suavidad y cuidado la membrana inferior del PDMS de la capa característica del dispositivo para exponer las cámaras de tejido agarrando ambas esquinas y tirando hacia abajo con un movimiento lento y suave.
      3. La membrana se puede quitar incluso con una unión adecuada. La mayor parte del tejido debe permanecer en la cámara tisular después de retirar la membrana; Sin embargo, si alguna parte está pegada a la membrana, siga los pasos a continuación en la membrana.
      4. Lave cada unidad de dispositivo con 500 μL de HBSS o PBS. A cada unidad del dispositivo, agregue 100 μL de reactivo de disociación y deje que se asiente como una gota en la parte superior del dispositivo. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
      5. Después de la digestión, utilice una pipeta P200 para pipetear hacia arriba y hacia abajo a través de las cámaras de tejido y recoger los tejidos en el reactivo de disociación. Mueva la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás a través de cada dispositivo para garantizar la eliminación completa del tejido y recójalo en un cónico de 15 ml con 500 μl de EGM2 para neutralizar el reactivo de disociación.
      6. Para la eliminación completa de las células restantes de la cámara de tejido, agregue 500 μL de EGM2 a cada unidad del dispositivo y lave con una pipeta P200.
      7. Centrifugar la solución de digestión que contiene los tejidos desprendidos a 300 x g durante 5 min a 4 °C para granular células individuales y tejidos enteros.
      8. Aspire cuidadosamente los medios y agregue 500 μL de 1 mg/ml (200 U/mL) de colagenasa tipo IV, 0,1 mg/ml de hialuronidasa tipo V y 200 U/ml de ADNasa tipo IV en HBSS a los tejidos.
      9. Después de una resuspensión suave, deje reposar la solución durante 2 minutos a temperatura ambiente antes de pipetear suavemente nuevamente para disociar el gel.
      10. Lavar la mezcla de digestión con 10 mL de EGM2 y centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en 1x DPBS con BSA o HSA al 1% y páselas a través de un filtro prehumedecido de 70 μm girando a 200 x g durante 1 min.
      11. Cuente las células y ajuste el volumen para que la concentración final sea de 1000 células por μL. Las suspensiones celulares se pueden someter a FACS, citometría de flujo o secuenciación de ARN de una sola célula.
    2. Aislamiento de ARN de tejidos enteros
      1. Siga los pasos 4.4.1.1 y 4.4.1.2 anteriores.
      2. Agregue aproximadamente 10 μL de tampón de lisis de ARN en cada cámara de tejido expuesta, asegurando que el tampón se acumule directamente sobre los tejidos. No utilice más de 100 μL de tampón de lisis de ARN en total.
      3. Incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente. Utilice el P20 para pipetear hacia arriba y hacia abajo en cada unidad del dispositivo y utilice la punta de la pipeta para raspar cualquier material residual de la cámara de tejido si es necesario.
      4. Transfiera la mayor cantidad posible de tampón de lisis a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita los pasos 4.4.2.2.-4.4.2.3. para el resto de los dispositivos y agrupar las muestras en el tubo de 1,5 ml.
      5. Siga las instrucciones del fabricante para aislar el ARN, según el kit o los reactivos.

figure-protocol-3
Figura 3. Preparación de la plataforma para la inmunotinción. (A) Esquema de la plataforma del dispositivo completamente ensamblada con la capa de membrana en la parte superior. Para quitar la membrana, tire con cuidado de cada esquina de la capa exterior hacia abajo con un movimiento constante y suave. (B) Una vez que la capa de membrana se haya eliminado por completo, use una cuchilla, bisturí o cuchillo para cortar rectángulos alrededor de la cámara de tejido de cada unidad del dispositivo, teniendo cuidado de no cortar el tejido en sí. A continuación, se puede colocar una espátula debajo de cada rectángulo para desalojarlo de la placa y colocar cada unidad en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos con PBS para teñir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siguiendo los protocolos descritos aquí, los VMO y VMT se establecieron utilizando EC, NHLF y, para VMT, la línea celular de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 adquirida comercialmente. Los VMO establecidos también se perfundieron con células cancerosas para imitar la metástasis. En cada modelo, en el día 5 de cocultivo, una red vascular se autoensambla en respuesta al flujo impulsado por la gravedad a través de la cámara de tejido, sirviendo como un conducto para la entrega in vivo de nutrientes, terapia...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Casi todos los tejidos del cuerpo reciben nutrientes y oxígeno a través de la vasculatura, lo que la convierte en un componente crítico para el modelado realista de enfermedades y la detección de fármacos in vitro. Además, varias neoplasias malignas y estados patológicos se definen por la disfunción endotelial vascular y la hiperpermeabilidad3. En particular, en el cáncer, la vasculatura asociada al tumor a menudo está mal perfundida, interrumpida y permeable, lo que actúa como una barrer...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CCWH tiene una participación accionaria en Aracari Biosciences, Inc., que está comercializando una versión de la tecnología descrita en este documento. Los términos de este acuerdo han sido revisados y aprobados por la Universidad de California, Irvine, de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. No hay otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los miembros del laboratorio del Dr. Christopher Hughes por su valiosa contribución a los procedimientos descritos, así como a nuestros colaboradores en el laboratorio del Dr. Abraham Lee por su ayuda con el diseño y la fabricación de la plataforma. Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes subvenciones: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) y TL1 TR001415 y W81XWH2110393 (SJH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fabricación
(3-Mercaptopropyl)trimetoxisilano, 95% Sigma-Aldrich175617-100G
Greiner Bio-One  μ Microplacas de poliestireno de 96 pocillos de fondo transparenteGreiner Bio-One655096
Metanol ≥ 99.8% ACSVWR Chemicals BDHBDH1135-1LP
MILTEX Punzón de biopsia desechable estéril con émbolo, 1 mm de diámetro,MembranaIntegra Miltex33-31AA-P/25
PDMSPAX IndustriesHT-6240
Limpiador de plasma PDC-001Harrick PlasmaN/A
Fundido liso 385Liso N/A
SP Bel-Art Lab Companion Desecador de vacío de policarbonato transparente estilo gabineteBel-ArtF42400-4031
Tapas estándar con anillos de condensación, placa de 96 pocillosVWR82050-827
SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)Dow4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated MicroscopioAgilent 
CELLvo Células progenitoras endoteliales humanasStemBioSysN/A
Enzo Life Sciences
Colagenasa de Clostridium histolyticum (tipo 4)Sigma-AldrichC5138
Corning Hank' s Solución salina equilibrada, 1X sin calcio y magnesioCorning21-021-CV
Corning  DMEM con L-Glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodioCorning10013CV
DAPISigma-AldrichD9542
DPBS, sin calcio, sin magnesioGibco14190144
EGM-2 Medio de crecimiento de células endoteliales-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fibrinógeno de plasma bovinoNeta ScientificSIAL-341573
Fibronectina plasma humanoSigma-AldrichF0895
Isotiocianato de fluoresceína– dextrano (70kDa)Sigma-AldrichFD70S-1G
Gelatina de piel porcinaSigma-AldrichG1890
Hialuronidasa de testículos de oveja (tipo 4)Sigma-AldrichH6254
Laminina Proteína de ratónGibco23017015
Leica TCS SP8LeicaN/A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
NHLF – Fibroblastos de pulmón humano normalLonzaCC-2512
Nikon Eclipse TiNikonN/A
Paraformaldehído 4% en tampón de fosfato 0.1MSolución salina, pH 7.4Ciencias de Microscopía Electrónica 15735-90-1L
PBMCs - Células mononucleares de sangre periféricaLonzaCC-2702
PBS, pH 7.4Gibco10010049
Suero fetal bovino de primera calidad (FBS), inactivado por calorAvantor Seradigm97068-091
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144
Quick-RNA Microprep Kit Zymo InvestigaciónR1051
Trombina de plasma bovinoSigma-AldrichT4648
Triton X-100 (Electroforesis),Fisher BioReagentsBP151-100
Enzima TrypLE Express (1X), rojo fenolGibco12605028
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenolGibco25300062
VasculifeLifeline Cell TecnologíaLL-0003
CYT5MFAW Colágeno I, cola de rata

Referencias

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