Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Resumen

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Resumen

La inmunoterapia basada en anticuerpos monoclonales dirigida a los antígenos tumorales es ahora un pilar del tratamiento del cáncer. Uno de los mecanismos de acción clínicamente relevantes de los anticuerpos es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), en la que el anticuerpo se une a las células cancerosas y activa el componente celular del sistema inmunitario, por ejemplo, las células asesinas naturales (NK), para destruir las células tumorales. La eficacia de estas terapias podría mejorarse mediante la identificación de compuestos adyuvantes que aumenten la sensibilidad de las células cancerosas o la potencia de las células inmunitarias. Además, las interacciones farmacológicas no descubiertas en pacientes de cáncer comedicados por afecciones previas o síntomas asociados con el cáncer pueden determinar el éxito de la terapia con anticuerpos; por lo tanto, es necesario eliminar estas interacciones farmacológicas no deseadas. Con estos objetivos en mente, creamos un modelo de ADCC para el cáncer y describimos aquí un protocolo simple para encontrar fármacos moduladores de ADCC. Dado que los modelos 3D, como los esferoides de células cancerosas, son superiores a los cultivos 2D en la predicción de las respuestas in vivo de los tumores a las terapias contra el cáncer, los cocultivos esferoides de células de cáncer de mama HER2+ JIMT-1 que expresan EGFP y el NK92. Se establecieron líneas celulares CD16 y se indujeron con trastuzumab, un anticuerpo monoclonal clínicamente aprobado contra el cáncer de mama HER2 positivo. Se permitió que los esferoides JIMT-1 se formaran en placas de 96 pocillos con fondo en U repelentes a las células. El día 3 se añadieron células NK y trastuzumab. A continuación, los esferoides se tiñeron con anexina V-Alexa 647 para medir la muerte celular apoptótica, que se cuantificó en la zona periférica de los esferoides con un microscopio automatizado. La aplicabilidad de nuestro ensayo para identificar moléculas moduladoras de ADCC se demuestra al mostrar que Sunitinib, un inhibidor del receptor tirosina quinasa aprobado por la FDA contra el cáncer metastásico, elimina casi por completo el ADCC. La generación de esferoides y las canalizaciones de adquisición y análisis de imágenes son compatibles con el cribado de alto rendimiento de compuestos moduladores de ADCC en esferoides de células cancerosas.

Introducción

Los esferoides tumorales multicelulares (MCTS) son modelos tridimensionales (3D) ampliamente utilizados que se forman debido a la tendencia de las células adherentes a agregarse y representan una herramienta importante para obtener información mecanicista sobre la biología de las células cancerosas. Pueden generarse a partir de una amplia gama de tipos celulares mediante numerosas técnicas, como los cultivos 3D basados en líquidos y en andamios¹. Su principal ventaja sobre los modelos 2D monocapa es que recapitulan las principales características de los tumores in vivo , a saber, la organización estructural y la hipoxia, imitando el comportamiento biológico de las células tumorales, especialmente los mecanismos que conducen al escape terapéutico y la resistencia a los fármacos². Por lo tanto, dado que los MCTS pueden mejorar la previsibilidad de la toxicidad y la sensibilidad a los medicamentos, se utilizan ampliamente para estudiar cánceres en 3D y podrían mejorar el desarrollo de medicamentos efectivos para diferentes tipos de cáncer³.

Para estudiar cualquier enfermedad, existe una necesidad crítica de modelos relevantes y convenientes. La creación de modelos para estudios de inmunología del cáncer es un reto porque el sistema inmunitario está formado por varios tipos de células. Cada tipo de célula tiene varios subtipos y un amplio espectro de estados de activación. Estos diferentes tipos de células inmunitarias interactúan con las células cancerosas y otros componentes tumorales, lo que en última instancia influye en el resultado de la enfermedad. Los métodos de cultivo celular in vitro 2D no logran recapitular estas complejas interacciones celulares, ya que carecen de traducibilidad y son incapaces de predecir la acción de un fármaco a nivel de sistema (por ejemplo, en tejidos)^4,5. Además, los modelos de ratón también tienen graves limitaciones debido a las diferencias fundamentales entre el sistema inmunitario humano y el murino. Los sistemas de cultivo 3D pueden, por lo tanto, llenar los vacíos actuales en los modelos disponibles, proporcionando un método alternativo y mejorando nuestra comprensión de la inmunología del cáncer⁶. En concreto, los modelos de esferoides podrían utilizarse para probar inmunoterapias, principalmente para evaluar la eficacia del cribado de fármacos y los anticuerpos terapéuticos para mejorar la infiltración de células inmunitarias y los efectos antitumorales contra las dianas esferoides⁷. Además, se ha demostrado ampliamente el potencial de los MCTS compuestos por células en diferentes estados metabólicos y proliferativos para estudiar las interacciones entre las células del estroma (por ejemplo, linfocitos, macrófagos, fibroblastos) y las células cancerosas y para el desarrollo de nuevas estrategias contra el cáncer⁸. Por lo tanto, existe una necesidad vital de corroborar plataformas predictivas y precisas para impulsar el proceso de prueba de fármacos, teniendo en cuenta la fisiopatología del microambiente tumoral.

El cáncer de mama (CM) es el cáncer más frecuente diagnosticado en mujeres a nivel mundial. La clasificación clínica de esta enfermedad heterogénea se basa en la presencia de receptores transmembrana, por ejemplo, receptores de estrógeno (RE) y progesterona (PR) (denominados colectivamente receptores hormonales, HR) junto con la sobreexpresión o amplificación de la proteína/oncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Con base en la expresión inmunohistoquímica de estos receptores, se reconocen comúnmente cuatro subtipos: cáncer de mama luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) y triple negativo (HR-/HER2-). El grupo HER2+ constituye el 10-15% de los casos de CM y se caracteriza por una alta expresión de HER2 con ausencia de RE y PR, con peor pronóstico en comparación con los tumores luminales y requiriendo fármacos específicos dirigidos contra la proteína HER2/neu⁹.

El desarrollo del CM es un proceso de varios pasos, y un diagnóstico precoz es esencial para un tratamiento exitoso de la enfermedad¹⁰. Sin embargo, a pesar de las opciones de tratamiento personalizadas de la CM que han surgido recientemente (p. ej., terapias endocrinas y de anticuerpos anti-HER2), la CM sigue siendo un reto para los oncólogos. Al igual que la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, estas terapias personalizadas también pueden tener efectos adversos graves y los pacientes pueden desarrollar resistencia a estos agentes, lo que hace que sea un desafío a largo plazo determinar la mejor estrategia^11,12. Por lo tanto, una mejor comprensión de la interacción entre el tumor y su microambiente es esencial y se espera que proporcione nuevas direcciones para el desarrollo de nuevos tratamientos que tengan en cuenta las especificidades de los diferentes subtipos de CM¹³. Se está estudiando una nueva ola de inmunoterapias, como los conjugados anticuerpo-fármaco, las terapias adoptivas de células T, las vacunas y los nuevos anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a HER2 en una amplia población de pacientes con tumores que expresan HER2¹⁴.

El trastuzumab, por ejemplo, representa una modalidad de tratamiento eficaz para el CM HER2+. Como parte de su modo de acción, el trastuzumab media las actividades dependientes del receptor gamma cristalizable de fragmentos (FcγR). Los FcγR se distinguen por su afinidad por el fragmento Fc y la respuesta inmunitaria que inician. La activación de FcγRIIIa (CD16A) en las células asesinas naturales (NK) es crucial para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), mientras que la activación de FcγRIIa (CD32A) y FcγRIIIa en macrófagos induce fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)¹⁵. Los estudios en modelos animales mostraron que los ratones que carecían de receptores FcγRI (CD64) y FcγRIII (CD16) no pudieron iniciar respuestas inmunitarias protectoras contra antígenos específicos del tumor, lo que revela que ADCC es probablemente un mecanismo de acción importante para el mAb Trastuzumab¹⁶.

Dado que las células NK recurren a los Abs unidos a las células tumorales para la destrucción de las células cancerosas por ADCC, la expresión de los receptores Fc es fundamental para un tratamiento eficaz con Trastuzumab¹⁷ (Figura 1). Además, su acción se equilibra eficientemente mediante la estimulación de los receptores activadores e inhibidores, por ejemplo, los receptores similares a las inmunoglobulinas de las células asesinas (KIR)¹⁸.

Figura 1. Mecanismo de ADCC en el contexto de una respuesta antitumoral. El receptor Fcγ de una célula asesina natural (NK) reconoce la región Fc de un anticuerpo, que previamente se había unido a un antígeno de superficie en una célula cancerosa. Esta sinapsis inmunológica conduce a la degranulación de la célula NK, que libera mediadores citotóxicos como las granzimas y la perforina. Estas moléculas contribuyen a la formación de poros en la membrana celular y activan las vías apoptóticas provocando la muerte celular programada de la célula diana (imagen creada con Biorender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El desarrollo de inmunoterapia para HER2+ BC representa un campo en evolución. En este caso, se deben considerar las interacciones entre varios componentes del sistema inmunológico. Además, publicaciones anteriores han probado ampliamente terapias combinadas que involucran todo tipo de terapias tradicionales, inmunes o celulares para identificar combinaciones sinérgicas¹⁹.

Varios modelos 3D de HER2+ BC se han utilizado previamente para el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, Balalaeva et al. utilizaron esferoides SKBR-3 que sobreexpresan HER2 para evaluar la citotoxicidad de la inmunotoxina 4D5scFv-PE40 dirigida a HER2²⁰. En otro estudio, se estableció un sistema de cultivo de HER2+ BC basado en 3D Matrigel, para medir el crecimiento celular en respuesta a Trastuzumab y agentes endocrinos²¹. Estos estudios ponen de manifiesto la importancia de los modelos de esferoides tumorales de células cancerosas con sobreexpresión de HER2 para representar una estrategia eficaz para mejorar clínicamente las respuestas terapéuticas²².

Nuestro grupo identificó previamente Sunitinib, un inhibidor de la tirosina quinasa multidirigido, como un inhibidor de ADCC dependiente de Trastuzumab en células JIMT-1 HER2+ BC en un ensayo de cultivo 2D. El estudio reveló que Sunitinib induce la autofagia y perjudica la función de destrucción de las células NK, regulando a la baja la expresión de HER2 y mejorando la adhesión a la superficie de las células JIMT-1¹⁷.

Aquí establecimos un nuevo modelo ADCC esferoide en 3D (células cancerosas NK.92.CD16 + Trastuzumab + JIMT-1-EGFP) que se utilizará para aplicaciones de cribado de alto rendimiento y, con el fin de validar los hallazgos mencionados anteriormente, se utilizó Sunitinib como compuesto modelo. En primer lugar, generamos células EGFP que expresan JIMT-1¹⁷ y cultivamos esferoides a partir de estas células. La ADCC fue inducida por células NK junto con Trastuzumab, y los esferoides se mantuvieron en cultivo en presencia o ausencia de compuestos de prueba durante 24 h (Figura 2). La cuantificación de ADCC se basa en la detección de la muerte de células cancerosas apoptóticas (tinción de anexina V) mediante un sistema de análisis de alto contenido.

Figura 2. ADCC en un sistema de cocultivo de esferoides 3D. Nuestros entornos experimentales se basan en un sistema de esferoides 3D que puede modelar con mayor precisión el microentorno in vivo en comparación con los modelos 2D. Las células de cáncer de mama JIMT-1 EGFP se sembraron en un fondo cóncavo repelente de células para formar un grupo celular de forma redonda, llamado esferoide. A continuación, se inició ADCC añadiendo NK92. Células asesinas naturales CD16 (relación E:T = 20:1) y un anticuerpo monoclonal anti-HER2, Trastuzumab. El modelo experimental ha demostrado ser eficiente y fácilmente aplicable para la identificación de compuestos de prueba modificadores de ADCC (imagen creada con Biorender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Demostramos que la adquisición de datos de esta manera se puede hacer en tiempo real y es estadísticamente robusta para su uso en el cribado de alto contenido en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Es importante destacar que este modelo permite una validación extendida de un conjunto más grande de compuestos y se puede aplicar a varios ensayos de interés.

Protocolo

1. Configuración del modelo de esferoide de proteína fluorescente mejorada con JIMT-1 (EGFP)

1. Para formar un fondo repelente de células en forma de U, cubra la placa de 96 pocillos con una solución de agarosa-PBS al 0,5 % (30 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente 30-45 min.
2. Lavar las células JIMT-1-EGFP dos veces con 2 mL de PBS estéril (la generación de la línea celular JIMT1-EGFP se informó en una publicación anterior¹⁷). Utilizar matraces de cultivo de tejidos T25 y medios JIMT-1 (medio DMEM/F-12 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 20%, insulina 0,3 U/ml (100 UI/ml, Humulin R) y penicilina-estreptomicina al 1%) para el cultivo celular.
3. Añadir 2 mL de tripsina-EDTA al matraz e incubarlo durante 10 min en una incubadora de CO₂ .
4. Golpee el matraz para comprobar si las células JIMT-1 se desprendieron después del tiempo de incubación.
5. Use 2 ml de medio JIMT-1 para detener la digestión y recoja la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
6. Cuente las células en una cámara de Bürker con azul de tripán al 0,4 % (80 μL del colorante + 20 μL de la suspensión celular) y ajuste el número de células a 20.000 células/mL.
7. Pipetear 100 μL de la suspensión celular (2000 células/pocillo) en cada pocillo de la placa de 96 pocillos (pre-recubierto con solución de agarosa-PBS al 0,5% como se indica en 1.1).
8. Deje que las células se agrupen durante un tiempo de incubación de 3 días a 37 °C en una incubadora de CO₂ .
9. Compruebe regularmente el tamaño y la forma de los esferoides con un microscopio invertido.

2. Recubrimiento de la placa HCS

NOTA: Para evitar la adhesión de esferoides JIMT-1-EGFP a la superficie de vidrio de la placa, es crucial recubrir la placa de cribado de alto contenido (HCS) (de lo contrario, no sería posible realizar un análisis de alto contenido).

1. El día 3 después de la inducción de esferoides, recubra la placa de cribado de alto contenido de 96 pocillos con Pluronic-F127 (0,5% en DMSO, 50 μL/pocillo) e incube la placa durante 45 min a temperatura ambiente.
2. Aspire la solución de recubrimiento y lave los pocillos dos veces con medio libre de suero DMEM/F-12 (100 μL/pocillo).

3. Transferencia de esferoides a la placa HCS

1. Con una pipeta de 1 ml, transfiera los esferoides por triplicado a la placa HCS de 96 pocillos con fondo de vidrio.

4. Pretratamiento de esferoides JIMT-1 EGFP con compuestos problema

1. Añadir el compuesto de prueba (p. ej., Sunitinib diluido en DMSO a una concentración de 40 μM) pipeteando 10 μL/pocillo y añadir 10 μL de medio JIMT-1 fresco a los pocillos de control (CTL).
2. Incubar la placa durante 1 h en una incubadora de_CO2 a 37 °C.

5. Inducción de ADCC mediante la adición de las células efectoras

NOTA: Las células CD16.176V.NK92 (en lo sucesivo denominadas células NK) se cultivaron en α-MEM suplementadas con 20% de FBS, 1% de MEM-NEAA, 1% de Na-piruvato, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 100 UI/ml de IL-2.

1. Recoja las células NK del matraz en un tubo de 15 ml. Cuente las células con azul de tripano (80 μL del colorante + 20 μL de la suspensión celular) y ajuste la densidad celular a una relación efector-objetivo (E:T) de 20:1 (40.000 células NK/pocillo).
2. Tiñir las células NK con 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL en 1 mL de medio α-MEM NK) y colocarlas en una incubadora de CO₂ a 37 °C durante 1 h.
3. Centrifugar las células NK a 150 x g durante 3 min a temperatura ambiente dos veces para lavar el exceso del colorante con 1 mL de medio α-MEM.
4. Vuelva a suspender el gránulo de células NK en 1 ml de medio JIMT-1 fresco.
5. Agregue las células NK teñidas junto con el anticuerpo anti-HER2 (Ab) (trastuzumab, disuelto en H₂O destilado estéril) a los esferoides JIMT-1 diana pipeteando 55 μL/pocillo de células NK teñidas con CTB y 55 μL/pocillo de 10 μg/ml de Ab en medio JIMT-1 (el volumen total de tratamiento añadido para el ADCC es de 110 μL/pocillo y la concentración final de Sunitinib es de 20 μM).
   NOTA: Para la selección de la concentración de Ab y la relación E:T, nos basamos en nuestra publicación anterior¹⁷. Se realizaron experimentos preliminares con diferentes relaciones E:T y concentraciones de Trastuzumab para evaluar cuál era el más eficaz en la inducción de ADCC en esferoides (Figura suplementaria S1).
6. Agregue 110 μL/pocillo de medio JIMT-1 fresco a los pocillos de control (CTL).
7. Incubar la placa durante 24 h en una incubadora de CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Dado que se sabe que las células NK92 ejercen funciones citotóxicas no específicas, para el control se utilizan células JIMT-1 coincubadas con células NK solas y con un control de isotipo o un Ab F(ab')₂. En este caso, se utilizó F(ab')2-trastuzumab (TR-F(ab')₂) como CTL negativo. El fragmento TR-F(ab')₂ se preparó según lo informado por Tóth et ^al.19 y se agregó en el mismo volumen que Trastuzumab junto con células NK como se describe en 5.5. La concentración se ajustó a 6,6 μg/mL correspondiente a una concentración equimolar con Trastuzumab²³.

6. Tinción de anexina V-647 de esferoides

1. Para medir la muerte celular apoptótica, tiñir los esferoides con el conjugado de anexina V-Alexa Fluor 647 durante 1 h en medio JIMT-1 (1:100) pipeteando 50 μL/pocillo.

7. Imágenes

NOTA: La imagen de la placa se obtiene a las 24 h después de la adición de las células efectoras NK a las células diana. Para la obtención de imágenes, se utilizan un analizador de alto contenido y un software de análisis de imágenes.

1. Seleccione el tipo de microplaca de la lista de placas mediante la opción Tipo de placa . Utilice una placa de cribado de alto contenido (HCS) de 96 pocillos.
2. Seleccione Enfoque automático de dos picos, ya que el ensayo se lleva a cabo en placas con objetivo de 10x con apertura numérica (NA) de 0,3, utilizando las opciones Enfoque automático y Objetivo , respectivamente. Elija el modo confocal con la opción Modo de opción y aplique la agrupación 2 con la opción Agrupación .
3. Para obtener imágenes de esferoides, seleccione los canales apropiados mediante la opción Selección de canal . Para detectar las células JIMT-1 transducidas por EGFP, elija EGFP (tiempo de integración de 200 ms, potencia del láser del 50%, altura de la pila de 2,0 μm; por ejemplo: 488 nm em: 500-550 nm), y para detectar células apoptóticas utilice Alexa 647 (tiempo de integración de 100 ms, potencia del láser del 50%, altura de la pila de 10,0 μm; por ejemplo: 640 nm em: 650-760 nm). Para visualizar las células NK dentro de los esferoides, elija el siguiente canal: DAPI (tiempo de integración 100 ms, potencia láser 50%, altura de la pila 2,0 μm; ej: 405 nm em: 435-480 nm).
4. En la opción Selección de diseño , seleccione pilas Z, ya que las células de los esferoides tienden a estar en diferentes planos focales del microscopio. 10 planos (con una distancia de 10 μm) son suficientes para cubrir toda la región esferoide. Establezca los valores del primer plano y del último plano en 0 μm y 90 μm, respectivamente.
   NOTA: Antes de iniciar la medición, se pueden tomar imágenes de muestra con la función de instantánea para verificar la configuración correcta.
5. Establezca el número de pozos y campos para la creación de imágenes mediante la opción Definir diseño .

8. Análisis de alto contenido (HCA)

NOTA: Analice las imágenes con el software Harmony o exporte las imágenes para analizarlas con un software de terceros preferido. Para el análisis de la eficiencia de ADCC, se mide la intensidad de fluorescencia de la anexina V 647. Las células diana eliminadas por ADCC aparecen en el área periférica de los esferoides. Por lo tanto, las células positivas para la anexina V se miden en este "anillo" esferoide. Con el fin de validar este método, se realizaron análisis con diferentes parámetros para evaluar cuál era el más fiable y el que producía mejores resultados (Figura complementaria S2). En el vídeo se muestra un pocillo ADCC para demostrar paso a paso el proceso de análisis de imágenes.

1. Identifique los esferoides por la fluorescencia EGFP de las células JIMT-1 utilizando la opción Buscar regiones de textura y fíltrelos por tamaño (> 25.000 μm²).
2. Elimine los objetos de borde mediante la opción Seleccionar población .
3. Dado que las células positivas a la anexina V (apoptóticas) aparecen en la periferia de los esferoides, mida la intensidad de la anexina en este "anillo" apoptótico, seleccionado por la opción Seleccionar región (borde exterior -90%) para determinar la muerte celular apoptótica.
4. Exprese los valores de intensidad de la anexina V como intensidad media.

Resultados

Se generaron células JIMT-1 que expresan EGFP y se cultivaron esferoides a partir de estas células. El sunitinib se utilizó como compuesto de prueba, ya que anteriormente se había demostrado que afectaba al curso de ADCC¹⁷. Los esferoides se dejaron agrupar durante 72 h. En el día 3, se añadieron 10 μg/ml de trastuzumab (o equimolar 6,6 μg/mL de TR-F(ab')₂¹⁹) y células NK (20:1) a los esferoides en presencia o ausencia de 20 μM de sunitinib (1 h de pretratamiento), durante un tiempo total de 24 h. Se utilizaron JIMT-1 solo y JIMT-1 coincubado con células NK (20:1) como CTL. Los esferoides se tiñeron con anexina V 647 durante 1 h para detectar la muerte celular apoptótica y A continuación, se obtuvieron imágenes con un analizador de alto contenido.

Como lo indica la tinción con anexina V, la adición de células NK junto con trastuzumab a las células JIMT-1 causó muerte celular en los esferoides tumorales. Las células positivas para anexina (apoptóticas) emergieron en la zona periférica de los esferoides, como se puede ver en la Figura 3A. Por otro lado, la adición de células NK por sí sola no dio lugar a la apoptosis de las células tumorales. Para distinguir entre la capacidad de Trastuzumab para reclutar ADCC y su efecto biológico directo, se utilizó TR-F(ab')₂ que carece de capacidad funcional de unión a FcR como control negativo de Trastuzumab. Dado que TR-F(ab')₂ demostró ser ineficaz en este modelo (Figura 3B), es probable que el efecto esté mediado por ADCC. Además, el pretratamiento con Sunitinib redujo la tinción de anexina V en los esferoides, confirmando la resistencia a ADCC inducida por Sunitinib y revelando la prevención de la muerte celular apoptótica en esferoides JIMT-1 co-incubados con células NK y Trastuzumab.

Figura 3. Detección de compuestos efectores ADCC en un modelo esferoide 3D. Los esferoides tumorales se generaron con células JIMT-1-EGFP. Después de un tiempo de incubación de 3 días, los esferoides se transfirieron a una placa HCS, previamente recubierta con Pluronic F-127 para evitar la adhesión celular. Al día siguiente, 10 μg/mL de Trastuzumab (TR) (o equimolar 6,6 μg/mL de TR-F(ab')₂ como CTL negativo) y NK92. Se añadieron células CD16 (previamente teñidas con Cell Tracker Blue) a los pocillos (relación E:T de 20:1), en ausencia o presencia de 20 μM de Sunitinib (SUN). Se utilizaron esferoides JIMT-1 solos y esferoides JIMT-1 co-incubados con células NK (20:1) como CTL. (A) Después de un tiempo de incubación de 24 h, se utilizó anexina V 647 (color rojo) para teñir los esferoides durante 1 h para visualizar las células apoptóticas. (B) Se tomaron imágenes de 3 esferoides/condición y se analizaron para determinar la intensidad de fluorescencia de la anexina V 647 en el área periférica de los esferoides (región del anillo). El histograma muestra 4 experimentos independientes (medias±SEM). Los datos se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba post-hoc de Dunn (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: no significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estos datos confirman que el sunitinib inhibe el ADCC. Se espera que los compuestos potenciadores de ADCC se identifiquen de manera similar. En resumen, nuestro ensayo HCS puede ser adecuado para la identificación de compuestos que afectan a ADCC.

Figura complementaria S1. Optimización de la relación E:T y de la concentración de Trastuzumab. Se utilizaron células JIMT-1-EGFP para generar esferoides. En el día 3, los esferoides se transfirieron a una placa HCS y se añadieron células NK en diferentes relaciones E:T (20:1, 40:1 y 60:1) con 10, 20 y 50 μg/mL de Trastuzumab (TR) para ver cuál era el tratamiento más eficaz que podía inducir la muerte celular en los esferoides. El control (JIMT-1-EGFP) se trató con medios de cultivo celular JIMT-1. (A) Después de 24 h, las células se tiñeron con anexina V 647 (color rojo) durante 1 h y se midió la muerte celular apoptótica con HCA. Los histogramas muestran 3 experimentos independientes (medias±SEM). Las columnas representan la intensidad de la anexina V 647 alrededor de los esferoides JIMT-1. (B) Se analizaron imágenes de 3 esferoides/condición para la intensidad de la anexina V 647 de la región del anillo. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc de Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: no significativo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S2. Evaluación de la apoptosis de las células JIMT-1 en los esferoides. Se utilizaron células JIMT-1-EGFP para generar esferoides. En el día 3, los esferoides se transfirieron a una placa HCS y se trataron previamente con 20 μM de Sunitinib (SUN) durante 1 h, luego se agregaron células NK en una relación E:T de 20:1 con 10 μg/ml de trastuzumab. Después de 24 h, las células se tiñeron con anexina V 647 durante 1 h y la muerte celular apoptótica se midió con HCA. Se analizaron imágenes de 3 esferoides/condición para la intensidad de Anexina V 647 (control: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 células NK + 10 μg/ml de trastuzumab, ADCC+SUN: 20 μM de sunitinib + 20:1 células NK + 10 μg/ml de trastuzumab). Las columnas representan la intensidad de la anexina V 647 alrededor de los esferoides JIMT-1 (anillo) (A), en todo el esferoide (B) y en todo el pocillo (C). Los histogramas muestran 3 experimentos independientes (medias±SEM). Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc de Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: no significativo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

A pesar de las mejoras significativas en el tratamiento de la CM en las últimas décadas, los pacientes todavía desarrollan regularmente resistencia a la medicación o experimentan efectos secundarios negativos²⁴. La alta morbilidad y mortalidad ligada a la CM exige una investigación continua de los mecanismos moleculares subyacentes, así como plataformas de cribado robustas para identificar nuevas moléculas procesables para el desarrollo terapéutico²⁵. Estas estrategias requieren ensayos traslacionales basados en cultivos celulares. Los sistemas de cultivo de tumores en 3D, como los esferoides y los organoides tumorales, han surgido recientemente como modelos de bajo costo y fáciles de implementar que representan aspectos clave de la fisiopatología tumoral más de cerca que los cultivos convencionales de monocapa. Una de estas características es la interacción coordinada espacialmente entre varias células inmunitarias asociadas a tumores y células cancerosas. Esto hace que los modelos de cocultivo 3D sean herramientas superiores para el cribado de fármacos orientados a moduladores que actúan sobre las células inmunitarias para tratar neoplasias malignas²⁶.

En este trabajo, hemos introducido un nuevo modelo esferoide para ADCC dependiente de trastuzumab mediada por células NK contra células de carcinoma de mama JIMT-1 y hemos descrito un flujo de trabajo automatizado de imágenes y análisis para la evaluación de la destrucción de células cancerosas mediada por células NK. El procedimiento se implementó para un generador de imágenes de alto contenido y un software de análisis de imágenes que permite el monitoreo de la capacidad relevante para la enfermedad de las células NK para inducir la apoptosis de las células cancerosas. El inhibidor multidirigido de la tirosina quinasa Sunitinib como un compuesto que induce resistencia a ADCC dependiente de trastuzumab en células JIMT-1 en ensayos de cultivo celular 2D se identificó previamente. El sunitinib altera la función de destrucción de las células NK e induce la autofagia, la regulación a la baja de la expresión de HER2 y mejora la adherencia de las células JIMT-1¹⁷. Con el fin de validar nuestra línea de análisis de esferoides para la identificación de compuestos, probamos Sunitinib como un compuesto modelo y estamos demostrando que puede obstaculizar significativamente la capacidad de las células NK para matar los esferoides de las células cancerosas reproduciendo el efecto que demostró en monocapa.

Nuestro método es simple, y comprende el crecimiento de esferoides en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos recubiertas de agarosa, una transferencia única de los esferoides formados a una microplaca con fondo de vidrio adecuada para aplicaciones de HCS y HCA, la adición de compuestos de prueba y las células NK teñidas por separado activadas para matar mediante la administración de trastuzumab, una tinción de muerte celular de un solo paso y el análisis microscópico. No se aplican manipulaciones severas a los pocillos después del comienzo del cocultivo de los dos tipos de células y el tratamiento farmacológico para evitar comprometer la integridad de los esferoides. El ensayo solo tarda 4 días en realizarse. Recubrir la parte inferior de las placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con agarosa de bajo punto de fusión al 1 % como parte del procedimiento es una alternativa barata al uso de placas de fijación ultra bajas para evitar que las células JIMT-1 se adhieran a la superficie de la placa y promover la organización espontánea de las células tumorales en esferoides. Dado que la captura de imágenes no es posible a través de la almohadilla de agarosa y la superficie de plástico en forma de U, los esferoides debían transferirse a la placa de imágenes. Crucial fue la pasivación de la superficie de vidrio de la placa HCS con el tensioactivo bioinerte, Pluronic-F127 antes de la transferencia de esferoides. Sin este paso, los esferoides se esparcen por el fondo de los pozos, lo que dificulta la obtención de imágenes y el análisis.

Se utilizó una línea celular tumoral humana que expresa EGFP de forma estable para la formación de esferoides¹⁷. El marcador codificado genéticamente ofrece fluorescencia sostenida durante todo el protocolo en lugar de tinciones celulares. El análisis de textura no supervisado de la señal EGFP proporciona la base para reconocer el núcleo compacto de los esferoides, que comprende todo el esferoide sin inducción de muerte celular. Cuando se añadían células NK y se inducía ADCC, la marcada desintegración de los contornos a veces suponía un reto para el algoritmo de análisis de imágenes a la hora de delinear el contorno del esferoide. Debido a que las células positivas para anexina V se encontraron principalmente en la periferia de los esferoides, este problema se sorteó mediante la evaluación de la muerte celular en una región anular periférica generada por el módulo de segmentación de imágenes incorporado del software mediante la extensión del núcleo esferoide bien definido. El factor de expansión que define el límite exterior de esta área se eligió para abarcar la penumbra de células moribundas, trituradas y dispersas en todos los casos después de curar visualmente cientos de imágenes esferoides. La determinación de la fluorescencia total del área del anillo apoptótico en las proyecciones máximas de las imágenes de la pila Z produjo errores experimentales más bajos y un efecto ADCC más pronunciado que la medición de toda el área del esferoide o de toda el área del pozo (Figura suplementaria S2). Se eligieron etiquetas fluorescentes para marcar las células BC (EGFP) y detectar la muerte celular (Alexa 647) para evitar la necesidad de separación de canales. Se optó por una lectura de punto final basada en el marcaje fluorescente de la fosfatidilserina expuesta, un marcador apoptótico, en lugar de monitorizar la disminución de la fluorescencia del EGFP para determinar la viabilidad de los esferoides a lo largo del tiempo, lo que podría ser otra opción. La tinción con anexina permitió una identificación más precisa y sensible de la muerte celular. En principio, es posible mejorar el enfoque actual de tinción unidimensional complementándolo con marcadores de muerte celular adicionales y más precisos que puedan identificar la modalidad de muerte celular (por ejemplo, sustratos de caspasas fluorescentes) y el tipo de célula perecida.

Este método se puede modificar con cambios mínimos para estudiar otros tipos de células inmunitarias efectoras (macrófagos, células T y células inmunitarias que expresan receptores de antígenos quiméricos [CAR]) y moléculas activadoras (p. ej., citocinas, interleucinas). Con el objetivo de ser simples, robustos y cortos tiempos de procesamiento, no hemos agotado las posibilidades que HCA puede ofrecer para este ensayo. Los protocolos de imagen y análisis son susceptibles de la adición de más marcadores fluorescentes. Este ensayo es adaptable para estudiar esferoides más complejos mediante la adición de diferentes tipos de células y el uso de sondas fluorescentes multiplexadas para distinguir esos tipos celulares y marcadores fluorescentes específicos para vincularlos a eventos celulares en curso ^4,5. El protocolo se puede adaptar a cualquier generador de imágenes HC y las imágenes se pueden analizar con cualquier software de análisis de imágenes que incorpore un módulo de análisis de texturas.

Un aspecto clave de la importancia de este protocolo es el uso de esferoides. Por lo tanto, hay que tener en cuenta una serie de parámetros. Se sabe que las células en cultivo 3D muestran una respuesta atenuada a los compuestos en comparación con las células cultivadas en monocapas ^21,22. El uso de cultivos celulares 2D no permite predecir el rango efectivo de concentraciones de un agente probado en todo el organismo. Al configurar nuestro modelo 3D, probamos concentraciones de compuestos y relaciones E:T más altas que las informadas en 2D. Por ejemplo, el protocolo se optimizó aumentando la relación E:T de 2:1 utilizada en nuestro ensayo ADCC 2D¹⁷, a 20:1 para los esferoides del cáncer. La razón detrás de esto podría ser que los medicamentos no pudieron penetrar de manera efectiva en el núcleo de los esferoides y afectaron principalmente a las células de las capas externas. Por otro lado, el aumento de la concentración de trastuzumab no mejoró aún más la respuesta de ADCC (Figura suplementaria S1). Esta selección puede diferir entre las líneas celulares y el objetivo. Por lo tanto, sería interesante probar este protocolo en otras líneas celulares, por ejemplo, una línea celular BC no HER2, teniendo en cuenta que el nivel de expresión de HER2 es un determinante importante de la respuesta ADCC²⁰.

En resumen, nuestro nuevo método representa una plataforma rápida y robusta para analizar el efecto de los compuestos en un modelo 3D de cáncer inmunitario con el potencial de ser utilizado para el cribado de fármacos de alto rendimiento. Esto pone de manifiesto la relevancia del uso de esferoides HER2+ BC y NK92. CD16 para mejorar aún más la comprensión de los mecanismos moleculares de Trastuzumab, proporcionando así una oportunidad para anticipar la efectividad de ADCC dependiente de Trastuzumab en el potencial terapéutico in vivo²⁷. La búsqueda de nuevos inmunomoduladores antitumorales puede beneficiarse enormemente de este ensayo. El método puede extenderse a pruebas de quimiosensibilidad personalizadas de cultivos de células tumorales derivadas de pacientes. Hemos demostrado que los cocultivos 2D tradicionales utilizados en las pruebas de destrucción de células inmunitarias y ADCC se pueden convertir en ensayos de esferoides 3D, lo que podría aumentar su relevancia traslacional.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fondo de vidrio de 96 pocillos Portador de células Microplacas Ultra	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	LLC	para mediciones de esferoides
Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos	TPP	92096	para siembra de células
α-MEM	medio Sigma	M8042	en medio NK
Agarosa	Sigma	A9539	para siembra de esferoides
Anexina V-Alexa Fluo 647 conjugado	Invitrogen-ThermoFisher Scientific	A23204	para la medición de la apoptosis con células HCS
CD16.176 V.NK-92	Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA en nombre de Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)	ATCC CRL-2407	para cultivo celular
Cell Tracker Blue	Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)	C2110	para la tinción de células NK
DMEM/ F-12 medio	Sigma	D8437	en medio JIMT1-EGFP
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D8418	para el recubrimiento de la placa HCS antes de transferir los esferoides
Suero fetal bovino (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1-EGFP y medio NK
Glutamina	Gibco	35,050– 061	en NK medio
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU		para análisis estadístico
Harmony software	PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU		para HCA
IL-2	Proleukin, Novartis Hungá ria Kft., Budapest, Hungría	PHC0026	en medio NK
Insulina (Humulin R)	Eli Lilly	HI0219	Medio JIMT-1-EGFP
JIMT-1 células			mama para cultivo celular
MEM Aminoácidos no esenciales (MEM-NEAA)	Gibco	11,140– 050	en medio NK
Na-piruvato	Lonza	BE13-115E	en medio NK
Opera Phenix Equipo de análisis de alto contenido	PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU	HH14001000	para HCA
PBS (solución salina tamponada con posphate)	Lonza	BE17-517Q	para el lavado de las células
Penicilina-Estreptomicina	Biosera	LM-A4118	JIMT-1-EGFP y medio NK
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP	Invitrogen, (Prof. Jó zsef Tzsé r, Universidad de Debrecen)		para la línea celular JIMT-1-EGFP
Pluronic-F127	Sigma	P2443	para el recubrimiento de la placa HCS antes de transferir los esferoides
Sunitinib malato	SigmaAldrich	PZ0012	para tratamientos
Trastuzumab Ab (anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2)	Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungría	NDC-63459-303-43	para tratamientos
Trastuzumab-F(ab')2	Regalo del Prof. Gyö rgy Vereb y Á RP&AAUTE; d Szö r	Departamento de Biofísica y Biología Celular, Universidad de Debrecen	para tratamientos
Solución de azul de tripano al 0,4%	Sigma	T8154	para el recuento de células
Tripsina-EDTA 1X en PBS	Biosera	LM-T1706	para el desprendimiento de células