Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

Resumen

Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.

Resumen

El tracto gastrointestinal (GI) realiza una serie de funciones esenciales para la vida. Los defectos congénitos que afectan a su desarrollo pueden dar lugar a trastornos neuromusculares entéricos, lo que pone de manifiesto la importancia de comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal. En este estudio, presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización para obtener células vivas y viables que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Este protocolo se basa en la disección manual del intestino del pez cebra, seguida de la disociación enzimática con la papaína. Posteriormente, las células se someten a una clasificación celular activada por fluorescencia y las células viables se recolectan para la secuenciación de scRNA. Con este método, pudimos identificar con éxito diferentes tipos de células intestinales, incluidas las células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como las neuronas entéricas y la glía. Por lo tanto, consideramos que es un recurso valioso para estudiar la composición del tracto gastrointestinal en la salud y la enfermedad, utilizando el pez cebra.

Introducción

El tracto gastrointestinal (GI) es un sistema complejo que desempeña un papel vital en la salud y el bienestar general. Es responsable de la digestión y absorción de nutrientes, así como de la eliminación de productos de desecho ^1,2. El tracto gastrointestinal está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas las células epiteliales, las células del músculo liso, las células inmunitarias y el sistema nervioso entérico (SNE), que se comunican estrechamente entre sí para regular y mantener una función intestinal adecuada ^3,4,5

Protocolo

Toda la cría y los experimentos de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la legislación Erasmus MC y de bienestar animal. El uso de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización entra en la categoría de experimentos que no requieren aprobación ética formal, como se describe en las regulaciones holandesas.

1. Obtención de larvas de tipo silvestre y tg (phox2bb:GFP) 5 días después de la fertilización (dpf)

1. Establecer la cría de peces cebra salvajes y recoger 50 huevos en medio E3 tamponado con HEPES (en lo sucesivo, E3) en una placa de Petri de 15 cm. ....

Resultados

Con este protocolo, logramos aislar y disociar con éxito intestinos enteros de larvas de 5 dpf. Utilizando papaína como enzima de disociación, mejoramos significativamente la viabilidad celular, permitiendo la captura de 46.139 eventos que involucraron células individuales viables (6,4% de todas las células) de 244 intestinos aislados (Figura 2A). Se utilizaron larvas enteras de tipo salvaje como control para garantizar que se optimizara el proceso de clasificación, lo que permitió una ident.......

Discusión

Aquí, presentamos un método para el aislamiento y disociación del intestino de larvas de pez cebra de 5 dpf utilizando FACS. Con este método, se recolectaron y analizaron con éxito diferentes tipos de células intestinales mediante scRNA-seq, utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium. Seleccionamos la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), ya que queríamos una indicación de que las células viables del SNE también se aislarían (Figura 2D). Sin embargo, es importante tener en cuenta .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x Tripsina (0,5%)-EDTA (0,2%)	Sigma	59418C
5 mL tubo de fondo redondo con tapón de filtro de celdas	Falcon	352235
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Tubo de fondo redondo 5 mL (tubos FACS) tapón a presión	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Microscopio de disección	Olympus SZX16
FACSAria III máquina clasificadora	BD Biosciences	N/A
HBSS con CaCl2 y MgCl2	Gibco	14025050
alfileres de insectos	Fine Science Tools	26000-25
L-Cisteína	Sigma	C7352
MS-222, Tricaína	Supelco	A5040-250G
Papaína	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et  al. (2019)	N/A
Azul de tripán	Sigma	Gato#T8154