El test de evitación activa de lugares (APA), una tarea de aprendizaje espacial eficaz, versátil y repetible para ratones

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la prueba de evitación activa de lugares, un paradigma de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo diseñado para roedores. La alteración de los parámetros clave permite volver a realizar pruebas a los animales antes y después de los tratamientos o con el tiempo.

Abstract

El aprendizaje espacial dependiente del hipocampo en roedores se ha probado utilizando una variedad de métodos. Entre ellas se encuentran las tareas de laberinto acuático de Morris (MWM), laberinto en Y y localización de objetos novedosos (NOL). Más recientemente, la tarea de evitación activa del lugar (APA, por sus siglas en inglés) se ha desarrollado como una alternativa a estos enfoques más tradicionales. En la tarea APA, los ratones deben usar señales espaciales colocadas alrededor de una arena giratoria para evitar una zona de choque estacionaria. Debido a los múltiples parámetros que se pueden ajustar, se ha demostrado que la tarea APA es un enfoque muy versátil. Se presta para ser utilizado longitudinal y repetidamente para la misma cohorte de ratones. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo con éxito la tarea APA. También destacamos los enfoques alternativos de APA que se pueden utilizar para examinar diferentes componentes del aprendizaje espacial. Describimos los procesos de recolección y análisis de datos. Se discuten los pasos críticos durante la tarea APA para aumentar la probabilidad de realizar con éxito la prueba. La tarea APA tiene varias ventajas sobre las pruebas de navegación espacial más tradicionales. Es apropiado para usar con ratones envejecidos o aquellos con fenotipos de enfermedades como la enfermedad de Alzheimer. La complejidad de la tarea se puede modificar fácilmente, lo que permite probar una amplia gama de cepas de ratón. Además, la tarea APA es adecuada para probar animales que han sido sometidos a cirugía o intervenciones experimentales que pueden haber afectado la función motora o neural, como un accidente cerebrovascular o una lesión cerebral traumática.

Introduction

La evitación activa del lugar (APA) es una herramienta eficaz para evaluar el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo en roedores 1,2,3,4. Durante la tarea APA, el animal se coloca en una arena giratoria y se requiere que use señales visuales para orientarse y evitar una zona de choque aversiva⁵. La rotación de la arena asegura que el ratón no pueda usar un enfoque idiotético para la navegación, ni se pueden usar marcas de olor, ya que estas señales giran en la plataforma mientras que la zona de choque permanece estacionaria⁵. La alteración de la velocidad y la dirección de la arena, así como la ubicación de la zona de choque y las señales visuales, permite volver a probar a los ratones varias veces^6,7,8. El APA ofrece varias ventajas distintivas en comparación con el laberinto acuático de Morris (MWM), una de las pruebas de aprendizaje espacial más utilizadas. Es importante destacar que los ratones tienen aversión a nadar y encuentran la tarea de MWM extremadamente estresante⁹. Además, se ha informado que ratones envejecidos flotan durante la tarea¹⁰ de MWM, lo que la hace inadecuada como tarea de aprendizaje espacial en muchos casos. Además, como la tarea de MWM requiere una plataforma oculta y sumergida para que los ratones la localicen durante las pruebas. Esto requiere que el agua sea opaca, lo que generalmente se logra mediante la adición de pintura blanca. El seguimiento y el análisis de los animales durante las tareas de comportamiento requiere un contraste suficiente entre el sujeto y el entorno, excluyendo ciertas cepas de ratones, como el suizo o el BALB/c, de ser probadas en el MWM. En la tarea APA, este problema se elude mediante la adición de plástico negro debajo de la rejilla.

Se han diseñado múltiples paradigmas APA para probar el aprendizaje espacial, demostrando su utilidad como una herramienta conductual efectiva. Por ejemplo, la adquisición, retención y consolidación del aprendizaje espacial se logra típicamente mediante pruebas diarias de animales que pueden oscilar entre 3 y 5 días 6,7,11,12. La memoria y el aprendizaje se cuantifican comparando el número de choques recibidos cada día de adquisición. El tiempo hasta la primera entrada y el tiempo máximo evitando la zona de choque también son parámetros importantes que se pueden utilizar para determinar los cambios en la capacidad de aprendizaje durante la tarea. Alternativamente, la memoria de trabajo espacial se puede probar mediante la realización de una sola sesión APA de 30 minutos ^2,13 donde el aprendizaje espacial se mide como cambios dentro de la sesión comparando el rendimiento, como el número de choque, en intervalos de 5 minutos.

En este artículo, describimos la tarea APA y destacamos las características clave que deben tenerse en cuenta al realizar esta prueba de aprendizaje espacial.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland bajo las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia (número de aprobación: QBI/189/15).

1. Configuración de la sala APA

NOTA: El aparato APA comprende una arena elevada con un piso de rejilla metálica cerrado por un límite circular transparente de 32 cm de altura. Las barras metálicas están espaciadas uniformemente (0,5 cm entre sí) y tienen un diámetro de 0,3 cm.

1. Asegúrese de que el aparato APA esté dentro del marco de la cámara montado en el techo. Rastree al ratón utilizando el software de seguimiento de animales disponible en el mercado.
2. La arena APA generalmente gira a una velocidad de 1 rpm, y se establece una zona de choque estacionaria predesignada de 60 ° dentro de la arena giratoria. Cuando el ratón entre en la zona de choque, administre un leve golpe de pie de 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
3. Asegúrese de que la ubicación de la zona de choque permanezca constante durante la prueba y se ajuste electrónicamente dentro de la configuración experimental. La arena giratoria lleva al ratón a la zona de choque a menos que el ratón se mueva activamente para evitarlo.
4. Coloque cuatro señales visuales novedosas en cuatro paredes de la habitación diferentes a la misma altura que la plataforma giratoria, generalmente a 30-50 cm de distancia de la arena. Asegúrese de que las señales sean de colores neutros, como símbolos o formas en blanco y negro impresas en papel A3 y laminadas para facilitar la limpieza (Figura 1A).
5. Asegúrese de que la intensidad de la luz de la habitación esté entre 30 y 70 lux. El aumento de la intensidad de la luz induce un comportamiento similar a la ansiedad y reduce la exploración.
6. Antes de comenzar, abra el programa Tracker y seleccione la tarea APA.
7. En Opciones de Tracker 2D, seleccione la pestaña Experimento . Aquí, asegúrese de que esté seleccionada la opción Evitar lugar- Un fotograma- Solo posición . Esto permitirá configurar los parámetros requeridos. Guarde el archivo de configuración y ajústelo según sea necesario.
8. En la pestaña Experimento , establezca la duración del experimento en el cuadro Tiempo del experimento . La duración típica de un experimento es de 600 s o 10 min.
9. Asegúrese de que la opción Habilitar temporizador esté seleccionada. Cambie los parámetros de choque en la región del temporizador como se ha comentado anteriormente.
10. Introduzca los detalles experimentales comunes en el espacio proporcionado en la región Marco de habitación de la pestaña Experimento . Por ejemplo, asegúrese de que el nombre del archivo de salida predeterminado se rellene con la fecha, un identificador experimental simple y el día de la prueba. Termine el nombre con un guión bajo "_" para permitir la adición de un ID de mouse único durante el experimento.
11. En la región Room Frame también se encuentra la pestaña Destinos . Haga clic en el botón Editar para proporcionar la capacidad de asegurarse de que toda la arena esté incluida en la región de interés. A continuación, seleccione Arco para proporcionar los parámetros ajustables para el tamaño y la ubicación de la zona objetivo de choque (Figura 1B).
12. Abra la pestaña Seguimiento para ajustar los parámetros y garantizar el seguimiento exitoso de los ratones. El cuadro de contraste tiene opciones Oscuro o Claro para permitir ratones oscuros (por ejemplo, C57Bl/6) o claros (por ejemplo, BALB/c). Esto crea un contraste efectivo entre el fondo y los ratones. Cuando utilice cepas de ratones albinos, coloque un trozo de plástico negro debajo de la arena para permitir que se logre este contraste (Figura 2).
13. Establezca el tamaño de los ratones y los rangos de área en esta región. Configure estos parámetros para reconocer eficazmente el mouse cuando esté en la arena. Alternativamente, configúrelos después de presionar el botón Desde el calibrador .
14. Seleccione el botón Desde el calibrador para asegurarse de que la arena esté completamente en la máscara de la región de interés.
    1. Inicie la arena en esta pestaña para asegurarse de que cuando la arena gire, la arena permanezca en la máscara. Esta pestaña también es fundamental para seleccionar el umbral de contraste adecuado. Mueva la línea roja en el panel Umbral para ajustar el umbral de contraste.
       NOTA: La Figura 3A muestra una selección de umbral óptima, como lo demuestra una región naranja sólida y una "X" azul donde se encuentra el mouse. En la Figura 3B se muestra un umbral deficiente y solo muestra naranja moteado y sin "X".
15. Use la pestaña Dispositivos y establezca la dirección de rotación y la velocidad de la arena con el botón de velocidad. Seleccione velocidades positivas y negativas, que representan las rotaciones en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj. Establezca la intensidad del choque en la sección Fuente de corriente . La configuración más común para los ratones es una rotación de 1 rpm y un choque de 0,5 mA.
16. Modifique cómo o cuándo administrar los choques dentro de la pestaña Fuente actual .
    1. Asegúrese de que el modo actual esté seleccionado en Dependiente de la pista. Esto proporcionará una descarga eléctrica cuando el mouse se mueva a la zona de choque.
    2. Seleccione Tiempo para dar descargas en un intervalo de tiempo establecido por el usuario. Utilice las pistas grabadas anteriormente para electrocutar un ratón seleccionando Desde archivo. Esto es para proporcionar un ratón de control con yugo sometido a un número idéntico de choques con la misma duración e intensidad, independientemente del aprendizaje espacial.
       NOTA: Las pestañas Salida de archivo y Ventana permiten guardar archivos de datos y video en un directorio específico. El botón De imagen dentro de la pestaña Salida de archivo también permite seleccionar la región de interés para capturar toda la arena.
17. Retírate detrás de la cortina y comienza el juicio. La presencia del experimentador cerca de la arena y cualquier ruido innecesario pueden afectar el rendimiento de los animales.
18. Asegúrese de que cualquier ruido y olor estén limitados durante la prueba, lo que puede proporcionar al mouse otra pista, afectando su rendimiento. Ejemplos para minimizar esto incluyen garantizar un contenedor de residuos clínicos cerrado, usar habitaciones alejadas de los espacios de laboratorio ruidosos y limpiar a fondo el equipo entre ratones. Los investigadores pueden considerar el uso del generador de ruido blanco para enmascarar ruidos externos no relacionados.
19. Deje que la ropa de cama de la jaula doméstica permanezca igual durante todo el período de prueba de comportamiento, ya que esto puede proporcionar una nueva estimulación y afectar el comportamiento.
20. Para evitar variaciones diurnas, realice pruebas a una hora constante todos los días.

2. Habituación al manejo del experimentador

1. Manipule cada ratón diariamente durante 30 s a 1 min durante al menos 2-3 días antes de la prueba. El manejo de los animales reduce significativamente el estrés y el comportamiento relacionado con la ansiedad durante las pruebas.
2. Use la misma bata de laboratorio y evite usar desodorantes, colonias o perfumes fuertes durante la habituación y las pruebas.

3. Habituación a la arena APA (1 día)

1. Lleve el ratón a la antesala o a la sala de pruebas para habituarlo. Deja que el ratón se habitúe durante un mínimo de 30 min. Establezca la intensidad de la luz en la antesala o en la sala de pruebas antes de que los ratones se acostumbren.
2. Configura el software Tracker.
   1. Cree una carpeta específica del experimento. Dependiendo del paradigma experimental, tenga carpetas separadas para cada día o prueba. Configure las configuraciones de experimentos como se ha descrito anteriormente y guarde estas configuraciones para usarlas en el futuro.
   2. Antes de iniciar una prueba, abra la configuración guardada haciendo clic en la pestaña Archivo , luego haga clic en el símbolo Guardar , agregue un ID de mouse único en la ventana recién abierta y ejecute la prueba presionando la pestaña Reproducir .
3. Habitúe el ratón al aparato APA exponiéndolo a la arena giratoria durante 5 minutos sin producir descargas.
4. Retira al ratón de la jaula de casa levantándolo de la base de la cola y colocándolo suavemente sobre la mano enguantada. Transporta el ratón al aparato APA y colócalo lejos de la zona de choque, mirando hacia la pared.
5. Retírate detrás de la cortina y comienza el juicio.
6. Al final de la prueba, retire el mouse y regrese a la jaula de inicio.
7. Recoja toda la orina y los excrementos, y limpie la rejilla a fondo con etanol al 80% (v/v).
8. Repita los pasos 3.4-3.7 para todos los ratones.

4. Formación en adquisición mediante APA (1-6 días)

1. Ajuste la iluminación de la habitación a las mismas condiciones que en el día de habituación.
2. Lleve el ratón a la antesala o a la sala de pruebas y déjelo habituar durante un mínimo de 30 minutos.
3. Configure el software de seguimiento como se describe anteriormente.
4. Establezca la duración de la prueba.
5. Asegúrese de que la fuente de corriente esté encendida y configurada (es decir, 0,5 mA).
6. Coloque el mouse en la arena lejos de la zona de choque y mirando hacia la pared.
7. Retírate detrás de la cortina y comienza la prueba pulsando el botón Reproducir . Supervise el mouse en la pantalla de la computadora e intervenga si es necesario. Por ejemplo, el ratón no recibe descargas o parece demasiado estresado, como lo demuestran los saltos o vocalizaciones excesivos.
8. Al final de la prueba, retire el mouse y regrese a la jaula de inicio.
   NOTA: Asegúrese de que los ratones reciban y reaccionen a las descargas. Los ratones responden al choque retrocediendo y vocalizando. Si este no es el caso, es posible que no estén recibiendo la descarga. Esto podría deberse a la formación de excrementos en la red o a un seguimiento inadecuado. Por lo tanto, limpiar la cuadrícula después de cada prueba y optimizar el seguimiento del mouse, como se discutió anteriormente, es esencial.

5. Capacitación en adquisición inversa (opcional, 1-6 días)

1. En la tarea de inversión, vuelva a colocar la zona de choque en una nueva ubicación, generalmente 180° desde la posición anterior. Evalúe la capacidad del ratón para aprender de forma flexible una nueva ubicación de la zona de choque. Por lo general, las señales de la sala no se cambian durante el aprendizaje inverso.
2. Repita los pasos 3.4-3.7 para todos los ratones.

6. Prueba de sonda (opcional, 1 día)

1. En la prueba de sonda, mida el tiempo hasta la primera entrada y/o el tiempo máximo evitando la zona de choque.
   NOTA: Esto indica la consolidación de la memoria después de la fase de adquisición. Un ratón bien entrenado evitará entrar en la zona de choque durante un período prolongado (>60 segundos), mostrando evidencia de aprendizaje espacial.
2. Ajuste la intensidad de la luz de la habitación como en el día de entrenamiento de adquisición.
3. Habitúa al ratón en la sala de pruebas o antesala durante 30 min.
4. Configura el software Tracker.
5. Establezca la duración de la prueba en el mismo tiempo que el período de prueba realizado anteriormente (por ejemplo, 10 minutos o 30 minutos, según los parámetros de la prueba).
6. No entregue descargas para esta prueba.
7. Coloque el ratón en el lado opuesto de la zona de choque aversivo, mirando hacia la pared.
8. Comienza la prueba y retírate detrás de la cortina.
9. Asegúrese de que el mouse se rastree de manera eficiente.
10. Monitoree el mouse en la pantalla de la computadora y detenga la prueba cuando ingrese a la zona de choque. Algunos investigadores prefieren continuar el ensayo durante 5 minutos para ver si el ratón sigue volviendo a la zona de choque.
11. Levante suavemente el ratón y regrese a la jaula de inicio.
12. Asegúrese de que se recoja toda la orina y los excrementos, y que la rejilla se limpie a fondo con etanol al 80% (v/v).

7. Análisis de pistas

NOTA: El rendimiento de la tarea se puede lograr a través de diferentes software de seguimiento. A continuación se muestra cómo se utiliza el software incluido para determinar el rendimiento durante la tarea APA. En este caso, los datos se analizan utilizando el programa Track Analysis .

1. Para analizar los datos, abra el programa Análisis de seguimiento y seleccione Evitación en el menú desplegable de la ventana principal.
2. Haga clic en Agregar tarea para cargar los archivos de datos guardados durante la fase de adquisición en una nueva ventana. En Nombre del grupo, cree un grupo para analizar, por ejemplo, el día 1 o la hora del análisis.
3. Haga clic en el directorio de salida para seleccionar la ubicación para guardar los datos analizados.
4. Agregue los archivos a analizar haciendo clic en la pestaña Agregar archivos y seleccionando los archivos de la unidad local.
5. Establezca la hora que se analizará haciendo clic en la pestaña Establecer hora . Esto proporciona la capacidad de definir el período que se analizará, es decir, de 0 a 600 s. Alternativamente, analice los datos en contenedores, es decir, 60 s.
6. Una vez agregadas todas las pistas, haga clic en la pestaña Análisis y seleccione Ejecutar análisis para analizar los datos. El análisis producirá varias carpetas. Los datos para el análisis estarán en la carpeta TBLfiles . Abra estos archivos de datos en una hoja de cálculo y utilícelos para un análisis posterior, es decir, una comparación por pares o un ANOVA de medidas repetidas.
   NOTA: El análisis también producirá otras carpetas, incluidos los archivos PS que tendrán una descripción de una sola página de los ratones durante las pruebas, mostrando un mapa de rastreo y dónde se recibieron los choques.

Results

Los ratones con la capacidad de aprendizaje espacial intacta mostrarán una disminución en el número de choques durante los sucesivos ensayos de adquisición (Figura 4A). Del mismo modo, el tiempo máximo para evitar la zona de choque aumentará a medida que el ratón aprenda a alejarse con éxito de la zona de choque (Figura 4B). Sin embargo, los ratones que no pueden aprender una estrategia de evitación efectiva mostrarán un número constante de choques para cada ensayo de adquisición (Figura 4A). A menudo, los ratones que no logran identificar la zona de choque recibirán múltiples descargas durante cada entrada en la zona. Los mapas de trazas son útiles para proporcionar ejemplos de ratones que aprenden a evitar la zona de choque (Figura 4C) y aquellos que no pueden evitar la zona de choque (Figura 4D). En ambos casos, estos mapas de seguimiento representan el último día de la adquisición. El ratón de la Figura 4C recibió solo 2 descargas, representadas por los dos círculos. Además, tenga en cuenta que el mapa de seguimiento muestra que el mouse pasa la mayor parte del tiempo en el lado opuesto de la zona de choque, que está representada por la cuña roja. Por el contrario, el ratón de la Figura 4D recibió más descargas y el mapa de seguimiento revela un patrón desordenado. Ejemplos de ratones que no pueden aprender con éxito a evitar la zona de choque son aquellos que tienen una neurogénesis del hipocampo reducida, ya sea debido a la edad avanzada, como muestran los ratones de 18 meses (Figura 4A, B- modificado de Blackmore et al., 2021⁷), la ablación química de neuronas inmaduras⁶ o las lesiones del hipocampo (ver Codd et al., 2020)⁸.

Es importante distinguir entre una prueba fallida debido a que el mouse no aprendió y una falla en la configuración del equipo. Las dos causas más comunes de los malos resultados debidos a fallos del equipo son el mal seguimiento del ratón (Figura 5A) o que el ratón no reciba una descarga. Un seguimiento deficiente puede evitar que el mouse reciba una descarga cuando está en la zona de choque. Alternativamente, un seguimiento deficiente puede inducir incorrectamente un choque cuando el mouse no está en la zona. En ambos casos, esto evitará que el ratón desarrolle una estrategia de evasión efectiva. El seguimiento deficiente se puede resolver ajustando el umbral en la pestaña "Desde el calibrador". El seguimiento deficiente se define normalmente como más de 1000 fotogramas incorrectos durante un período de 10 minutos y ocurre muy raramente. Un seguimiento deficiente puede convertirse en un problema con los ratones envejecidos, donde puede desarrollarse alopecia. Al recibir una descarga, el ratón reaccionará tensándose o, en ocasiones, vocalizando. Por lo general, el mouse se moverá, aunque sea ligeramente, y se puede ver en el software de seguimiento en vivo. Cuando el ratón permanece perfectamente quieto dentro de la zona de choque, se mostrará una línea clara de choques (Figura 5B). Esto puede deberse a que la caja de choque no está encendida o a que los excrementos se atascan entre las barras, lo que reduce la amplitud del choque que se administra al animal.

Figura 1: Aparato APA, sala de comportamiento y configuración de la zona de choque. (A) Un ejemplo de la configuración de la sala y la arena de pruebas. El aparato APA se eleva y se coloca en el centro de la habitación, rodeado de nuevas señales visuales. Las señales visuales en blanco y negro se utilizan a la misma altura que la plataforma. (B). La función Objetivo dentro de la pestaña Experimento permite enmascarar toda la arena y crea una ubicación de la zona de choque. En este ejemplo, se ha creado una zona de choque, representada por la cuña roja, a 270°. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración de APA para cepas de ratones albinos. La arena APA se puede configurar para cepas de ratones albinos, como BALB/c, seleccionando la opción Luz en la pestaña Seguimiento y creando un fondo de arena negro. Un ratón albino sobre fondo negro consigue un alto contraste y ofrece un mejor seguimiento del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Es esencial ajustar el umbral para el seguimiento del mouse. El umbral debe ajustarse adecuadamente para garantizar un buen seguimiento de los animales durante el ensayo. El umbral se ajusta moviendo la línea roja en el panel de umbral en la pestaña Desde el calibrador . (A) Un ejemplo de una buena selección de umbral con una región naranja sólida y una X azul en el objeto. (B) Un umbral pobre con naranja moteado. Un mal seguimiento conduce a la pérdida de un animal en la arena o evita que el ratón reciba una descarga cuando está en la zona de choque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación del rendimiento entre ratones jóvenes (10 semanas) y mayores (18 meses) en un paradigma de aprendizaje de 5 días y mapas Trace. (A) Los ratones de 10 semanas de edad recibieron significativamente menos descargas en comparación con los ratones de 18 meses durante 5 días de prueba; Nótese que la diferencia en el número de descargas recibidas fue mínima en el primer día de pruebas entre los grupos, pero los ratones jóvenes con memoria intacta aprendieron a evitar la entrada en la zona de choque más rápidamente que el grupo mayor. (B) El tiempo máximo de evitación se calculó como el tiempo máximo empleado para evitar el choque durante el juicio de 10 minutos. Los ratones más jóvenes aprendieron rápidamente a evitar la entrada en la zona de choque en comparación con los ratones más viejos, lo que sugiere que los ratones jóvenes están aprendiendo de manera efectiva. (C) El ratón en este mapa de trazo recibió solo dos descargas, representadas por los dos círculos en esta prueba de adquisición. Este ratón también pasó más tiempo en la arena opuesta a la zona de choque, que está representada por la cuña roja. (D) Este ratón recibió más descargas y pasó más tiempo cerca de la zona de choque, lo que sugiere que el aprendizaje espacial no se logró en este ratón. Se utilizaron ANOVA de dos vías en medida repetida con pruebas post hoc de Bonferroni para probar la significación. p<0,0001. Los paneles A y B fueron modificados a partir de Blackmore et ^al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Los mapas de rastreo proporcionan información importante para cada ratón durante cada prueba. (A) Observe las líneas rectas que están presentes en este ejemplo de seguimiento. Esto se debe a que el software de seguimiento identifica incorrectamente a un ratón durante la tarea. (B) Un ejemplo de buen seguimiento durante el juicio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Visualización de pistas y mapa de calor en diferentes programas de seguimiento de animales. Tanto el Programa (A) 1 como el Programa 2 (B) detectan la ubicación y el movimiento del animal para crear trazados de seguimiento para inspeccionar visualmente si el animal aprende la tarea o el efecto del tratamiento experimental. Ambos programas muestran trazados idénticos de un animal que aprendió la tarea de manera eficiente. (C) También se puede crear un mapa de calor, lo que facilita la identificación de puntos calientes y la agrupación de los puntos de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En conclusión, la prueba de evitación de lugares activos es una tarea efectiva de aprendizaje espacial que se puede utilizar en una variedad de cepas de ratones y condiciones experimentales. La tarea APA supera las limitaciones asociadas con otros paradigmas de aprendizaje espacial¹⁴, como el MWM, que es estresante para los ratones medido por los niveles de cortisol⁹. El MWM tampoco es adecuado para ratones envejecidos, donde se ha informado que flotan durante la tarea¹⁰. Aunque otras pruebas de aprendizaje espacial, como el laberinto de Barnes y la prueba de localización de objetos nuevos, son menos estresantes, están limitadas por la frecuencia con la que se pueden realizar pruebas repetidas en la misma cohorte de ratones. Por lo tanto, la principal ventaja de la tarea APA es que se puede utilizar varias veces, ya que se pueden ajustar varios parámetros para mantener la novedad. De hecho, hemos utilizado la tarea APA hasta 5 veces en la misma cohorte de ratones para examinar el efecto de la ablación del hipocampo y el efecto posterior del ejercicio⁸. En cada caso, los parámetros, incluida la rotación de la arena, la zona de choque y las señales espaciales, se modificaron entre las pruebas. Esto fue efectivo para asegurar que los ratones usaran señales de navegación espacial para volver a aprender la tarea, como lo demostraron los animales de control, comenzando con un alto número de choques y luego disminuyendo durante los días de prueba posteriores para cada período de prueba⁸. Típicamente, al final de un paradigma de prueba de 5 días, consideramos que cualquier animal que haya recibido más de 10 descargas en el último día o que tenga una evitación máxima de menos de 60 s no ha aprendido el paradigma.

Más allá de la capacidad de modificar fácilmente la configuración para permitir múltiples rondas de pruebas espaciales, la tarea APA garantiza que los ratones deban usar la navegación espacial para evitar eficazmente la zona de choque. Por ejemplo, los animales deben usar señales externas para localizar y evitar entrar en la zona de choque estacionaria alejándose de ella⁵. A medida que la arena está girando, los animales no pueden usar un enfoque idiotético para la navegación, ni pueden usar señales exteroceptivas como el olor porque estas señales giran con la arena mientras que la zona de choque y las señales espaciales permanecen^{estacionarias}.

También es importante asegurarse de que los ratones estén adecuadamente habituados al ámbito del investigador y de la APA. La intensidad del choque del pie también debe optimizarse, ya que tanto una intensidad de choque demasiado baja como demasiado alta pueden comprometer la capacidad de los ratones para aprender y realizar la tarea⁵. La intensidad del choque suele ajustarse a 0,5 mA y no debe superar los 0,7 mA. Para los animales que tienen un comportamiento similar a la ansiedad aumentado, considere reducir tanto la intensidad de la luz como la intensidad del choque de las patas. El aumento de la ansiedad durante la tarea APA puede presentarse como saltos excesivos, carrera incontrolada dentro de la arena o congelación prolongada. El protocolo descrito aquí utilizó una intensidad de choque de 0,5 mA, la misma intensidad que se ha utilizado previamente con BALB/c, que se sabe que tiene un comportamiento similar a la ansiedad más alto¹⁵.

Aquí, describimos el software de seguimiento de animales suministrado por la empresa que proporcionó la plataforma de evitación de lugares activos utilizada. El software de seguimiento de video alternativo también es adecuado para analizar el rendimiento del comportamiento. Estos programas también pueden medir y analizar con precisión el rendimiento del mouse durante las tareas APA. Estos programas permiten la creación de varias zonas y ubicaciones dentro de la arena APA para evaluar el comportamiento. La configuración de la arena para un APA consta de una zona de choque triangular, donde se mide el número de entradas, el tiempo hasta la primera entrada y el tiempo que se pasa en la zona de choque. También se pueden agregar zonas adicionales dentro de la arena. Por ejemplo, podemos añadir una zona central o una zona opuesta a la zona de choque para medir el tiempo empleado, y la distancia recorrida en esas zonas como estrategia animal para evitar la zona aversiva. Estos programas rastrean el centro de masa del ratón, que luego se guarda y se muestra sobre el marco de referencia para su inspección visual (Figura 6A, B). Por último, también es posible crear un mapa de calor de densidad para el rendimiento individual y grupal (Figura 6C).

Al realizar la tarea APA, existen problemas potenciales que deben abordarse. En ocasiones, los ratones deberán excluirse del análisis debido a la falta de respuesta a la zona de choque. Como siempre, la exclusión solo debe considerarse cuando cumplan con condiciones atípicas predefinidas, por ejemplo, que queden fuera de 2 desviaciones estándar de la media. Las tareas conductuales complejas, como la APA, suelen requerir altos valores de N de los animales. Sugerimos realizar un análisis de potencia para calcular el tamaño de muestra adecuado antes de realizar APA. Esto dependerá de la cepa utilizada y de los grupos de tratamiento. A partir de la experiencia, encontramos que un valor n de 10 o más para cada grupo proporciona suficiente potencia cuando se realizan experimentos APA. El principal problema con esta tarea es garantizar un seguimiento de alta calidad del mouse durante la tarea. La etapa de habituación de la tarea debe usarse para confirmar que esto está ocurriendo. Los ratones que no responden a un choque a menudo se deben a la formación de excrementos entre las barras de la rejilla. Por lo tanto, es esencial limpiar el aparejo después de cada animal y eliminar cualquier excremento u orina. Esto también reducirá el estrés de los animales que siguen. La tarea APA generalmente implica un paradigma de 5 días, lo que puede presentar algunas limitaciones para los estudios que involucran intervenciones efectivas menos de 5 días; Sin embargo, la memoria a corto plazo o la adquisición de aprendizaje espacial aún se pueden evaluar para tales estudios utilizando el enfoque de 30 minutos de una sola sesión.

En resumen, este artículo proporciona una descripción detallada de cómo configurar y utilizar el paradigma de evitación activa de lugares para probar el aprendizaje espacial de ratones. La capacidad de cambiar las condiciones para que se puedan probar múltiples cepas de ratones de diferentes colores es una clara ventaja sobre otras pruebas espaciales más tradicionales, como la MWM. Además, la modificación de múltiples parámetros permite repetir las pruebas para que los cambios en el aprendizaje espacial puedan compararse con precisión durante varios paradigmas experimentales o durante el envejecimiento fisiológico. En un corto período de tiempo, la prueba APA ha demostrado ser una alternativa precisa y efectiva para el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo. En el futuro, la tarea APA puede utilizarse como un método fiable para evaluar las intervenciones terapéuticas o de ejercicio sobre el comportamiento cognitivo y espacial tanto en ratones salvajes como transgénicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fuente de corriente constante CS02	Grupo BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Estados Unidos
Caja de control	Grupo BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Estados Unidos
Ethovision	Noldus	Versión 16	Wageningen, Países Bajos
Scrambler de choque	Grupo BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Estados Unidos
Análisis de pistas	Grupo BioSignal	Versión 2.2	Acton, Massachusetts, Estados Unidos
Programa de seguimiento	Grupo BioSignal	Versión: 2.36	Acton, Massachusetts, Estados Unidos