Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.
Artículo de método
Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.
La barrera hematoencefálica (BHE) es una estructura fisiológica dinámica compuesta por células endoteliales microvasculares, astrocitos y pericitos. Al coordinar la interacción entre el tránsito restringido de sustancias nocivas, la absorción de nutrientes y la eliminación de metabolitos en el cerebro, la BHE es esencial para preservar la homeostasis del sistema nervioso central. La construcción de modelos in vitro de la BHE es una herramienta valiosa para explorar la fisiopatología de los trastornos neurológicos y crear tratamientos farmacológicos. Este estudio describe un procedimiento para crear un modelo de células BBB monocapa in vitro mediante la siembra de células bEnd.3 en la cámara superior de una placa de 24 pocillos. Para evaluar la integridad de la función de barrera celular, se utilizó el voltímetro de celda epitelial convencional para registrar la resistencia eléctrica transmembrana de las células normales y las células hipóxicas inducidas por CoCl2 en tiempo real. Anticipamos que los experimentos anteriores proporcionarán ideas efectivas para la creación de modelos in vitro de BHE y medicamentos para tratar trastornos de enfermedades del sistema nervioso central.
La BHE es una interfaz biológica única entre la circulación sanguínea y el tejido nervioso, que está compuesta por células endoteliales vasculares, pericitos, astrocitos, neuronas yotras estructuras celulares. El flujo de iones, sustancias químicas y células entre la sangre y el cerebro está estrictamente regulado por esta barrera. Esta homeostasis protege los tejidos nerviosos contra toxinas y patógenos, al tiempo que permite el funcionamiento adecuado de los nervios del cerebro 2,3. Mantener la integridad de la BHE puede prevenir eficazmente el desarrollo y la progresión de trastornos....
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NOTA: Se inocularon células endoteliales derivadas del cerebro de ratón.3 (bEnd.3) en las cámaras de una placa de 24 pocillos para construir un modelo in vitro simple de BHE en condiciones específicas del medio. Los TEER de células normales e hipóxicas se midieron con medidor TEER (Figura 1 y Figura 2).
1. Preparación de la solución
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Este protocolo permitió el registro de cambios en los valores de resistencia de las celdas de acuerdo con los parámetros establecidos en el medidor de resistencia transendotelial. La viabilidad de las células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas con diferentes concentraciones de CoCl2 se examinó mediante el ensayo CCK-8. El mayor daño celular producido por el CoCl2 estuvo representado por una menor viabilidad celular. Encontramos que 300 μM de CoCl2 eran significativamente citotóxico.......
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El cerebro, uno de los órganos corporales más desarrollados, controla una amplia gama de intrincados procesos fisiológicos, como la memoria, la cognición, la audición, el olfato yel movimiento. El cerebro es uno de los órganos más complicados y enfermos del cuerpo humano al mismo tiempo. La aparición de muchos trastornos del sistema nervioso central muestra una tendencia creciente año tras año debido a factores como la contaminación del aire, los patrones de alimentación irregulares y otros factor.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274207 y 82104533), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012) y el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de MTC de Chengdu (XKTD2022013).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa transwell de 24 pocillos | Corning (Corning 3470, 0,33 cm2, 0,4 y micro; m) | 10522023 | |
| 75 % de etanol | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2023052901 | |
| placa de 96 pocillos | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 células | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Kit de recuento de células-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Plato de cultivo celular (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cloruro de cobalto (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Suero fetal bovino | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Software | Software GraphPad | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contiene colágeno IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Lector de microplacas | Software | SpectraMax iD5 OriginPro 8 SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicilina-Estreptomicina (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Hipoclorito de sodio | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2022091501 | |
| Medidor de resistencia transmembrana | World Precision Instruments LLC | VOM3 (versión 1.6) |
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