Un modelo para la exposición experimental de humanos a larvas de garrapatas Ixodes scapularis

Las garrapatas duras (Ixodidae: Acari) son ectoparásitos sanguíneos obligados que se encuentran en todo el mundo y son capaces de transmitir una amplia gama de patógenos, incluidas bacterias, virus y parásitos, de gran importancia médica y veterinaria. Las garrapatas Ixodid deben permanecer adheridas al huésped durante días para completar una ingesta de sangre, y tienen la capacidad de permanecer adheridas a la piel evitando el reconocimiento, evitando la coagulación local de la sangre y facilitando la alimentación a largo plazo ^1,2,3. Los estudios en animales han demostrado que los huéspedes no permisivos adquieren resistencia a las picaduras de garrapatas con exposiciones repetidas a las garrapatas, lo que puede conducir a una disminución de la capacidad de transmisión de un patógeno, mientras que las garrapatas pueden parasitar repetidamente a los huéspedes permisivos. La resistencia adquirida a las garrapatas depende de la naturaleza de la respuesta inmunitaria del huésped 4,5,6,7.

Las enfermedades transmitidas por garrapatas son una amenaza cada vez mayor en los Estados Unidos (EE. UU.), y el número de casos notificados se duplicó con creces entre 2004 y 2016 ^8,9. Debido al cambio climático, los rangos geográficos de las diferentes garrapatas continúan expandiéndose^10,11. Las principales enfermedades transmitidas por garrapatas en los EE. UU. incluyen la enfermedad de Lyme, la anaplasmosis, la ehrlichiosis, la fiebre maculosa, la rickettsiosis, la babesiosis, la tularemia y la enfermedad por el virus de Powassan⁸. La enfermedad de Lyme, causada por la infección por Borrelia burgdorferi sensu lato, es la enfermedad transmitida por garrapatas más común en los Estados Unidos y Europa¹². Con aproximadamente 476.000 personas diagnosticadas con la enfermedad de Lyme anualmente en los EE.UU., existe una carga económica y de salud pública para las personas y para la sociedad 13,14,15.

Ixodes scapularis (la garrapata de patas negras o de ciervo) es el vector principal de la enfermedad de Lyme, así como de la anaplasmosis, la babesiosis, la enfermedad por Borrelia miyamotoi y la enfermedad por el virus de Powassan en los Estados Unidos. Otras especies de garrapatas médicamente importantes en los EE. UU. incluyen Amblyomma americanum (garrapata estrella solitaria), Dermacentor variabilis (garrapata del perro americano), Ixodes pacificus (garrapata occidental de patas negras), Dermacentor andersoni (garrapata de la madera de las Montañas Rocosas), Ixodes cookei (garrapata de la marmota), Dermacentor occidentalis (garrapata de la costa del Pacífico), Rhipicephalus sanguineus (garrapata marrón del perro) y Amblyomma maculatum (garrapata de la costa del Golfo)¹⁶.

El desarrollo de un método para exponer a los voluntarios de investigación a las picaduras de garrapatas apoya los estudios que utilizan el vector natural para buscar evidencia de infección, un procedimiento conocido como xenodiagnóstico 17,18,19,20,21, y para aprender más sobre la inmunidad inducida por la exposición a garrapatas, que puede contribuir al descubrimiento de una vacuna antigarrapatas ^5,6,7. El procedimiento aquí descrito fue desarrollado y utilizado en el primer estudio de investigación en humanos que utilizó larvas de Ixodes scapularis criadas en laboratorio para el xenodiagnóstico de la infección por B. burgdorferi después de la terapia con antibióticos (NCT01143558), publicado en 2014¹⁹. El sistema se ha utilizado con éxito en un estudio de fase 2 que investigaba si un xenodiagnóstico positivo se correlacionaba con la persistencia de los síntomas después del tratamiento con antibióticos de la enfermedad de Lyme (NCT02446626) y en un estudio que exploraba la respuesta del huésped a las picaduras de garrapatas (NCT05036707).

Este protocolo de procedimiento describe el proceso para crear el apósito de contención, el procedimiento de colocación de garrapatas y el procedimiento de eliminación de garrapatas, así como el cuidado del sitio necesario para mantener el apósito de contención. Los detalles sobre la colonia de garrapatas I. scapularis libre de patógenos y los procedimientos de exposición a garrapatas utilizados para los estudios citados anteriormente han sido descritos previamente^19,22. Esta metodología ofrece una herramienta de investigación flexible que se puede adaptar para estudiar diferentes aspectos de la respuesta del huésped humano a las picaduras de garrapatas, la eficacia de los medicamentos para la prevención de garrapatas, así como la enfermedad de Lyme y otras enfermedades transmitidas por garrapatas.

La exposición de los voluntarios a las picaduras de garrapatas es un método experimental y debe llevarse a cabo bajo un protocolo de investigación clínica aprobado por las autoridades reguladoras pertinentes. Los estudios clínicos (NCT01143558, NCT02446626 y NCT05036707) fueron aprobados por las respectivas juntas de revisión institucional, se llevaron a cabo bajo las exenciones de dispositivos de investigación otorgadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE. UU. y se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de Buenas Prácticas Clínicas. Además, estos estudios se registraron en ClinicalTrials.gov y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

1. Preparación del apósito de contención

1. Para crear una plantilla de medición, fotocopie el apósito de contención hidrocoloide de 3" x 3" a lo largo del costado de las líneas de medición (Figura 1A y Tabla de Materiales).
2. Corta la plantilla fotocopiada a lo largo de la línea de 1". Luego, corte a lo largo de la línea de 2", creando un círculo de 2" con un centro de 1" (Figura 1B).
3. Con esta plantilla, corte el apósito de espuma no adhesivo para crear un círculo de 2" con un centro de 1" (Figura 2A, B y Tabla de Materiales).
4. Usando la misma plantilla, corte un círculo de 2" en el centro del apósito hidrocoloide extrafino de 4" x 4" (Figura 2C,D).
5. Corte la capa hidrocoloide del apósito de contención de 3" x 3" en la línea de 11/2".
6. Tire hacia atrás del revestimiento de papel de la capa hidrocoloide del apósito de contención para exponer el adhesivo. Coloque el apósito de espuma cortado dentro del círculo de 2" del adhesivo (Figura 3A). Esto asegurará que el apósito de espuma se extienda más allá de la abertura del apósito de contención. Vuelva a colocar el revestimiento de papel en la capa hidrocoloide del apósito (Figura 3B).
   NOTA: Estas mediciones se utilizaron para estudios con hasta 10 larvas de garrapatas I. scapularis . Para estudios que involucran hasta 30 larvas de garrapatas I. scapularis , la plantilla para el centro de espuma se cortó entre las marcas de 1" y 11/2" para permitir un área más grande para la colocación. Las medidas del apósito de contención se pueden adaptar de acuerdo con el diseño del estudio.

2. Colocación de ticks

1. Almacenamiento de garrapatas
   1. Guarde las larvas de garrapatas I. scapularis en un refrigerador de grado médico con la temperatura establecida en 9-10 °C.
   2. Guarde las garrapatas en un frasco cubierto con una tapa de malla para permitir un flujo de aire adecuado. Empaque el frasco de garrapatas en una bolsa de plástico hermética con una esponja ligeramente humedecida para mantener la humedad y evitar la desecación.
2. Colocación de las garrapatas
   1. Retire las garrapatas del refrigerador para permitir que se calienten a temperatura ambiente. Las garrapatas pueden activarse en tan solo 15 minutos fuera del refrigerador.
   2. Coloque una hoja blanca alrededor del área de colocación para visualizar fácilmente cualquier marca que se haya caído inadvertidamente.
   3. Humedece una almohadilla de gasa de 4" x 4" con agua limpia o solución salina y úsala para limpiar la piel del sitio de colocación. El área debe secarse con palmaditas o dejarse secar al aire.
      NOTA: Al seleccionar el sitio del cuerpo para la colocación de las garrapatas, considere áreas que no restrinjan las actividades diarias del voluntario y donde el participante pueda monitorear fácilmente la integridad del vendaje. No coloque las garrapatas en áreas donde puedan ser aplastadas debido a la presión directa (por ejemplo, la espalda). Evalúe el vello corporal del participante y, si es necesario, recorte cuidadosamente el vello corporal excesivo con tijeras en el sitio del adhesivo, evitando dañar la piel. Evite usar una maquinilla de afeitar para depilarse, ya que puede aumentar el riesgo de lesiones e infecciones en la piel.
   4. Una vez que la piel esté seca, retire el revestimiento adhesivo del lado hidrocoloide del apósito preparado y fíjelo firmemente a la piel en el sitio de colocación, asegurándose de que la capa de malla permanezca abierta.
   5. Rompa el hisopo de madera (consulte la Tabla de materiales) por la mitad para exponer los extremos irregulares.
   6. Abra con cuidado el frasco de garrapatas.
   7. Usando el extremo dentado del hisopo de madera, transfiera las garrapatas activas del vial y colóquelas sobre la piel dentro del apósito de contención (Figura 4A). Pida a un miembro adicional del equipo que supervise el sitio de colocación de las garrapatas para asegurarse de que las garrapatas permanezcan dentro del vendaje de contención. Use cinta adhesiva para atrapar las garrapatas que se escapan del vial durante este proceso.
      NOTA: Romper un hisopo de madera y usar el extremo dentado es efectivo para la manipulación y transferencia de garrapatas sin causar daño a las garrapatas. Un cepillo pequeño con cerdas suaves de color claro también funciona para transferir garrapatas del recipiente al sitio de la piel.
   8. Una vez que se haya colocado el número especificado de garrapatas para el estudio, retire el revestimiento adhesivo de la capa de malla del apósito de contención y ciérrelo sobre la abertura.
   9. Después de asegurarse de que el adhesivo esté bien adherido, aplique el apósito hidrocoloide extrafino preparado de 4" x 4" sobre el apósito de contención para mayor seguridad (Figura 4B).
      NOTA: En las secciones de métodos de los estudios publicados 19,22 se puede encontrar información adicional sobre la colonia de garrapatas I. scapularis libre de patógenos y la duración de los procedimientos de exposición a garrapatas utilizados en los estudios citados^19,22.

3. Cuidado del sitio

1. Proporcione una cubierta de barrera contra el agua y cinta hipoalergénica de 2" (consulte la Tabla de materiales) al participante de la investigación.
2. Proporcione instrucciones para el cuidado del sitio de contención de garrapatas.
   1. Revise periódicamente el apósito y controle los bordes para una adherencia segura a la piel. Aplique cinta adhesiva adicional para reforzar los bordes del apósito según sea necesario.
   2. No rasque el sitio del apósito y absténgase de abrir o quitar el apósito durante el período de estudio.
   3. Evite bañarse o sumergirse en agua. Además, evite las duchas calientes y limite la duración de la ducha. Antes de ducharse, proteja el vendaje de contención con la cubierta de barrera de agua provista y retírelo después de completar la ducha. Seque suavemente el apósito e inspecciónelo para asegurarse de que permanezca seguro.
   4. Evite las actividades que puedan provocar una transpiración abundante y comprometer la integridad del vendaje (p. ej., ejercicio aeróbico, caminatas prolongadas).

4. Eliminación de garrapatas

1. Preparación de viales de recolección
   1. Etiquete los viales de recolección de garrapatas con los identificadores deseados (por ejemplo, código de estudio, fecha).
   2. Si es necesario conservar garrapatas vivas, perfore los agujeros en el tapón de los viales con una aguja de 20 G. Use una capa de malla de nailon o poliéster junto con la tapa para sellar el vial. Coloque un pequeño trozo de esponja húmeda en una bolsa hermética con el frasco de garrapatas para mantener la humedad.
2. Eliminación de las garrapatas
   1. Coloque sábanas blancas alrededor del sitio del vendaje y asegúrese de que haya un recipiente de recolección al alcance de la mano.
   2. Con toallitas con alcohol, retire con cuidado el vendaje de la piel.
   3. Una vez retirado por completo, coloque el vendaje en el recipiente de recolección y examínelo para detectar la presencia de garrapatas desprendidas.
   4. Evalúe el sitio de colocación de las garrapatas adheridas. Las garrapatas que se han alimentado hasta la saciedad se desprenderán (Figura 5A). Para las garrapatas adheridas restantes, use pinzas de punta fina para extraerlas (Figura 5B).
   5. Limpie la piel con toallitas con alcohol o agua y jabón.

El estudio demostró que el procedimiento es seguro y bien tolerado, y el evento adverso primario fue la picazón leve en el sitio de las picaduras, observada en el 58% de los procedimientos. No hubo eventos adversos graves relacionados con el procedimiento cuando se utilizaron larvas limpias criadas en laboratorio con garrapatas I. scapularis 19. En los 43 procedimientos realizados, el porcentaje medio de recuperación de las garrapatas adheridas en comparación con las colocadas fue del 45% ± del 27% (DE), con una mediana del 40% (Figura 6).

La duración exacta de las larvas de garrapatas I. scapularis para adherirse a los humanos sigue sin estar clara, ya que el tiempo desde la colocación de la garrapata hasta la adhesión de la garrapata no se observó de forma rutinaria. En un caso en el que se observó a un voluntario de investigación durante 2 horas y media, ninguna de las garrapatas se había adherido al final del período. Se necesitan de 4 a 5 días desde la colocación de las larvas de garrapatas I. scapularis para alimentarse hasta la repleción19.

Figura 1: Medidas del apósito de contención. (A) Una fotocopia del apósito de contención. (B) La plantilla de medición del apósito de contención creada cortando la fotocopia en las marcas deseadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Creación de apósitos de refuerzo no adhesivos e hidrocoloides. (A) Uso de la plantilla de medición del apósito de contención para cortar el apósito de espuma. (B) Un círculo de 2" con un apósito de espuma central de 1". (C) Usar la plantilla de medición del apósito de contención para cortar el apósito hidrocoloide. (D) Un apósito hidrocoloide de 4" x 4" con un centro de 2". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Apósito de contención. (A) El apósito de espuma en el lado adhesivo de la capa hidrocoloide del apósito de contención. (B) Apósito de contención utilizado para la alimentación de garrapatas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Colocación de garrapatas. (A) Transferencia de garrapatas al voluntario de investigación. (B) Asegurar el apósito de contención. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Colección de garrapatas. (A) Garrapatas repletas separadas. (B) Eliminación de garrapatas adheridas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Recuperación de larvas de garrapatas Ixodes scapularis ingurgitadas. Cada punto representa el porcentaje de larvas de garrapatas de I. scapularis ingurgitadas recuperadas utilizando el protocolo descrito. El porcentaje promedio de garrapatas recuperadas fue de 45 ± 27 (DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Dra. Adriana Marques tiene una patente US 8,926,989 B2; y es asesor científico no remunerado de la Alianza Mundial de Lyme y de la Fundación Americana de la Enfermedad de Lyme. Siu Ping Turk y Aleah Eschman no tienen una asociación que pueda plantear un conflicto de intereses. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los Estados Unidos.