Los bacteriófagos (fagos), virus que infectan a las bacterias, son un componente integral del microbioma intestinal. Aunque estos habitantes simbióticos impulsan la aptitud bacteriana y la dinámica de la población, se sabe poco sobre cómo afectan a la homeostasis intestinal y a la enfermedad. Este protocolo estudia fagos T4 aislados dentro de un modelo de ratón, adaptables a otros pares fago-bacteriano.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa y son las entidades biológicas más abundantes en todos los ecosistemas conocidos. Dentro de las comunidades bacterianas, como las que se encuentran en la microbiota intestinal, los fagos están implicados en la regulación de la dinámica de las poblaciones de microbiota y en el impulso de la evolución bacteriana. En la última década ha habido un renovado interés en la investigación de fagos, en parte debido a las capacidades de eliminación específicas del huésped de los fagos líticos, que ofrecen una herramienta prometedora para contrarrestar la creciente amenaza de las bacterias resistentes a los antimicrobianos. Además, estudios recientes que demuestran que los fagos se adhieren al moco intestinal sugieren que pueden tener un papel protector en la prevención de la invasión bacteriana en el epitelio subyacente. Es importante destacar que, al igual que los microbiomas bacterianos, los fageomas alterados se han asociado con peores resultados en enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. Estudios anteriores han demostrado que los fagos pueden modular el microbioma de animales y humanos a través de trasplantes de filtrado fecal, lo que beneficia la salud del huésped. Con esta reciente ola de investigación surge la necesidad de establecer y estandarizar protocolos para estudiar los fagos en el contexto del microbioma intestinal. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar los fagos T4 aislados y su huésped bacteriano, Escherichia coli, en el contexto del tracto gastrointestinal murino. Los métodos descritos aquí describen cómo partir de un lisado de fagos, administrarlo a ratones y evaluar los efectos sobre el huésped bacteriano y los niveles de fagos. Este protocolo puede modificarse y aplicarse a otros pares fago-bacteria y proporciona un punto de partida para estudiar la dinámica huésped-fago in vivo.
Introducción
Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan y matan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa. Los fagos desempeñan un papel importante dentro de comunidades bacterianas complejas, como la microbiota intestinal, donde se han implicado en la regulación de la dinámica de la población y en la mejora de la aptitud bacteriana2. A lo largo de la última década, ha habido un renovado interés en la investigación de fagos debido al aumento de patógenos resistentes a los antimicrobianos3 y el potencial de la terapia con fagos como estrategia de tratamiento alternativa. En los últimos años,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Cuidado de Animales de la UBC y los protocolos aprobados por el Comité de Bioseguridad (A23-0113, B19-0038). Los ratones se alojaron en la Universidad de Columbia Británica en condiciones libres de patógenos en el Centro de Modelado de Enfermedades. Los ratones C57BL/6 se criaron dentro de la instalación en un aislador de película flexible estéril, provisto de dieta estéril para ratones, agua, ropa de cama y material de anidación. Los ratones se mantuvieron en un ciclo día/noche de 12 h. Los ratones experimentales, tanto machos como hembras, fueron emparejados por edad de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para investigar las interacciones entre el fago T4 y la díada E. coli en el intestino murino, se prepararon, limpiaron y purificaron los lisados del fago T4 y del vehículo (Figura 1A). Los lisados de fagos T4 se titularon mediante ensayo de placa y se diluyeron a 2 x 107 ufp/ml (2 x 106 ufc/ratón) en tampón SM. Los lisados de vehículos también se titularon para confirmar la ausencia de presencia de fagos viables y se diluyeron en el mismo volumen de tampón SM q.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El estudio de los fagos en el microbioma presenta un desafío significativo en comparación con sus contrapartes bacterianas. Específicamente, los fagos no contienen un marcador filogenético conservado común a todos los fagos similar a las subunidades ribosómicas 16S y 18S que permitan la facilidad en la secuenciación e identificación de especies procariotas y eucariotas, respectivamente42. Sin embargo, con los avances en los enfoques de secuenciación de próxima generación, incluido el aumento de la.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen que la tierra en la que realizaron esta investigación es el territorio tradicional, ancestral y no cedido de la Nación xwməθkwəy̓əm (Musqueam). La tierra en la que se encuentra siempre ha sido un lugar de aprendizaje para el pueblo Musqueam, que durante milenios ha transmitido su cultura, historia y tradiciones de una generación a otra en este sitio. Animamos a otros a aprender más sobre las tierras nativas en las que viven y trabajan en https://native-land.ca. Los autores agradecen el apoyo del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) Becas Canadienses de Posgrado - Maestría (N.P.), Premio Michael Smith Health Research BC Tra....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Unidades de filtro de vacío desechables estériles | Millipore Sigma | ||
| Agarosa (grado de biología molecular / multipropósito / bajo) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 dispositivo de filtro centrífugo, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubos, SST | BD Medical | 365967 | |
| Jaulas herméticas de bioexclusión (jaulas ISO) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Termociclador con módulo de reacción rápida de 96 pocillos | BioRad | 1851196 | |
| cloruro de calcio dihidratado (cristales blancos a polvo) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Bloqueos de tapa para tubo de 1,5 ml 100 / paquete | Andwin Scientific | ||
| Cloroformo (Etanol como conservante/ACS certificado) | Fisher | C298-500 | |
| Perlas de acero recubiertas de cobre (4,5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Kit de pañuelos (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Mezcla maestra de PCR verde (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), para biología molecular, 0,5 M en H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Polvo / Copos, Fisher BioReactivos y comercio; | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents&comercio; Medios de microbiología: Caldo LB (polvo) - Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp Escalera de ADN | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Verde FastMix® Mezcla qPCR, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| Filtros HEPA para tapas isocage, FILTROS H14 ESTERILIZABLES EN AUTOCLAVE PARA LÍNEA ISO- IRRADIADO | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Agitador incubado | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Medios de microbiología: Caldo LB (polvo) - Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Tubos de microcentrífuga con tapón a presión de bloqueo, 2 ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Película de sellado Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Existencias de fagos | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Dieta del ratón 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Kit cuantitativo de endotoxinas cromogénicas | Thermo Scientific | ||
| RNasa A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| Conjunto de DNasa libre de RNasa | Qiagen | 79254 | |
| Bicarbonato de sodio (polvo blanco fino) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado) | Sonicador | Fisher Chemical S271 | |
| (modelo de sonda CL-18; modelo de fuente de alimentación FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Aislador de película flexible estéril | Clase Biológicamente Limpio | n/a | |
| SYBR&comercio; Tinción de gel de ADN seguro | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Termociclador | BioRad | 1861096 | |
| cebador de fagos T4, adelante (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| Cebador de fagos T4, adelante (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, solución 1M, pH 8.0, grado de biología molecular, Thermo Scientific ultrapuro | ; | ||
| Agua, (libre de ADNASA, ARNASA) | BioReactivos de Fisher | BP2484100 |
Referencias
- Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
- Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
- Gor....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
