Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Resumen

Los bacteriófagos (fagos), virus que infectan a las bacterias, son un componente integral del microbioma intestinal. Aunque estos habitantes simbióticos impulsan la aptitud bacteriana y la dinámica de la población, se sabe poco sobre cómo afectan a la homeostasis intestinal y a la enfermedad. Este protocolo estudia fagos T4 aislados dentro de un modelo de ratón, adaptables a otros pares fago-bacteriano.

Resumen

Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa y son las entidades biológicas más abundantes en todos los ecosistemas conocidos. Dentro de las comunidades bacterianas, como las que se encuentran en la microbiota intestinal, los fagos están implicados en la regulación de la dinámica de las poblaciones de microbiota y en el impulso de la evolución bacteriana. En la última década ha habido un renovado interés en la investigación de fagos, en parte debido a las capacidades de eliminación específicas del huésped de los fagos líticos, que ofrecen una herramienta prometedora para contrarrestar la creciente amenaza de las bacterias resistentes a los antimicrobianos. Además, estudios recientes que demuestran que los fagos se adhieren al moco intestinal sugieren que pueden tener un papel protector en la prevención de la invasión bacteriana en el epitelio subyacente. Es importante destacar que, al igual que los microbiomas bacterianos, los fageomas alterados se han asociado con peores resultados en enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. Estudios anteriores han demostrado que los fagos pueden modular el microbioma de animales y humanos a través de trasplantes de filtrado fecal, lo que beneficia la salud del huésped. Con esta reciente ola de investigación surge la necesidad de establecer y estandarizar protocolos para estudiar los fagos en el contexto del microbioma intestinal. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar los fagos T4 aislados y su huésped bacteriano, Escherichia coli, en el contexto del tracto gastrointestinal murino. Los métodos descritos aquí describen cómo partir de un lisado de fagos, administrarlo a ratones y evaluar los efectos sobre el huésped bacteriano y los niveles de fagos. Este protocolo puede modificarse y aplicarse a otros pares fago-bacteria y proporciona un punto de partida para estudiar la dinámica huésped-fago in vivo.

Introducción

Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan y matan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa^. Los fagos desempeñan un papel importante dentro de comunidades bacterianas complejas, como la microbiota intestinal, donde se han implicado en la regulación de la dinámica de la población y en la mejora de la aptitud bacteriana². A lo largo de la última década, ha habido un renovado interés en la investigación de fagos debido al aumento de patógenos resistentes a los antimicrobianos³ y el potencial de la terapia con fagos como estrategia de tratamiento alternativa. En los últimos años, los cócteles de fagos líticos se han utilizado por vía intravenosa con cierto éxito en infecciones sépticas bacterianas graves y resistentes a los antibióticos en humanos ^3,4. La terapia oral con fagos también se ha propuesto como una alternativa potencial a los antibióticos para tratar las infecciones intestinales y la inflamación. Además, los fagos han sido implicados en el éxito de los trasplantes de filtrado fecal (FFT), que son preparaciones de microbiota fecal que se han filtrado para eliminar bacterias, en el tratamiento de la infección recurrente por Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, los trastornos inflamatorios intestinales (EII)^7,8 y la enterocolitis necrotizante en cerdos prematuros⁹. Teniendo en cuenta estos resultados, es importante tener en cuenta las interacciones tanto entre los fagos y la microbiota intestinal, como entre los fagos y el huésped mamífero, ya que la adición de nuevos fagos a una comunidad preexistente puede tener efectos indirectos en la comunidad en su conjunto, y no solo en sus bacterias diana ^2,10.

El estudio in vitro de las interacciones de los fagos con sus bacterias diana ha demostrado ser útil para comprender los mecanismos y los impactos de las interacciones de los fagos y las bacterias en el intestino. En este contexto, se ha demostrado que los fagos T4 específicos de Escherichia coli del orden Caudovirales requieren dominios similares a inmunoglobulinas (Ig) ubicados dentro de proteínas de la cápside externa (Hoc) altamente antigénicas en la superficie del virión para adherirse al moco intestinal¹¹. Además, los ensayos de transwell han demostrado que los fagos T4 son capaces de interactuar con cultivos celulares epiteliales y translocarse a través de las capas celulares por macropinocitosis^12,13. Estos resultados apoyan la hipótesis de que los fagos pueden interactuar con su huésped metazoario, a pesar de que son incapaces de infectar las células eucariotas. Estos modelos, si bien son útiles, carecen de la gama completa de interacciones complejas que ocurren en un ecosistema intestinal que se requieren para una exploración exhaustiva de la interacción tripartita entre los fagos, las bacterias y el huésped metazoario.

Los modelos de ratón son una herramienta importante para investigar fagos en entornos complejos. Una aplicación deseable de la administración de fagos es como una estrategia alternativa para tratar infecciones resistentes a los antimicrobianos o patógenos asociados con enfermedades inflamatorias crónicas, incluida la EII. Sin embargo, la literatura emergente sugiere que el comportamiento de los fagos in vitro no representa completamente las funciones in vivo. Buttimer et ^al.14 demostraron que un cóctel de fagos era capaz de agotar las bacterias objetivo en un consorcio simplificado de microbiota humana in vitro, pero no podía replicarse in vivo en ratones gnotobióticos colonizados con el mismo consorcio bacteria-fago. Además, en un microbioma de ratón convencional, el fago T7 condujo a un agotamiento selectivo de sus bacterias intestinales objetivo, aunque se observó una recuperación gradual a lo largo del tiempo, lo que indica una resistencia evolucionada¹⁵. Otros estudios han demostrado la coexistencia de fagos administrados por vía oral y sus cepas bacterianas diana in vivo ^2,16. De hecho, más allá de la coexistencia entre fagos y bacterias, la administración de fagos dio lugar a cambios generalizados en la composición y función general de la comunidad de microbiota ^2,16. Esto es relevante en entornos de enfermedad, ya que varios estudios han encontrado asociaciones entre el aumento de la abundancia relativa de caudovirales y la EII ^7,8,17 que fueron independientes de los cambios en la abundancia bacteriana⁷. Se desconoce si esto es un impulsor o una consecuencia de la patogénesis de la enfermedad.

El enfoque histórico de la investigación de fagos ha girado en torno a la relación entre un fago y su bacteria objetivo. Sin embargo, también es importante tener en cuenta las posibles interacciones entre el fago y la mucosa, el epitelio y el sistema inmunitario del huésped metazoario. Todas estas interacciones juegan un papel importante en la respuesta general a la infección por fagos intestinales. Para demostrarlo, se han estudiado los fagos con ratones libres de gérmenes (GF) para dilucidar su impacto en el sistema inmunitario sin interferencia de la microbiota⁸. En este sistema, los ácidos nucleicos de los fagos fueron detectados por receptores tipo Toll (TLR) ubicados dentro de los endosomas de las células inmunes fagocíticas (macrófagos y células dendríticas). Esto activó la señalización descendente y estimuló la producción dependiente de células T de interferón (IFN)-^{γ 8} o IFN tipo I¹⁸. Además, Fluckiger et ^al.19 implicaron a los linfocitos T CD8⁺ de memoria en el reconocimiento de antígenos codificados por fagos (profagos), lo que dio lugar a una reactividad cruzada de los linfocitos T con los antígenos tumorales, lo que resultó en una reducción de la carga tumoral. Por último, la producción de anticuerpos específicos de fagos se ha documentado en estudios con ratones en los que se administraron fagos a modelos animales de forma continua a través del agua de bebida ^8,20, o mediante sonda nasogástrica oral repetida durante varios meses²⁰, lo que demuestra la capacidad de las proteínas de los fagos para promover respuestas inmunitarias humorales. Aunque estos modos de inoculación de fagos permiten un cebado óptimo y continuo del sistema inmunitario, es posible que no representen las interacciones naturales entre los fagos y el entorno intestinal, ni la cinética de la terapia con fagos aplicada por vía oral. Hasta ahora, un número limitado de estudios han examinado las interacciones de los fagos con una sola especie bacteriana en modelos de ratón monocolonizados²¹. Sin embargo, los ratones monocolonizados demostraron ser fundamentales para descifrar los efectos específicos de los microbios de especies individuales en el tracto gastrointestinal (GI) y el desarrollo inmunológico 22,23,24, y aún pueden resultar útiles para comprender las interacciones tripartitas entre los fagos, sus bacterias objetivo y el huésped metazoario.

Curiosamente, todavía hay mucho que aprender sobre las interacciones entre los fagos intestinales y las bacterias comensales intestinales, así como las interacciones que se producen entre el huésped metazoario y los fagos que residen en él. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar el fago T4 aislado y su contraparte bacteriana, E. coli (K-12, BW25113), utilizando un modelo de ratón gnotobiótico. Estos procedimientos estandarizados también proporcionan una base para optimizar otras díadas de fagos/bacterias mediante la adaptación de los parámetros de crecimiento a los pares de interés. Los métodos descritos aquí describen: (1) Preparación de lisados de fagos y vehículos T4 para la sonda nasogástrica oral de ratones; (2) Administración oral de fagos T4 a ratones gnotobióticos monocolonizados por E. coli ; (3) Monitoreo de los niveles de fagos T4 en heces y tejidos de ratón a lo largo del tiempo.

Para los resultados representativos presentados aquí, los lisados de fagos T4 purificados se propagaron a partir de las existencias de bancos de fagos mantenidos por el Laboratorio Rohwer. Se adaptó el método Phage-on-Tap para propagar el fago T4²⁵, como se menciona en este protocolo. El método produce un alto título y bajas reservas de fagos con endotoxinas en tres días. Utilizando este enfoque, se recolectaron rutinariamente 10 ml de ≥^{10 10} unidades formadoras de placa (ufp)/ml de fago T4 con < 0,5 unidades de endotoxinas (UE)/ml. Los niveles de endotoxinas recomendados para la administración oral o intravenosa en ratones son ≤ 20 UE/ml y ≤ 5 UE/kg/h (o 0,1 UE administrados durante 1 h para un ratón de 20 g), respectivamente, lo que lo convierte en un método adecuado de preparación de fagos para la inoculación in vivo . Todas las cepas de fagos se almacenaron a 4 °C en tampón salino de magnesio y magnesio (SM) para fagos (receta proporcionada en el paso 1.1.5.1). E. coli se cultivó en medios LB. Para varios pares de fagos-bacterias, se pueden adaptar diversos medios de cultivo y condiciones de crecimiento a partir de este protocolo. Los fagos también pueden obtenerse del medio ambiente, como las aguas residuales, el agua marina, el suelo y el contenido intestinal, y pueden aislarse y purificarse según Sambrook y Russell²⁶ antes de la preparación utilizando las condiciones de crecimiento y propagación adecuadas para cada par de interés fago-huésped²⁵. Alternativamente, los fagos pueden obtenerse de fuentes comerciales (véase la Tabla de materiales) o de bancos de fagos.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Cuidado de Animales de la UBC y los protocolos aprobados por el Comité de Bioseguridad (A23-0113, B19-0038). Los ratones se alojaron en la Universidad de Columbia Británica en condiciones libres de patógenos en el Centro de Modelado de Enfermedades. Los ratones C57BL/6 se criaron dentro de la instalación en un aislador de película flexible estéril, provisto de dieta estéril para ratones, agua, ropa de cama y material de anidación. Los ratones se mantuvieron en un ciclo día/noche de 12 h. Los ratones experimentales, tanto machos como hembras, fueron emparejados por edad dentro de cada experimento, con un rango de entre 6 y 12 semanas de edad y un peso de 15 a 30 g para todos los experimentos.

1. Preparación de lisados de fagos y vehículos para la sonda nasogástrica oral en ratones

1. Purificación de fagos y generación de stock
   NOTA: En este estudio, los fagos T4 se cultivan y titulan mediante la siembra en un césped de bacterias utilizando el método de una sola capa de agar, que se describe a continuación. El método de doble capa de agar ha sido descrito anteriormente^25,27y también se puede utilizar con una eficacia similar. Para este protocolo se seleccionó el método de una sola capa de agar, ya que proporciona una mejor visibilidad de la placa²⁸.
   1. Cultive E. coli en 5 ml de medio LB estéril en tubos de cultivo estériles de poliestireno o vidrio (con tapas). Incubar los tubos a 37 °C con agitación a 200 rpm durante la noche, hasta alcanzar la fase estacionaria.
   2. Prepare agar blando en una botella de vidrio tomando LB en autoclave con agar al 0,5% y enfriándolo a 50 °C o menos (sin dejar de ser líquido) antes de la suplementación. Prepare suficiente agar blando para 15 ml por plato.
   3. Suplementar el agar blando con MgSO₄ y CaCl₂ hasta una concentración final de 1 mM para cada uno. Agregue 100 μL de cultivo de E. coli durante la noche por cada 3 mL de agar blando. Revuelva suavemente con una barra de agitación magnética para homogeneizar los suplementos y el cultivo en el agar blando.
      NOTA: La consistencia en el volumen y la densidad de E. coli que se agrega a la preparación de agar blando es crítica (descrita en la sección de resultados representativos).
   4. Añadir 15 mL de agar blando + E. coli por placa de Petri (15 cm de diámetro) utilizando una pipeta serológica. Deje que las placas se asienten a temperatura ambiente para usarlas el mismo día.
      NOTA: Los platos se asentarán en aproximadamente 20 minutos con las tapas abiertas. El agar permanecerá blando pero no se moverá cuando las placas estén invertidas.
   5. Preparar 8-10 diluciones seriadas del fago T4 de origen en factores de 10 diluyendo en tampón SM. Coloque 5 μL de cada dilución en placas. Deje que las manchas se sequen, invierta e incube las placas a 37 °C durante la noche.
      1. Para preparar tampón salino de magnesio (SM) para fagos, en 1 L de_H2Odesionizado, disolver 100 mM de NaCl, 8 mM de MgSO 4,7H2 O y 50 mMde Tris-HCl (pH 7,4). Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
         NOTA: Al día siguiente, E. coli debería haberse convertido en un césped a lo largo del agar LB blando. Las placas, o áreas despejadas de crecimiento visibles en el césped de E. coli , aparecerán donde se produjo la muerte de fagos de huéspedes infectados de E. coli . Cada placa representa una unidad formadora de placa (pfu).
   6. Tome una sola placa de la placa de agar blando empujando una punta de pipeta estéril en el centro de la placa, creando un tapón de agar en el extremo de la punta. Vuelva a suspender el tapón de placa en 1 ml de tampón SM en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Agite el tubo a velocidad máxima durante 1 minuto para mezclar.
   7. Centrifugar el tubo a 4000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier residuo del lisado. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
   8. Para propagar el fago aislado, repita los pasos 1.1.1-1.1.3. Añadir 100 μL del fago aislado a una alícuota de 15 mL de agar blando que contenga E. coli en un tubo cónico. Invierte el tubo tres veces para mezclar y vierte el agar en una placa de Petri.
   9. Deje que las placas se sequen antes de invertir e incubar durante la noche a 37 °C. Prepare una placa de control de césped sin fagos para confirmar la viabilidad de E. coli .
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, la placa de control debe tener un césped de E. coli , mientras que la placa que contiene fagos debe estar completamente lisada.
   10. Para extraer el fago de la placa, agregue 5 ml de tampón SM a la superficie de la placa eliminada del fago y agite a 70 rpm en un balancín durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   11. Recoja el tampón de la placa en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml y centrifugue a 4000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para granular cualquier residuo de la placa de agar.
   12. Recoger el lisado de fagos T4 en un tubo nuevo y almacenar a 4 °C hasta la valoración y propagación.
       NOTA: Los fagos T4 son estables durante más de 10 años²⁵; Sin embargo, la estabilidad dependerá del tipo de fago y de las condiciones de almacenamiento. El título de fagos también variará con el tiempo de almacenamiento. Los fagos son sensibles a la congelación. Por lo tanto, se recomienda la criopreservación en nitrógeno líquido y evitar los ciclos de congelación-descongelación, ya que esto puede dañar los fagos, reduciendo el título de fagos²⁵.
   13. Titule el lisado del fago T4 para determinar la concentración en ufp/mL, como se ha descrito anteriormente 25,29,30. Un stock de fagos T4 de alto título contendrá 10⁸ ufp/ml o más.
2. Preparación de lisados experimentales de fagos
   1. Cultivo de E. coli en 5 mL de medio LB en tubos de cultivo estériles de poliestireno o vidrio (con tapones). Incubar los tubos durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm, hasta alcanzar la fase estacionaria.
   2. Subcultivo: el cultivo nocturno de E. coli 1:50 en medio de 100 mL LB en un matraz cónico de vidrio. Incubar a 37 °C con agitación a 200 rpm hasta que las bacterias hayan alcanzado la fase exponencial temprana o media (aprox. 1,5 h).
      NOTA: Se puede realizar una curva de crecimiento inicial para determinar la densidad óptica en el rango de 600 nm (OD₆₀₀) en el que el cultivo bacteriano se encuentra en fase exponencial. Se sugiere el cultivo en un tubo cónico de vidrio, ya que la evidencia reciente ha encontrado que los fagos pueden adherirse a plásticos como el polipropileno³¹.
   3. Añadir 100 μL de la cepa de fagos T4 de alto título del paso 1.1 en el subcultivo de E. coli e incubar a 37 °C agitando durante 3 h, o hasta que el nuevo lisado ya no esté turbio. Recoja el lisado de fagos T4 en tubos cónicos de 50 ml y proceda directamente a los pasos de limpieza o, si es necesario, guárdelo a 4 °C hasta el día siguiente.
      NOTA: Un tamaño de explosión de fagos mayor (que indica un mayor número promedio de viriones liberados por ciclo de replicación) requiere un período de incubación más largo para el subcultivo bacteriano en el paso 1.2.2. Esto proporciona una mayor densidad de bacterias antes de la adición de fagos.
   4. Centrifugar los lisados a 4000 x g durante 20 min a temperatura ambiente para granular cualquier bacteria restante y restos celulares. Filtrar-esterilizar el sobrenadante resultante utilizando un filtro de nailon de 0,22 μm y transferir el filtrado a nuevos tubos de centrífuga cónicos de 50 mL.
   5. Agregue 0,1 volúmenes de cloroformo a cada volumen de lisado de fagos T4 filtrado para matar cualquier bacteria restante y prevenir el crecimiento bacteriano. Agite brevemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
      NOTA: Los fagos envueltos en lípidos son sensibles al cloroformo, lo que puede reducir el título²⁵ del fago. Omita este paso si es necesario.
      PRECAUCIÓN: El cloroformo es un solvente orgánico tóxico que es peligroso cuando se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel. Use una campana extractora y equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando trabaje con cloroformo. Utilice pipetas serológicas de vidrio en lugar de poliestireno cuando trabaje con cloroformo, ya que no es compatible con la mayoría de los plásticos. El cloroformo se puede colocar en tubos de centrífuga cónicos de polipropileno para los pasos 1.2.5-1.2.6, pero no debe almacenarse a largo plazo en tubos de plástico.
   6. Centrifugar el lisado a 4000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para separar el cloroformo del lisado. Utilice una pipeta serológica para transferir cuidadosamente la capa superior de lisado a un nuevo tubo cónico de 50 ml sin alterar la capa de cloroformo subyacente. Deseche los residuos de cloroformo en el contenedor de residuos líquidos peligrosos adecuado. Almacenar lisados a 4 °C hasta la concentración y el intercambio de tampones al día siguiente.
   7. Concentrar los lisados de fagos en un dispositivo de filtro centrífugo de 100 kDa (ver Tabla de materiales) añadiendo 13 mL de lisado de fagos al depósito superior del dispositivo y centrifugando a 4000 x g durante 5 min, o hasta que la mayor parte del lisado haya pasado a través del filtro hacia el depósito inferior.
      NOTA: Trate de tomar aproximadamente 2 ml de lisado al final del tiempo de centrifugado. A medida que la concentración de fagos aumenta en el filtro con la adición de lisado, es probable que aumenten los tiempos de centrifugado. Los dispositivos de filtro centrífugo tienen un punto muerto físico para evitar que giren en seco³². No deje que la membrana del filtro se seque si se pretende continuar con el uso (es decir, eliminando todo el líquido del depósito superior). Los tiempos de centrifugado pueden variar según el tipo de fago y el título.
   8. Con una pipeta P200 o P1000, pipetee suavemente los ~ 2 ml restantes de lisado hacia arriba y hacia abajo dentro del depósito superior para destapar la membrana del filtro después de cada centrifugado. Deseche el filtrado del depósito inferior en un contenedor de desechos, dejando el fago concentrado en el depósito superior.
   9. Repita los pasos 1.2.7-1.2.8 hasta que todo el volumen de lisado de fagos haya pasado a través del dispositivo de filtro, con ~ 2 ml de fago concentrado retenido en el depósito superior después de cada centrifugado.
   10. Desobstruya la membrana del filtro después del último centrifugado pipeteando el lisado restante (~ 2 ml) en el depósito superior hacia arriba y hacia abajo. Lave el fago (intercambio de tampón) agregando 12 ml de tampón SM al depósito superior y centrifugue a 4000 x g durante 10 min, o hasta que la mayor parte del tampón haya pasado a través del filtro.
   11. Deseche el filtrado y repita el paso de lavado (paso 1.2.10). Vuelva a suspender los 2 ml restantes de lisado en el tampón SM a un volumen final de 10 ml (o menos), para su almacenamiento a largo plazo. Transfiera el lisado a un tubo centrífugo cónico de 50 ml y guárdelo a 4 °C hasta la eliminación de endotoxinas.
       NOTA: Es opcional valorar el fago en esta etapa para asegurarse de que el lisado del fago se ha concentrado (> 10⁸ ufp/mL) y para determinar la pérdida de fagos durante el proceso de eliminación de endotoxinas.
   12. Eliminar las endotoxinas contaminantes del lisado de fagos T4 añadiendo 0,4 volúmenes de 1-octanol (ver Tabla de materiales) al volumen total de lisado.
       NOTA: Las endotoxinas se eliminan porque son altamente inmunoestimulantes y, por lo tanto, su presencia puede conducir a la inducción de una respuesta inmune innata independiente de fagos²⁵.
       PRECAUCIÓN: El 1-octanol es un compuesto aromático, orgánico e inflamable con un olor fuerte y es un irritante para los ojos. Use el EPP adecuado cuando trabaje con 1-octanol. Realice todo el trabajo en una campana extractora para evitar la inhalación de vapor. Utilice una película de sellado para evitar fugas de tubos cuando trabaje fuera de la campana extractora.
   13. Selle la tapa del tubo cónico de la centrífuga con una película de sellado para evitar fugas. Agitar a 120 rpm en una plataforma o agitador oscilante a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de una incubación a 4 °C durante 1,5 h, sin agitar.
   14. Centrifugar a 4000 x g durante 10 min para separar el lisado aclarado de endotoxinas del 1-octanol. La capa de 1-octanol flotará sobre el lisado. Utilice una pipeta P1000 para eliminar con cuidado la mayor cantidad posible de 1-octanol y deséchela en el contenedor de residuos líquidos peligrosos/inflamables adecuado.
   15. Utilice una aguja de 18 G y una jeringa de 10 ml para recoger el lisado de fagos debajo de la capa de 1-octanol restante, teniendo cuidado de no recoger la capa de 1-octanol. Conservar el lisado a 4 °C hasta el vacío rápido.
   16. Transfiera 1 mL de alícuotas de lisado de fagos T4 a tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL. Aspire a toda velocidad con las tapas abiertas a 4000 x g a temperatura ambiente para evaporar el 1-octanol residual del lisado. Acelere el vacío durante 3 h o hasta que el volumen de lisado de fagos se haya reducido en un 30%²⁵. Conservar a 4 °C hasta la valoración.
   17. Titule el lisado de fagos para determinar la concentración en pfu/mL. Diluir el lisado de fagos T4 resultante en tampón SM hasta la concentración deseada y volver a poner el título para confirmar.
   18. Cuantifique las endotoxinas presentes en el lisado de fagos T4 utilizando un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas según las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Compare los niveles de endotoxinas en el lisado final de fagos con una muestra previa a la eliminación de endotoxinas, controles de vehículos, tampón y agua de bebida para ratones.
       NOTA: El kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas es inactivado por 1-octanol²⁵. Realice pasos de vacío rápido para eliminar el 1-octanol (paso 1.2.16) antes de cuantificar las endotoxinas. El contenido de endotoxinas en el agua destilada se estima en 20 UE/ml²⁵; Sin embargo, el contenido de endotoxinas del agua potable para ratones puede variar entre las instalaciones. Si los niveles de endotoxinas en el lisado de fagos exceden la cantidad presente en el agua potable, considere repetir los pasos de eliminación de endotoxinas (1.2.12-1.2.16).
   19. Almacenar lisados de fagos T4 concentrados y eliminados de endotoxinas en tampón SM a 4 °C.
3. Preparación de lisado bacteriano libre de fagos para controles de vehículos
   NOTA: Se puede preparar un lisado bacteriano libre de fagos como vehículo para controlar cualquier efecto debido a contaminantes bacterianos (por ejemplo, endotoxinas) generados en la producción de lisado de fagos en el paso 1.2, que podría afectar los resultados experimentales cuando se inocule en ratones.
   1. A partir de un cultivo nocturno de E. coli, subcultive E . coli 1:50 en 100 mL de medio LB. Sin añadir fagos, continúe cultivando las bacterias agitándolas a 37 °C durante 3 h, o igualando el tiempo de incubación del lisado de fagos producido en el paso 1.2.
   2. Transferir el cultivo de E. coli a tubos cónicos de 50 ml y lisar las células con una sonda sonicadora (véase la tabla de materiales) sobre hielo a 30 kHz durante pulsos de 30 s (3x) para lisar manualmente las células bacterianas.
   3. Siga el resto del protocolo según el paso 1.2, comenzando en el paso 1.2.4, incluidos todos los pasos de limpieza, lavado y eliminación de endotoxinas.
      NOTA: Durante la concentración con el dispositivo de filtro centrífugo, el lisado del vehículo fluirá a través del filtro más rápidamente que el lisado de fagos, debido a la ausencia de fagos. Por lo tanto, acorte los tiempos de centrifugación de 5 minutos a 2-5 minutos para asegurarse de que la membrana del ultrafiltro no se seque durante la centrifugación prolongada.
   4. Titule el lisado del vehículo para confirmar que no contiene fagos.
   5. Utilice un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas según las instrucciones del fabricante para medir los niveles de endotoxinas en el lisado del vehículo. Diluir el lisado del vehículo en tampón SM para que coincida con los niveles de endotoxinas en el lisado de fagos.
4. Controles experimentales alternativos: preparación de lisado de fagos inactivados por calor
   NOTA: Una alternativa al lisado bacteriano libre de fagos es un lisado de fagos inactivado por calor. La inactivación por calor disocia los viriones de los fagos, mientras que las endotoxinas residuales como los lipopolisacáridos (LPS) son termoestables ^8,33. Este método fue utilizado por Gogokhia et ^al.8 para determinar si se requerían viriones de fagos intactos y viables para la activación inmune. Se anima a los investigadores a probar ambos métodos (libre de fagos vs. inactivado por calor) y determinar qué control es el más apropiado para sus necesidades experimentales. Independientemente de lo que se elija, es importante reconocer que es poco probable que un control de tampón sea apropiado debido a la manipulación significativa que se requiere para concentrar y limpiar una reserva de fagos.
   1. Transfiera el volumen requerido de lisado de fagos T4 limpio, purificado y diluido del paso 1.2 (100 μl por ratón) a tubos de microcentrífuga estériles equipados con cierres de tapa.
   2. Lisado por calor en un bloque térmico a 95 °C durante 15 min¹⁶.
   3. OPCIONAL: Si se requiere la eliminación de ácidos nucleicos de fagos/bacterias, realice el tratamiento con DNasa I y RNasa A según Jakočiūnė y Moodley³⁴. Brevemente:
      1. Añadir 50 μL de tampón de DNasa I 10x, 1 μL de DNasa I (1 U/μL) y 1 μL de RNasa A (10 mg/mL) (ver Tabla de materiales) a 450 μL de lisado de fagos inactivado por calor.
      2. Incubar los lisados a 37 °C durante 1,5 h en un bloque térmico, sin agitar.
      3. Inactivar la DNasa I y la RNasa A añadiendo 20 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 ^M34.
   4. Mantenga los lisados a temperatura ambiente durante 10 minutos para que se enfríen y combine los lisados si se utilizan varios tubos. Conservar a 4 °C hasta la valoración.
   5. Realice un título de fagos para confirmar que no hay ningún fago T4 viable presente en el lisado. Almacenar lisados inactivados por calor a 4 °C.
   6. Utilice un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas según las instrucciones del fabricante para medir los niveles de endotoxinas en el lisado inactivado por calor. Diluir el lisado inactivado por calor en tampón SM de acuerdo con los niveles de endotoxinas presentes en el lisado de fagos emparejado.

2. Administración y seguimiento del fago T4 en ratones monocolonizados por E. coli

1. Monocolonización de ratones con E. coli
   1. Preparar E . coli para su administración en ratones GF⁸ mediante el cultivo de E. coli seleccionada de una sola colonia en medios LB durante la noche.
   2. En condiciones estrictas y estériles³⁵, administrar 200 μL de cultivo de E. coli a ratones GF alojados en aisladores de vinilo estériles o en jaulas herméticas de bioexclusión mediante sonda nasogástrica oral. Si se utilizan bacterias aerotolerantes, los ratones también pueden colonizarse mediante la aplicación de 200 μL de cultivo bacteriano en la parte posterior de cada ratón.
      NOTA: La dosis de inoculación dependerá de la cepa, ya que las diferentes bacterias demuestran una capacidad de supervivencia de pH^{diferente 36,37}. Zucoloto et ^al.35 recomiendan la inoculación con 1 x 10⁸ UFC por animal. Los resultados representativos que se muestran aquí se generaron a partir de ratones inoculados con un cultivo nocturno (no se determinó la UFC). Se pueden realizar experimentos piloto para determinar una dosis que resulte en una colonización confiable de la cepa de ratón de interés. El volumen de bacterias que se administrarán por sonda nasogástrica oral puede verse afectado por la edad y el peso de los ratones. Consulte el protocolo de ética animal individual de laboratorio o institucional para conocer las dosis máximas permitidas. El volumen sugerido aquí se basa en una asignación de sonda nasogástrica del 10% del peso corporal del ratón (por ejemplo, 200 μL como máximo para un ratón de 20 g). Algunas especies bacterianas no toleran la acidez del estómago y no logran colonizar el intestino. Considere primero la posibilidad de realizar una gasograma con 100 μL de NaHCO₃ 1 M para neutralizar los ácidos estomacales². Si se utiliza un anaerobio estricto para colonizar, el microbio deberá cultivarse en condiciones anaeróbicas y transferirse a la instalación de animales gnotobióticos en recipientes herméticos preparados individualmente (1 para cada ratón). Realice cada sonda rápidamente una vez que se abre el recipiente para limitar la pérdida de viabilidad microbiana debido a la exposición al oxígeno.
   3. Monitoree a los ratones para detectar efectos adversos para la salud.
      NOTA: En caso de efectos adversos para la salud, consulte las normas establecidas por el centro de cuidado de animales correspondiente. Los posibles efectos adversos para la salud incluyen, pero no se limitan a: (1) Aspiración de líquido sonda nasogástrica: los síntomas incluyen expulsión de burbujas por la nariz, respiración/jadeo con la boca abierta. (2) Perforación del esófago: los síntomas incluyen un rápido deterioro de la salud, encorvamiento, letargo, lo que lleva a la muerte del animal en 24 h. (3) Inflamación del esófago debido a sonda repetida: los síntomas incluyen dificultad para insertar la aguja de sonda nasogástrica. (4) Diarrea debida a alteraciones del microbioma.
   4. Confirmar la colonización bacteriana en gránulos fecales mediante cultivo al menos una vez por semana y/o mediante secuenciación de ARNr 16S³⁵.
      NOTA: Si coloniza reproductoras dentro de un aislador gnotobiótico para la producción de ratones experimentales, planifique con al menos 9 semanas de anticipación para la generación de ratones experimentales de primera generación de descendientes (F1) de 6 semanas de edad. Alternativamente, los ratones adultos GF pueden ser monocolonizados. En este enfoque, se recomienda esperar 7 semanas después de la colonización antes de la inoculación de los fagos, ya que este es el tiempo necesario para que la mucosa intestinal se estabilice después de la introducción de una microbiota compleja en ratones GF³⁸.
2. Inoculación oral del fago T4 en ratones monocolonizados por E. coli
   1. Diluir los lisados de fagos T4 y los controles del vehículo a una concentración predeterminada en tampón SM. Según Hsu et ^al.2, diluir los lisados de fagos para permitir la administración de 2 x 10⁶ pfu por ratón².
      NOTA: Se puede utilizar una concentración mayor o menor de fago dependiendo de la estabilidad del fago in vivo. Las dosis de 2 x 10², 2 x 10⁴ y 2 x 10⁶ pfu de fago T4 por ratón dieron lugar a una colonización estable y a largo plazo en el intestino que no parecía depender de la dosis (como se muestra en la sección de resultados representativos). Por lo tanto, la cinética fago-bacteria debe probarse in vivo antes de realizar experimentos a gran escala.
   2. En condiciones gnotobióticas estériles, se administró a cada ratón 100 μL de NaHCO₃ 1 M esterilizado en autoclave para neutralizar los ácidos estomacales. Espere 10 minutos, luego haga sonda nasogástrica con 100 μL de lisado de fagos T4 o control del vehículo.
   3. Monitoree a los ratones para detectar efectos adversos para la salud.

3. Monitorización de los niveles de fagos T4 in vivo

NOTA: Una vez que los ratones han sido inoculados con fagos, se puede medir la concentración tanto de fagos como de bacterias objetivo en muestras fecales o de tejido. Esto proporciona información sobre la cinética de la infección por fagos y la dinámica de colonización de ambos organismos.

1. Recubrimiento puntual del fago T4 para determinar la concentración en gránulos fecales
   1. Recoja los gránulos fecales de cada ratón en tubos de microcentrífuga estériles y previamente pesados para medir los niveles de fagos T4 y E. coli . Guarde los tubos en hielo hasta que se emplaquen.
      NOTA: Coloque las muestras en hielo en el intervalo entre la recolección y el siembra para retrasar el crecimiento de bacterias aerotolerantes. A lo largo de varias horas, puede haber un crecimiento de bacterias aeróbicas o la muerte de bacterias anaeróbicas debido a la exposición al oxígeno, lo que podría provocar recuentos de bacterias sesgados. Por lo tanto, la siembra de bacterias y fagos debe realizarse lo antes posible después de la recolección de la muestra. Las bacterias anaeróbicas obligadas no toleran la exposición al oxígeno. Para preservar la muestra, recoja las muestras en tubos sellados y transfiéralos a una cámara anaeróbica tan pronto como sea posible después de la recolección. Si no se detecta crecimiento en las muestras fecales, considere alternativas como la qPCR de ARNr 16S para la cuantificación bacteriana.
   2. Registre los pesos finales de cada tubo y calcule el peso de la muestra restando el peso inicial del tubo. Esto se utilizará para normalizar la concentración de fagos T4 y E. coli al peso de la muestra (ufp/g o ufc/g, respectivamente).
   3. Agregue 1 ml de tampón SM estéril a cada tubo y haga un vórtice a fondo a la velocidad máxima (>1 min) para homogeneizar los gránulos fecales. Si la muestra es inferior a 15 mg, se puede añadir un volumen menor de tampón SM. Registre el volumen de tampón SM agregado a cada muestra para los cálculos de ufc/g o ufp/g de muestra.
   4. Preparar una serie de 8 (o más, dependiendo de la concentración esperada de fagos) diluciones seriadas de 20 μL de cada muestra en tampón SM de 180 μL, en factores de 10. Agite brevemente cada muestra homogeneizada para mezclarla antes de agregarla al primer tubo/pocillo. Pipetear para mezclar entre cada adición y cambiar las puntas entre cada dilución para evitar que se inflen los recuentos de fagos o bacterias a través del arrastre de muestras.
      NOTA: Si las fibras y los residuos presentes en la muestra dificultan el pipeteo, agregue tampón adicional a la suspensión fecal para diluir aún más la muestra madre.
   5. Coloque 5 μL de cada dilución en placas de agar blando LB que contengan E. coli (para ensayos de placa de fagos) o placas de agar LB (agar al 1,5%, para ensayos de colonias bacterianas) para determinar la concentración de fagos T4 y E. coli en cada muestra. Para mayor precisión, localice cada muestra por triplicado.
      NOTA: Si se preparan diluciones en serie en una placa de 96 pocillos, se puede utilizar una pipeta multicanal P20 de 8 canales para pipetear cada columna de muestra diluida en serie en placas. Cambie las puntas entre cada dilución, incluso si se mueve de la más diluida a la más concentrada, ya que el fago puede adherirse a las paredes de la punta de la pipeta y alterar la cantidad de fago añadida a cada nuevo pocillo³¹.
   6. Deje que cada punto se seque antes de invertir la placa y colocarla en la incubadora. Incubar durante la noche a 37 °C.
   7. Para cada muestra, seleccione la dilución en la que hay de 3 a 30 placas contables por punto. Cuente y registre el número de placas en la mancha y la dilución utilizada.
   8. Calcule la ufp/g de la muestra dividiendo el número de placas por el volumen sembrado en cada punto para obtener la ufp/μL. Multiplique esto por el factor de dilución y por el volumen de tampón SM agregado a cada muestra para obtener la ufp/muestra. Por último, divida por el peso de la muestra para obtener pfu/g³⁰.
      
      
2. Toma de muestras de tejido en los criterios de valoración experimentales
   1. En cada punto de tiempo seleccionado, eutanasiar ratones según el protocolo institucional de ética animal aprobado y recolectar el contenido cecal, el contenido del intestino delgado y grueso y cualquier tejido de interés en tubos de microcentrífuga estériles de fondo redondo de 2 ml prepesados.
   2. Registre los pesos finales de cada tubo para calcular el peso de la muestra. Guarde los pañuelos desechables y el contenido cecal en hielo hasta el mismo día del emplatado.
   3. Agregue tampón SM estéril a cada tubo y registre los volúmenes agregados.
   4. Para el contenido cecal e intestinal, tome muestras de vórtice minuciosamente (>1 min) según el paso 3.1.3.
   5. Para las muestras de tejido, agregue una perla de metal estéril a cada tubo. Homogeneizar los tejidos utilizando un lisador de tejidos (ver Tabla de Materiales) a 20 Hz durante 5 min o hasta que los tejidos se disocien y la suspensión sea homogénea.
      NOTA: Si las muestras no se homogeneizan bien, considere aumentar el volumen de tampón SM agregado, aumentar el tiempo de homogeneización o aumentar la frecuencia de homogeneización a 30 Hz. También se puede utilizar un homogeneizador de tejidos para disociar los tejidos, al tiempo que permite la recuperación de bacterias y fagos^39,40. Los homogeneizadores funcionan a frecuencias más altas que los lisadores de tejidos, al tiempo que mantienen la integridad de las bacterias.
   6. Preparar diluciones seriadas de cada muestra en factores de 10 y realizar la siembra por puntos para determinar las concentraciones de E. coli y fagos T4 en cada muestra, como se describe en los pasos 3.1.4-3.1.8⁴¹.

Resultados

Para investigar las interacciones entre el fago T4 y la díada E. coli en el intestino murino, se prepararon, limpiaron y purificaron los lisados del fago T4 y del vehículo (Figura 1A). Los lisados de fagos T4 se titularon mediante ensayo de placa y se diluyeron a 2 x 10⁷ ufp/ml (2 x 10⁶ ufc/ratón) en tampón SM. Los lisados de vehículos también se titularon para confirmar la ausencia de presencia de fagos viables y se diluyeron en el mismo volumen de tampón SM que el lisado de fagos T4. Los niveles de endotoxinas se cuantificaron en lisados diluidos utilizando un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas. El fago T4, el fago inactivado por calor y el lisado de vehículos tenían niveles de endotoxinas por debajo de los niveles aceptables para el agua potable (<20 UE/ml)²⁵ (Figura 1B). Como el lisado del vehículo tenía una cantidad de endotoxina similar a la del lisado del fago T4, se consideró que era un control adecuado. El lisado de fagos inactivado por calor (2 x 10⁷ puf/mL antes del tratamiento térmico) tenía menos endotoxinas que el lisado de fagos del vehículo y T4. De acuerdo con las instrucciones del kit, las muestras que habían sido tratadas con 1-octanol se analizaron para determinar la inhibición del ensayo mediante la adición de un patrón de endotoxinas al lisado del vehículo (vehículo con picos), para obtener una concentración final de 0,5 UE/ml. Los niveles de endotoxinas de los vehículos aumentados menos los niveles de endotoxinas de los vehículos midieron 0,5 UE/ml ±25%, según las recomendaciones del fabricante (Figura 1B). Esto demostró que el 1-octanol se eliminó con éxito y que no hubo inhibición del ensayo causada por los lisados que pudiera interferir con los resultados del ensayo.

E. coli Los ratones C57BL/6 monocolonizados K-12 (BW25113) se criaron dentro de un aislador de vinilo de película flexible estéril en condiciones gnotobióticas (Figura 2A). Los ratones de la generación F0 fueron colonizados con E. coli a través de su adición a su entorno y co-vivienda. Solo se utilizaron para los experimentos la progenie (generación F1 y F2) que fue colonizada con E. coli desde el nacimiento a través de la transmisión vertical y el co-alojamiento. Esta estrategia controló los cambios en el sistema inmune, la producción de moco y el desarrollo del tracto gastrointestinal que ocurren en respuesta a la inoculación bacteriana^22,37, lo que permite medir los cambios que ocurren solo debido a la introducción de fagos. Una vez maduros, los ratones experimentales fueron transferidos a isojaulas estériles, donde cada uno recibió 2 x 10⁶ pfu de fago T4 o un volumen igual de lisado de vehículo por sonda oral a las 6-8 semanas de edad. La abundancia de fagos T4 y E. coli se monitoreó durante cuatro semanas mediante la recolección de gránulos fecales y ensayos de siembra puntual en agar al 0,5% (blando) o agar al 1,5%, respectivamente. En el transcurso de este experimento, el fago T4 y E. coli pudieron coexistir sin que ninguna de las poblaciones se agotara (Figura 2B, C). La administración oral de fagos T4 a dosis más bajas de 2 x 10² y 2 x 10⁴ ufp/ratón no redujo la capacidad del fago T4 para colonizar el intestino en comparación con 2 x 10⁶ ufp (Figura 2D). Del mismo modo, no se observó un efecto dosis-dependiente de la inoculación de T4 sobre los niveles de E. coli (Figura 2E).

Es importante destacar que se encontró que la consistencia en la siembra entre las muestras es crucial para el recuento de placas. Por ejemplo, al añadir bacterias al agar blando, se determinó que la densidad de bacterias influía en gran medida en el resultado del ensayo. La adición de E. coli subcultivada durante 1 h, 1,5 h o 2 h, dio como resultado recuentos de placa más bajos que con la adición de E. coli subcultivada durante 2,8 h o más. Además, la cuantificación de la placa se estabilizó en ~1 x 10⁹ pfu/mL cuando E . coli se subcultivó durante 2,8 h a 16 h (durante la noche), lo que supuso un aumento de aproximadamente 5 veces en comparación con el valor calculado a partir de un subcultivo de 1 h (~2 x 10⁸ ufp/ml) (Figura 3A). En lugar de subcultivar, las bacterias objetivo se pueden inocular en agar blando a partir de cultivos nocturnos. Aquí, el volumen de las 16 h (durante la noche) del cultivo de E. coli que se inoculó en el agar blando afectó los recuentos de placa (Figura 3B). Estos resultados indican que la densidad de E. coli dentro del agar puede influir en los recuentos de placas. En ambos enfoques, los resultados de la cuantificación de fagos se estabilizaron en el mismo valor (10⁹ ufp/ml), lo que sugiere que las bacterias objetivo deben tener una densidad suficientemente alta en el agar blando para garantizar la precisión del recuento de placas.

En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de desarrollar una comprensión de la cinética de los fagos y las bacterias a través de experimentos piloto in vitro e in vivo antes de realizar manipulaciones experimentales.

Figura 1: Preparación de lisados de fagos. (A) Flujo de trabajo para iniciar un lisado de fagos a partir de un stock de fagos de alto título. Los lisados se propagaron, limpiaron, concentraron y eliminaron las endotoxinas. El 1-octanol contaminante se eliminó mediante el vacío de velocidad. (B) Las endotoxinas se cuantificaron en lisados de fagos y vehículos utilizando un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas. Las líneas azules discontinuas indican los límites superior e inferior para refutar la inhibición del producto en el control de la inhibición del producto (0,5 UE/ml ± 25%). Cada punto representa una de las dos réplicas técnicas. La altura de la barra representa la media en las réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Generación de ratones monocolonizados y monitorización de los niveles de fagos y bacterias en gránulos fecales. (A) Flujo de trabajo para colonizar ratones libres de gérmenes con una sola especie de bacteria y generación de ratones monocolonizados F1 y F2. (B-E) Niveles de fago T4 y E. coli detectados en gránulos fecales de ratones C57BL/6 que nacieron monocolonizados con E. coli y fueron inoculados con el fago T4 a las 6-8 semanas de edad. En el día 0 (pre-colonización) y los días indicados después de la colonización, los niveles de fagos T4 se midieron mediante siembra puntual y ensayos de placa utilizando el método de una sola capa de agar. Los niveles de E. coli se midieron mediante siembra puntual en agar 1.5% LB. (B, C) Cinética de los niveles de (B) fagos T4 y (C) E. coli en gránulos fecales recuperados después de la inoculación con 2 x 10⁶ pfu de fago T4 o lisado de vehículo (normalizado para niveles de volumen y endotoxinas). (D, E) (D) Niveles de fagos T4 y (E) E. coli en gránulos fecales recuperados después de la inoculación con 2 x 10² ufp, 2 x 10⁴ ufpf o 2 x 10⁶ ufp de fago T4. Las barras de error representan la media y el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Precisión de la resolución de problemas en los ensayos de placa. (A) Título de lisado de fagos T4 utilizando cultivos o subcultivos nocturnos de E. coli para la preparación de agar blando (agar 0,5%, LB). Los subcultivos se realizaron utilizando una dilución 1:50 de cultivo de E. coli durante la noche en LB fresco. Se inocularon 5 mL de preparaciones de agar blando con 100 μL de E. coli y 20 μL de fago T4. CaCl₂ y MgSO₄ no se agregaron al agar blando para estas pruebas, pero se pueden agregar si se desea. Los tiempos de subcultivo de E. coli por debajo de 2,8 h dieron como resultado un título aparente de fagos más bajo. (B) Título de lisado de fagos T4 utilizando diferentes densidades de E. coli en preparación de agar blando. La adición de diferentes volúmenes de E. coli de un cultivo nocturno (no subcultivado, como en A) en el agar blando dio como resultado diferentes títulos aparentes de fagos. Las barras de error representan la incertidumbre calculada del título de fagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El estudio de los fagos en el microbioma presenta un desafío significativo en comparación con sus contrapartes bacterianas. Específicamente, los fagos no contienen un marcador filogenético conservado común a todos los fagos similar a las subunidades ribosómicas 16S y 18S que permitan la facilidad en la secuenciación e identificación de especies procariotas y eucariotas, respectivamente⁴². Sin embargo, con los avances en los enfoques de secuenciación de próxima generación, incluido el aumento de la longitud de lectura, el rendimiento y la disminución de los costos, viene la rápida expansión de las bases de datos del genoma de los bacteriófagos 42,43,44. Con mucho trabajo preliminar en el descubrimiento de fagos en marcha, la investigación de fagos es ahora más accesible que nunca. Como miembros clave del microbioma intestinal y los organismos genéticamente más diversos de la Tierra, los fagos presentan un ángulo emocionante para nuevas investigaciones que investigan la complejidad del microbioma. Los protocolos descritos aquí se centran en la investigación de especies conocidas de fagos en ratones colonizados por sus bacterias objetivo. Cabe señalar que estos protocolos proporcionan una guía para el estudio de fagos in vivo y pueden ampliarse con el crecimiento del campo.

La investigación de bacteriófagos para el tratamiento terapéutico de infecciones bacterianas pasó de moda en gran medida con la llegada de los antibióticos en la década de 1940. Sin embargo, la prescripción excesiva y el uso indebido de antibióticos han acelerado la aparición de patógenos multirresistentes como un importante problema de salud pública³. Los fagos presentan una alternativa potencial atractiva a los antibióticos, debido a su alto grado de especificidad del huésped³. Es importante destacar que, dado que los fagos se instalan de forma natural como miembros del microbioma intestinal humano, es necesario comprender primero el papel que desempeñan los fagos en estos entornos complejos. Si bien muchos estudios han investigado la relación entre un fago y su bacteria objetivo in vitro, es importante considerar cómo estas relaciones podrían mantenerse dentro del paisaje del tracto gastrointestinal. Al igual que en los estudios exploratorios que investigan los componentes bacterianos de la microbiota, los modelos de ratón simplificados, como los ratones GF y los monocolonizados, permiten aislar los efectos de los fagos en sus especies diana y cómo esta relación contribuye a la respuesta inmunitaria. Este es un paso importante hacia la terapia con fagos, ya que algunos fagos pueden no proporcionar beneficios cuando se introducen en el intestino. Por ejemplo, el fago Pf4 de Pseudomonas aeruginosa exacerba la enfermedad causada por su huésped, al inhibir tanto las respuestas inmunitarias antibacterianas como la migración de queratinocitos, lo que resulta en una alteración de la cicatrización de heridas^18,45. Los procedimientos aquí descritos tienen como objetivo estandarizar las técnicas de estudio de los fagos como miembros de la microbiota murina. Haciéndose eco de los estudios pioneros que investigan el impacto de la microbiota en el huésped metazoario, la continuación de la investigación en fagos en el contexto de la microbiota puede resultar emocionante y significativa para la comprensión más amplia del multibioma⁴⁶.

Limitaciones
Los protocolos aquí descritos se han optimizado para estudiar la competencia entre el fago T4 y su bacteria diana, E. coli, cuando los fagos T4 se administran por sonda oral a ratones monocolonizados por E. coli. Al igual que las bacterias, las distintas especies de fagos se comportan de manera diferente entre sí, con diferentes tiempos de replicación, tamaños de ráfaga y rangos de objetivos bacterianos⁴⁷. Por lo tanto, cuando se investigan otros pares de fagos y bacterias en modelos animales similares, se debe tener cuidado de optimizar estos protocolos en todos los pasos. Por ejemplo, los fagos con un tiempo de replicación más largo y/o un tamaño de ráfaga más pequeño pueden requerir una incubación más larga con su objetivo bacteriano para la producción de un lisado de alto título. Del mismo modo, es posible que sea necesario ampliar los tiempos de incubación en placa para los ensayos de placa. Además, los fagos con un tiempo de replicación corto y/o un tamaño de ráfaga alto pueden requerir incubaciones en placa más cortas, ya que la incubación durante la noche puede provocar un crecimiento excesivo de placa. Si se desconocen las condiciones de propagación de un fago específico de interés, deben establecerse las bases para determinar las condiciones de crecimiento antes de comenzar el trabajo in vivo ⁴⁸.

Los dominios similares a Ig que se encuentran dentro de las proteínas de la cápside Hoc del fago T4 facilitan la adherencia al moco intestinal¹¹. Dependiendo de la capacidad de unión al moco del fago elegido, la cinética de los niveles de bacterias fagos en muestras fecales puede diferir de los resultados mostrados en la Figura 2B-E. Por ejemplo, se demostró en sistemas de intestino en un chip que los fagos que contenían proteínas Hoc intactas tenían una mayor capacidad de eliminación de E. coli en comparación con el fago¹¹ con deficiencia de Hoc. Si bien se sospecha que los fagos T4 son retenidos a través de la unión al moco in vivo 11,12,13, no se puede descartar el impacto de la reinoculación a través del comportamiento copropagático de ratones. Estos efectos podrían reducirse mediante el uso de fondos de jaulas de alambre o cambiando con frecuencia las jaulas. Dado que no se han identificado dominios similares a Ig en fagos de ssDNA o ARN⁴⁹, será interesante desentrañar las otras estrategias utilizadas por los fagos para retener la residencia dentro de la mucosa intestinal.

Por último, estos estudios exploratorios han examinado las interacciones fago-bacteria-huésped únicamente en la homeostasis. En modelos animales de enfermedades humanas, se desconoce cómo los cambios en la integridad de la barrera intestinal, como en la EII, podrían afectar estas interacciones. Estudios recientes han demostrado que los fagos caudovirales han aumentado la riqueza y diversidad en pacientes con EII ^7,8. En modelos de ratón, se demostró que el tratamiento continuo con fagos exacerbaba la colitis experimental inducida por sulfato de sodio de dextrano (DSS)⁸. Queda por determinar cómo se desarrollan las interacciones fago-bacteria-huésped en entornos inflamatorios, y si el deterioro de la integridad de la barrera facilita la inflamación inducida por fagos.

Solución de problemas y métodos alternativos

Modelos de ratón
Los modelos de ratón monocolonizados permiten interrogar a una sola especie de bacteria sobre la fisiología del huésped¹⁶. La investigación con ratones monocolonizados ha desempeñado un papel crucial en la elucidación de cómo la microbiota influye en el sistema inmunitario²². Como sistema modelo, los ratones monocolonizados no recapitulan la fisiología de sus homólogos de la microbiota convencional. Más similares a los ratones GF, los ratones monocolonizados por E. coli tienen una producción reducida de moco (similar a los ratones GF⁵⁰) y un sistema inmunológico inmaduro²³. Sin embargo, los ratones monocolonizados han sido invaluables para desentrañar los efectos específicos de los microbios de especies individuales en el tracto gastrointestinal y el desarrollo inmunológico. Un ejemplo clásico es el descubrimiento de que las bacterias filamentosas segmentadas (SFB) son potentes inductoras de células CD4⁺ T helper 17 en ratones²⁴. Con referencia a la mucosidad, existen efectos específicos de los microbios sobre la transcripción⁵¹del gen del moco y el grosor del moco⁵⁰. Aunque limitados, los ratones monocolonizados brindan oportunidades para investigar el impacto de un par de fagos y bacterias en el huésped mamífero en un modelo controlado. Es importante destacar que los fagos pueden, y deben, investigarse en el contexto de una microbiota compleja. En el momento de escribir este artículo, pocos estudios han abordado los impactos de la depredación de fagos de especies bacterianas comensales dentro de un microbioma convencional. Se trata de una futura aplicación de los protocolos presentados en este trabajo, que podrían adaptarse para facilitar estos estudios.

Uso de controles adecuados del vehículo
Los controles apropiados son esenciales en cualquier experimento. Aquí, se definió un vehículo adecuado para la administración oral a ratones que controla la limpieza y purificación de varios pasos de los lisados de fagos T4. Un requisito importante es que el control del vehículo contenga el mismo nivel de endotoxinas bacterianas que el lisado de fagos, para controlar cualquier respuesta inmunitaria mediada por endotoxinas. El cloroformo y el 1-octanol se añaden al lisado como parte del proceso de purificación y posteriormente se eliminan. Para controlar las posibles respuestas inmunitarias que pueden generarse a los niveles de trazas de estas sustancias químicas, se puede producir un lisado bacteriano libre de fagos como control del vehículo. Los lisados de fagos y vehículos T4 contenían una concentración muy baja de endotoxinas bacterianas, muy por debajo de los niveles permitidos en el agua potable²⁵ (Figura 1B). Se pueden utilizar controles alternativos y se pueden modificar para adaptarse a la pregunta de investigación prevista. Más simplemente, se puede usar un tampón de fagos que contenga una cantidad equivalente de endotoxina, aunque esto no tiene en cuenta los procesos de limpieza y purificación de varios pasos. Gogokhia et ^al.8informaron del uso de fagos inactivados por calor como control de si la proteína del fago sin ADN era suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. En nuestras manos, el fago inactivado por calor tenía niveles más bajos de endotoxina que el lisado de fagos T4 (Figura 1B) y, por lo tanto, no se utilizó para controlar los niveles de endotoxinas en este estudio. Sin embargo, alentamos la prueba de ambos protocolos para determinar qué método es el más adecuado para fines experimentales individuales. Si el vehículo y los lisados de fagos T4 difieren significativamente en la cantidad de endotoxina presente, el lisado que contiene los niveles más bajos se puede complementar con endotoxina purificada. El 1-octanol se agrega a los lisados durante el proceso de purificación, pero inactiva la prueba del kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas. Es importante probar la inhibición del producto por sustancias potencialmente interferentes en la muestra para garantizar que las mediciones de endotoxinas sean precisas. Si se sospecha de inhibición del producto, es posible que la muestra no se haya aspirado a la velocidad durante el tiempo suficiente. Si los problemas persisten, se puede utilizar la diálisis para eliminar el 1-octanol²⁵ restante.

Vía de administración y dosis
Debido a la capacidad de unión al moco del fago T4, los modelos de ratón se inocularon en una sola dosis oral de sonda nasogástrica. El propósito de esto fue monitorear la duración de la cohabitación de fagos y E. coli en el tracto gastrointestinal; sin embargo, se han descrito otros enfoques para estudiar fagos en modelos in vivo. Por ejemplo, el agua potable enriquecida con fagos se ha utilizado para proporcionar un suministro continuo de fagos a ratones ^8,20. El beneficio de este método de administración es que los fagos se reponen continuamente, incluso en ausencia de un huésped bacteriano, como lo demostraron Gogokhia et al.⁸. Este diseño experimental permitió evaluar la respuesta inmunitaria a los fagos en ausencia de bacterias y proporcionó una estimulación inmunitaria continua a lo largo del experimento. Desde el punto de vista fisiológico, este método no representa un curso natural de infección por fagos o colonización de fagos en un entorno intestinal, pero proporciona información importante sobre cómo la exposición repetida a fagos puede preparar el sistema inmunitario. Esto tiene importancia en el contexto del desarrollo de la terapia con fagos, ya que los cócteles de fagos pueden administrarse como un curso de tratamiento para tratar infecciones bacterianas intestinales, similar a los regímenes de antibióticos. En el contexto del par fago T4-E. coli, se determinó que la disminución de la dosis de fago T4 aplicada por vía oral a ratones monocolonizados no alteró los niveles de fagos o bacterias fecales (Figura 2D, E). Por lo tanto, en este caso, la dosis de inoculación del fago T4 no es crucial para el mantenimiento de la colonización estable del fago T4-E. coli en el intestino de ratones bicolonizados. Se observa que la dosis más baja administrada fue de 200 ufp/ratón, y la dosis más alta fue de 2 x 10⁶ ufp/ratón (según Hsu et al.) ². Por lo tanto, en este estudio no se dispone de datos que apoyen la cinética del fago T4-E. coli fuera de este rango.

Títulos de fagos localizados y en placa entera
Para medir los niveles de fagos T4 en heces y tejidos, los protocolos descritos aquí se basan en técnicas de siembra puntual en lugar de ensayos de placa completa, lo que puede contribuir a la variabilidad en los niveles de fagos entre ratones (Figura 2B). En las técnicas de placa entera, las placas se cuentan en un área más grande, lo que permite una cuantificación más precisa. Sin embargo, una dilución apropiada de cada muestra generalmente debe estar predeterminada por siembra localizada. Dado que las muestras se analizaron el día de la recolección de la muestra, se consideró que la siembra por puntos era el método más apropiado para un enfoque de mayor rendimiento. Por lo tanto, la resolución de estos datos se representa con mayor precisión por el orden de magnitud del fago en cada muestra. Para mediciones precisas de fagos, hay consideraciones adicionales para cada fago. Se pueden obtener mediciones más precisas mediante ensayos de placa completa o mediante el uso de rangos de dilución en serie más pequeños para cada muestra. Si estos métodos siguen dando lugar a recuentos variables de fagos o bacterias objetivo, sería prudente evaluar si las interacciones únicas entre el fago y las bacterias podrían explicar las diferencias entre ratones individuales a través de la secuenciación metagenómica u otros métodos para evaluar experimentalmente la coevolución y la resistencia. De acuerdo con Bonilla et ^al.25, cuando se prepara agar blando para ensayos de placa, es importante ser consistente con la cantidad de huésped bacteriano agregado²⁵. Como se muestra en la Figura 3, incluso los cambios relativamente pequeños en los tiempos de cultivo de las bacterias (Figura 3A) y la densidad (Figura 3B) pueden afectar la precisión de los ensayos de placa. Estos hallazgos pueden ser diferentes para otros pares de fagos y bacterias, y se recomiendan experimentos similares cuando se comienza con nuevos organismos. Además, para nuevos pares de fagos-bacterias, se deben realizar experimentos exploratorios para determinar las características de crecimiento de cada uno. Por ejemplo, se pueden realizar curvas de crecimiento para determinar el retraso, las fases exponenciales y estacionarias, y la tasa de crecimiento de las bacterias. El experimento de crecimiento de un solo paso se puede utilizar para determinar el período latente (tiempo de lisis) y el tamaño de la ráfaga (número de fagos liberados tras la lisis de la bacteria) de los fagos^52,53.

Medición alternativa del fago T4 mediante qPCR
La cuantificación de fagos se puede realizar con ensayos de placa, como se ha descrito anteriormente, o mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos dos enfoques tienen una distinción importante: los ensayos de placa determinan el número de fagos viables capaces de infectar y matar a sus huéspedes bacterianos, mientras que la qPCR cuantifica el material genético específico del fago (como un indicador del número de fagos presentes) pero no proporciona información sobre la viabilidad y la infectividad del fago. Se realizaron qPCRs para comparar la cuantificación de las copias de genes de fagos con las placas formadas en los ensayos de placa utilizando cebadores descritos por Hsu et ^al.2 (Figura 4). El ADN del fago T4 se extrajo y amplificó a partir del contenido cecal de ratones bicolonizados por el fago T4/E. coli . En la mayoría de los ratones, la qPCR y los ensayos de placa detectaron niveles similares de fago T4 en el contenido cecal (Figura 4A, B). Si bien se detectó cierta amplificación en el contenido cecal inoculado en el vehículo, las copias de genes calculadas/g estuvieron por debajo del límite de detección (LOD) (Figura 4A). La ausencia de fagos cuantificables en estas muestras se confirmó mediante electroforesis en gel. Los productos del gen del fago T4 (96 pb) se visualizaron fácilmente en el ADN aislado del contenido cecal de ratones inoculados con T4, pero estaban ausentes de los controles del vehículo (Figura 4C).

En estas pruebas, se detectaron copias del gen del fago T4 en el contenido cecal de un ratón colonizado por el fago T4 mediante qPCR (Figura 4A, flecha) a pesar de la incapacidad de detectar T4 en ensayos de placa de la misma muestra (Figura 4B, flecha). Estos resultados sugieren que las partículas virales que no forman placas pueden surgir in vivo, ya sea por producción de partículas virales defectuosas o por coevolución de fagos y/o bacterias. Las técnicas de recubrimiento bacteriano en agar duro se pueden utilizar para determinar la susceptibilidad de las bacterias fecales al fago¹⁴. Sugerimos que la detección mediada por qPCR puede ser una valiosa adición a los flujos de trabajo de fagos in vivo , ya que puede ser más robusta para la evolución de fagos dentro del entorno intestinal, dado que se dirige a secuencias de genes cortas y conservadas. Los enfoques no sesgados, como la metagenómica, son valiosos para examinar la coevolución de los fagos y las bacterias y las abundancias relativas, pero en última instancia pueden ser más costosos.

Figura 4: Detección del fago T 4 mediante qPCR. Las cargas de fagos (A, B) T4 se midieron mediante (A) qPCR absoluta o (B) ensayo de placa en el contenido cecal de ratones C57BL/6 colonizados por E. coli en el día 29 después de la inoculación con el fago o vehículo T4. La flecha indica los resultados de un ratón individual que tenía copias detectables del genoma T4, pero no virus plaqueable en el contenido cecal. (C) Electroforesis en gel de productos de PCR que muestran la presencia de la banda de 96 pb en muestras cecales inoculadas con fagos T4, pero no en muestras inoculadas en vehículos. Se utilizó una escalera de ADN de 100 pb. LOD = límite de detección. Las barras de error representan la media y el SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aplicaciones
Los bacteriófagos representan más del 90% de las partículas similares a virus presentes en el microbioma⁴⁴; Sin embargo, el impacto de los fagos en el microbioma intestinal es poco conocido. Los estudios iniciales que investigaron el componente bacteriano del microbioma lo hicieron aislando especies particulares y estudiando su impacto en la maduración inmune ^22,24. Interrogatorios similares del fageoma presentan una tarea desalentadora pero necesaria, y un requisito para obtener una comprensión completa del multibioma⁴⁶. Si bien el enfoque del desarrollo de la terapia con fagos tiende a estar orientado a curar las infecciones bacterianas sépticas, es importante comprender cómo la adición de un cóctel de fagos al tracto gastrointestinal puede alterar el ecosistema intestinal. Además, la seguridad de los cócteles terapéuticos de fagos debe evaluarse mediante la generación de un perfil inmunitario. Los fagos se han investigado como posibles tratamientos para infecciones bacterianas intestinales como C. difficile⁵ y Salmonella enterica serovar Typhimurium⁵⁴. Estudios recientes también han demostrado que las FFT son igual o más eficaces en el tratamiento de la enterocolitis necrotizante en cerdos prematuros⁹, lo que sugiere que el componente viral de los trasplantes de microbiota fecal (TMF) puede desempeñar un papel activo en la reducción de la enfermedad. Se justifican estudios continuos que investiguen el papel de los fagos en el microbioma para promover el desarrollo de terapias con fagos contra patógenos intestinales, pero también para informar mejor a los TMF como tratamiento para la enfermedad. Al estandarizar los métodos para el estudio de fagos in vivo, se aumentará la transparencia y la reproducibilidad en la investigación de fagos, junto con una guía para aquellos que amplían su trabajo a modelos de ratón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Unidades de filtro de vacío desechables estériles	Millipore Sigma
Agarosa (grado de biología molecular / multipropósito / bajo)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 dispositivo de filtro centrífugo, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubos, SST	BD Medical	365967
Jaulas herméticas de bioexclusión (jaulas ISO)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Termociclador con módulo de reacción rápida de 96 pocillos	BioRad	1851196
cloruro de calcio dihidratado (cristales blancos a polvo)	Fisher BioReagents	BP510-500
Bloqueos de tapa para tubo de 1,5 ml 100 / paquete	Andwin Scientific
Cloroformo (Etanol como conservante/ACS certificado)	Fisher	C298-500
Perlas de acero recubiertas de cobre (4,5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Kit de pañuelos (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Mezcla maestra de PCR verde (2X)	Thermo Scientific	K1081
Solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), para biología molecular, 0,5 M en H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Polvo / Copos, Fisher BioReactivos y comercio;	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents&comercio; Medios de microbiología: Caldo LB (polvo) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp Escalera de ADN	Thermo Scientific	SM0241
Verde FastMix® Mezcla qPCR, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
Filtros HEPA para tapas isocage, FILTROS H14 ESTERILIZABLES EN AUTOCLAVE PARA LÍNEA ISO- IRRADIADO	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Sulfato de magnesio heptahidratado	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Agitador incubado	Thermo Scientific	8354-30-0009
Medios de microbiología: Caldo LB (polvo) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Tubos de microcentrífuga con tapón a presión de bloqueo, 2 ml	Fisher	14-666-315
Película de sellado Parafilm	Bemis	PM-996
Existencias de fagos	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Dieta del ratón 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Kit cuantitativo de endotoxinas cromogénicas	Thermo Scientific
RNasa A (17,500 U)	Qiagen	19101
Conjunto de DNasa libre de RNasa	Qiagen	79254
Bicarbonato de sodio (polvo blanco fino)	Fisher Chemical	BP328-500
Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado)	Sonicador	Fisher Chemical S271
(modelo de sonda CL-18; modelo de fuente de alimentación FB50)	Fisher scentific	n/a
Aislador de película flexible estéril	Clase Biológicamente Limpio	n/a
SYBR&comercio; Tinción de gel de ADN seguro	Invitrogen	S33102
T100 Termociclador	BioRad	1861096
cebador de fagos T4, adelante (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
Cebador de fagos T4, adelante (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, solución 1M, pH 8.0, grado de biología molecular, Thermo Scientific ultrapuro	;
Agua, (libre de ADNASA, ARNASA)	BioReactivos de Fisher	BP2484100