Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro después de una hemorragia subaracnoidea

Resumen

La investigación preliminar confirma que la hemorragia subaracnoidea (HSA) causa la muerte de los pericitos cerebrales. La evaluación de la contractilidad de los pericitos después de la HSA requiere la diferenciación entre pericitos cerebrales viables y no viables. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para marcar pericitos cerebrales viables y no viables simultáneamente en secciones cerebrales, lo que facilita la observación utilizando un microscopio confocal de alta resolución.

Resumen

Los pericitos son células murales cruciales situadas dentro de la microcirculación cerebral, fundamentales para modular activamente el flujo sanguíneo cerebral a través de ajustes de contractilidad. Convencionalmente, su contractilidad se mide observando los cambios morfológicos y los cambios de diámetro capilar cercanos en circunstancias específicas. Sin embargo, la fijación posterior al tejido, la evaluación de la vitalidad y la consiguiente contractilidad pericitaria de los pericitos cerebrales de los que se obtienen imágenes se ven comprometidas. Del mismo modo, el etiquetado genético de los pericitos cerebrales se queda corto a la hora de distinguir entre pericitos viables y no viables, especialmente en afecciones neurológicas como la hemorragia subaracnoidea (HSA), donde nuestra investigación preliminar valida la desaparición de los pericitos cerebrales. Se ha diseñado un protocolo fiable para superar estas limitaciones, que permite el marcaje fluorescente simultáneo de pericitos cerebrales funcionales y no funcionales en secciones cerebrales. Este método de etiquetado permite la visualización al microscopio confocal de alta resolución, marcando simultáneamente la microvasculatura del corte de cerebro. Este innovador protocolo ofrece un medio para evaluar la contractilidad del pericito cerebral, su impacto en el diámetro capilar y la estructura del pericito. La investigación de la contractilidad de los pericitos cerebrales en el contexto de la HSA permite comprender mejor sus efectos sobre la microcirculación cerebral.

Introducción

Los pericitos cerebrales, que se distinguen por sus protuberancias delgadas y cuerpos celulares que sobresalen, rodean la microcirculación ^1,2. Mientras que el aumento del flujo sanguíneo cerebral es impulsado predominantemente por la dilatación capilar, las arterias más pequeñas exhiben tasas más lentas^{de dilatación}. La contractilidad pericitaria ejerce influencia sobre el diámetro capilar y la morfología pericitaria, impactando en la dinámica vascular⁴. La contracción de los pericitos cerebrales conduce a la constricción capilar y, en escenarios patológicos, la....

Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética y Uso Animal de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Para el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (SD) de ambos sexos, de 300-350 g.

1. Inducir el modelo SAH

1. Anestesiar a las ratas con isoflurano al 2% y oxígeno al 100%. Mantener la anestesia suministrando anestesia inhalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Asegure la cabeza de la rata con un aparato estereotáxico (consulte la Tabla de materiales).
2. Cree el modelo SAH siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Inserte una aguja de mi....

Resultados

En condiciones fisiológicas normales, los pericitos cerebrales generalmente no sufren muerte celular. La figura 6 ilustra este fenómeno, donde el amarillo indica la presencia de pericitos cerebrales vitales; Los pericitos cerebrales no muestran tinción con PI, lo que indica su viabilidad. Para investigar más a fondo si los pericitos permanecen unidos a la microvasculatura después de la muerte celular, se emplearon métodos en un modelo de rata SAH y se realizaron imágenes posteriores.

Discusión

Se han desarrollado técnicas de imagen confocal de alta resolución para visualizar los pericitos cerebrales vitales, los pericitos cerebrales no vitales y la microvasculatura en cortes cerebrales. En cortes agudos de cerebro de rata, el proceso implica el marcaje inicial de pericitos con TO-PRO-3¹¹, seguido de células endoteliales microvasculares con IB4¹²; posteriormente, se realiza la identificación de los pericitos fallecidos mediante PI. Este protocolo es sencillo, repr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 6 pocillos	ABC bioquímica	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Papel de aluminio	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2· 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Software de imagen confocal	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Microscopio de escaneo láser confocal	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Tanque de gas (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Platos Confocales con Fondo de Vidrio	Beyotime	FCFC020-10 piezas	RT
Glucosa	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Pegamento	EVOBOND	KH-502	RT
Máquina de hielo	XUEKE	IMS-20	RT
Software de análisis de imágenes	Institutos Nacionales de	Salud Image J	RT
Sistema de anestesia inhalatoria	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectina B 4- FITC	SIGMA	L2895– Alícuotas	de la tienda 2MG en – 20 ° C
KCl	Sigma-Aldrich	7447– 40– 7
RT KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647– 14 y ndash; 5	RT
NaH2PO4· H2O	Sigma-Aldrich	10049– 21– 5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pipeta Pasteur	NEST Biotechnology	318314	RT
Bomba peristáltica	Scientific Industries Inc Modelo	203	RT
Propidium (Yoduro)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Almacene alícuotas en – 20 ° C
Aparato estereotáxico	SCIENCE	QA	RT
Bomba de jeringa	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Baño de agua termostático	OLABO	HH-2	RT
Microtomo vibratorio	Leica	VT1200	RT