Monitorización del aprendizaje motor fino y asociativo en ratones mediante la escalera Erasmus

Resumen

En este artículo se presenta un protocolo que permite una evaluación no invasiva y automatizada del rendimiento de la motricidad fina, así como el aprendizaje motor adaptativo y asociativo ante retos, utilizando un dispositivo denominado Escalera Erasmus. La dificultad de la tarea se puede ajustar para detectar el deterioro motor que va desde grados mayores hasta sutiles.

Resumen

El comportamiento está moldeado por las acciones, y las acciones requieren habilidades motoras como la fuerza, la coordinación y el aprendizaje. Ninguno de los comportamientos esenciales para mantener la vida sería posible sin la capacidad de hacer la transición de una posición a otra. Desafortunadamente, las habilidades motoras pueden verse comprometidas en una amplia gama de enfermedades. Por lo tanto, investigar los mecanismos de las funciones motoras a nivel celular, molecular y de circuito, así como comprender los síntomas, las causas y la progresión de los trastornos motores, es crucial para desarrollar tratamientos efectivos. Los modelos de ratón se emplean con frecuencia para este propósito.

En este artículo se describe un protocolo que permite monitorizar diversos aspectos del rendimiento motor y el aprendizaje en ratones mediante una herramienta automatizada llamada Escalera Erasmus. El ensayo consta de dos fases: una fase inicial en la que se entrena a los ratones para que naveguen por una escalera horizontal construida con peldaños irregulares ("aprendizaje de la motricidad fina"), y una segunda fase en la que se presenta un obstáculo en el camino del animal en movimiento. La perturbación puede ser inesperada ("aprendizaje motor desafiado") o precedida por un tono auditivo ("aprendizaje motor asociativo"). La tarea es fácil de llevar a cabo y está totalmente respaldada por un software automatizado.

Este informe muestra cómo las diferentes lecturas de la prueba, cuando se analizan con métodos estadísticos sensibles, permiten un seguimiento fino de las habilidades motoras del ratón utilizando una pequeña cohorte de ratones. Proponemos que el método será altamente sensible para evaluar las adaptaciones motoras impulsadas por modificaciones ambientales, así como los déficits motores sutiles en etapa temprana en ratones mutantes con funciones motoras comprometidas.

Introducción

Se han desarrollado una variedad de pruebas para evaluar los fenotipos motores en ratones. Cada prueba proporciona información sobre un aspecto específico del comportamiento motor¹. Por ejemplo, la prueba de campo abierto informa sobre el estado general de locomoción y ansiedad; las pruebas de coordinación y equilibrio con rotarod y viga de marcha; El análisis de la huella tiene que ver con la marcha; la cinta de correr o la rueda de correr en el ejercicio físico forzado o voluntario; Y la rueda compleja tiene que ver con el aprendizaje de habilidades motoras. Para analizar los fenotipos motores de los ratones, los investigadores deben realizar estas pruebas de forma secuencial, lo que implica mucho tiempo y esfuerzo y, a menudo, varias cohortes de animales. Si hay información a nivel celular o de circuitos, el investigador normalmente opta por una prueba que monitorea un aspecto relacionado y sigue a partir de ahí. Sin embargo, faltan paradigmas que discriminen diferentes aspectos de la conducta motora de forma automatizada.

En este artículo se describe un protocolo para utilizar la Escalera Erasmus ^2,3, un sistema que permite una evaluación exhaustiva de una variedad de características de aprendizaje motor en ratones. Las principales ventajas son la reproducibilidad y sensibilidad del método, junto con la capacidad de valorar la dificultad motora y separar los déficits en el rendimiento motor de la alteración del aprendizaje motor asociativo. El componente principal consiste en una escalera horizontal con peldaños altos (H) y bajos (L) alternados equipados con sensores sensibles al tacto que detectan la posición del mouse en la escalera. La escalera está hecha de 2 x 37 peldaños (L, 6 mm; H, 12 mm) espaciados 15 mm entre sí y colocados en un patrón alterno izquierda-derecha con espacios de 30 mm (Figura 1A). Los peldaños se pueden mover individualmente para generar varios niveles de dificultad, es decir, crear un obstáculo (elevando los peldaños altos en 18 mm). Junto con un sistema de registro automatizado y asociando las modificaciones del patrón de peldaños con estímulos sensoriales, la escalera Erasmus evalúa el aprendizaje de la motricidad fina y la adaptación del rendimiento motor en respuesta a los desafíos ambientales (aparición de un peldaño más alto para simular un obstáculo, un estímulo incondicionado [US]) o la asociación con estímulos sensoriales (un tono, un estímulo condicionado [CS]). Las pruebas implican dos fases distintas, cada una de las cuales evalúa la mejora en el rendimiento motor durante 4 días, durante los cuales los ratones se someten a una sesión de 42 ensayos consecutivos por día. En la fase inicial, los ratones son entrenados para navegar por la escalera y evaluar el aprendizaje motor "fino" o "hábil". La segunda fase consiste en ensayos intercalados en los que se presenta un obstáculo en forma de peldaño superior en el camino del animal en movimiento. La perturbación puede ser inesperada para evaluar el aprendizaje motor "desafiado" (ensayos solo en EE. UU.) o anunciada por un tono auditivo para evaluar el aprendizaje motor "asociativo" (ensayos emparejados).

La escala Erasmus se ha desarrollado hace relativamente poco tiempo ^2,3. No se ha utilizado ampliamente porque la configuración y optimización del protocolo requirió un esfuerzo específico y fue diseñado específicamente para evaluar el aprendizaje asociativo dependiente de cerebelos sin explorar en detalle su potencial para revelar otros déficits motores. Hasta la fecha, ha sido validado por su capacidad para revelar alteraciones motoras sutiles relacionadas con la disfunción cerebelosa en ratones 3,4,5,6,7,8. Por ejemplo, los ratones knockout de conexina36 (Cx36), donde las uniones gap están deterioradas en las neuronas olivarias, muestran déficits de disparo debido a la falta de acoplamiento electrotónico, pero el fenotipo motor había sido difícil de precisar. Las pruebas realizadas con la escalera de Erasmus sugirieron que el papel de las neuronas olivareras inferiores en una tarea de aprendizaje motor cerebeloso es codificar con precisión la codificación temporal de los estímulos y facilitar las respuestas dependientes del aprendizaje a eventos inesperados ^3,4. El ratón knockout de ribonucleoproteína 1 mensajero del cromosoma X frágil (Fmr1), un modelo para el síndrome del cromosoma X frágil (SXF), exhibe un deterioro cognitivo bien conocido junto con defectos más leves en la formación de la memoria de procedimiento. Los knockouts de Fmr1 no mostraron diferencias significativas en los tiempos de paso, los pasos en falso por ensayo o la mejora del rendimiento motor durante las sesiones de la Escalera Erasmus, pero no lograron ajustar su patrón de marcha al obstáculo que aparece repentinamente en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT), lo que confirma déficits específicos de memoria asociativa y de procedimiento ^3,5. Además, las líneas mutantes de ratón específicas de células con defectos en la función cerebelosa, incluida la alteración de la producción de células de Purkinje, la potenciación y la producción de interneuronas o células granulosas de la capa molecular, mostraron problemas en la coordinación motora con la adquisición alterada de patrones de pasos eficientes y en el número de pasos dados para cruzar la escalera⁶. El daño cerebral neonatal provoca déficits de aprendizaje cerebelosos y disfunción de las células de Purkinje que también podrían detectarse con la Escalera Erasmus ^7,8.

En este video, presentamos una guía completa paso a paso, que detalla la configuración de la sala de comportamiento, el protocolo de prueba de comportamiento y el posterior análisis de datos. Este informe está elaborado para ser accesible y fácil de usar y está diseñado específicamente para ayudar a los recién llegados. Este protocolo proporciona información sobre las diferentes fases del entrenamiento motor y los patrones motores esperados que adoptan los ratones. Por último, el artículo propone un flujo de trabajo sistemático para el análisis de datos utilizando un potente enfoque de regresión no lineal, con valiosas recomendaciones y sugerencias para adaptar y aplicar el protocolo en otros contextos de investigación.

Protocolo

En el presente estudio, se utilizaron ratones adultos (2-3 meses de edad) C57BL/6J de ambos sexos. Los animales fueron alojados de dos a cinco por jaula con acceso ad libitum a alimentos y agua en una unidad de animales bajo observación y se mantuvieron en un ambiente con temperatura controlada en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la normativa europea y española (2010/63/UE; RD 53/2013) y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Generalitat Valenciana y el comité de bienestar animal de la Universidad Miguel Hernández.

1. Configuración de la sala conductual

1. Reserve la sala de pruebas de comportamiento todos los días a la misma hora y establezca la lista y el orden de los ratones que se utilizarán, así como los arreglos para su alojamiento.
2. Mantenga a los ratones experimentales fuera de la sala de pruebas para que no escuchen los sonidos del compresor de aire y los tonos de la escalera Erasmus cuando no estén siendo probados.
3. Compruebe que todos los componentes del sistema Erasmus Ladder están en orden y listos para su uso: el router de red, el ordenador con el software (véase la tabla de materiales), el compresor de aire, dos cajas de portería y la escalera con los peldaños correctamente colocados.
4. Limpie exhaustivamente las cajas de meta, la escalera y los peldaños con agua después de cada animal y con agua y etanol al 70% al final de cada día de entrenamiento.

2. Protocolo de prueba de comportamiento

1. Cree un experimento e introduzca el protocolo en el software (Figura complementaria S1).
   1. Encienda el software.
   2. Para crear un experimento, elija Archivo | Nuevo experimento | Nuevo o configurado | Protocolo de experimento.
      NOTA: El protocolo predeterminado, utilizado en este estudio, se denomina EMC y fue diseñado en el Centro Médico de la Universidad Erasmus, Rotterdam.
   3. Asigne un nombre al experimento y haga clic en Aceptar.
   4. Compruebe que el protocolo de CEM predeterminado seleccionado consta de 4 días de sesiones sin interrupciones (42 pruebas sin interrupciones por día) y 4 días de sesiones de provocación (42 pruebas mixtas diarias: sin interrupciones, solo CS (tono), solo US-solo (obstáculo), emparejado (obstáculo anunciado por tono) (consulte la Figura 1B). En el panel lateral derecho, compruebe también la señal de luz (duración máxima de 3 s), la señal de aire (duración máxima de 45 s) y el viento de cola (Sí en todos los tipos de prueba), utilizados para animar al ratón a cruzar la escalera, y el tono (250 ms, Sí solo en pruebas de solo CS y emparejadas).
   5. Para crear un protocolo diferente, elija Set up | Protocolo de experimento | Nuevo | Desde cero o Copiar desde el protocolo EMC y simplemente modificarlo, editando las líneas de la tabla relacionadas con el número de sesiones (días de experimento) y el número y tipo de ensayos por día.
      NOTA: El tiempo de reposo, el tipo de señales y la activación, la duración, la intensidad y el intervalo también se pueden adaptar de acuerdo con las preguntas experimentales.
   6. Para abrir la lista de sesiones y asignar un nombre a los asuntos, elija Configuración | Lista de sesiones.
   7. Haga clic en Agregar temas y variables.
   8. Ingrese cada identificador de ratón específico, fecha de nacimiento, sexo, genotipo y categorías relevantes, siguiendo la lista ordenada de ratones.
2. Inicie la sesión (Figura complementaria S2).
   1. Antes de comenzar, verifique que el software esté abierto y luego encienda la escalera.
   2. Compruebe que el compresor de aire esté conectado y encendido.
   3. Para abrir la ventana Adquisición, abra el Experimento creado.
   4. Elija Adquisición | Adquisición abierta.
   5. Coloque el ratón con el identificador indicado por el software en la casilla de meta inicial (lado derecho de la escalera).
   6. Seleccione el identificador del mouse que desea adquirir en la primera sesión.
   7. Haga clic en Iniciar adquisición.
   8. Presione la perilla roja del menú de la escalera 3 veces. Compruebe que la sesión se inicia y controla y registra automáticamente los movimientos del ratón hasta el final de la última prueba de la sesión.
3. Finalice la sesión.
   1. Compruebe que al final de la^42ª prueba, la pantalla muestra los mensajes Envío de datos y Adquiridos.
   2. Regresa el ratón a la jaula de origen.
   3. Limpia la escalera y las cajas de meta.
   4. Coloque el siguiente ratón y repita desde el paso 2.2.6 en adelante.
4. Realice el tipo de sesión seleccionado todos los días hasta el final del protocolo. Repita los pasos 2.2 y 2.3 todos los días de acuerdo con el protocolo seleccionado.
5. Exporte los datos (Figura complementaria S2).
   1. Para visualizar los datos registrados, elija en el menú Análisis, Estadísticas de ensayo, Estadísticas de sesión y Estadísticas y gráficos de grupo.
      NOTA: Los datos se pueden descargar como una hoja de cálculo con los datos de los ensayos individuales y las medias de los mismos tipos de ensayos dentro de una sesión. Las sesiones también se pueden filtrar por variables elegidas para un análisis específico.
   2. Haga clic en el botón Exportar en la esquina superior derecha eligiendo el formato de archivo (hoja de cálculo) y la ubicación de la carpeta.
   3. Haga clic con el botón derecho en los gráficos generados automáticamente y seleccione Guardar en archivo como *.jpg.

3. Análisis de datos

NOTA: La escalera Erasmus mide automáticamente una lista de parámetros basada en el registro instantáneo de las actividades de los sensores sensibles al tacto. Para el análisis, los parámetros de salida seleccionados por el usuario se organizan y procesan en las hojas de cálculo. Junto con los gráficos generados por software, los usuarios pueden generar gráficos utilizando el software de gráficos de su elección para visualizar cambios específicos en diferentes parámetros a lo largo de las sesiones.

1. Elija parámetros específicos para analizar la motivación basal o los estados de ansiedad, las respuestas sensoriales, el rendimiento motor y el aprendizaje de la motricidad fina durante los primeros 4 días.
   1. Seleccione y represente los parámetros de control, incluido el tiempo de descanso en el cuadro de la portería y el tiempo para salir de la caja de la portería después del período de descanso en respuesta a las señales de luz y aire (Figura 2A).
      NOTA: Los tiempos de reposo o la respuesta a las señales son relativamente constantes en los ratones WT. Otros parámetros, como la frecuencia de salida, son básicamente insignificantes en los ratones WT: los animales rara vez salen de la caja de descanso sin las señales o regresan una vez en la escalera, lo que resulta en frecuencias de salida iguales a 1 por ensayo. Si un animal sale antes de que se apliquen las señales, se activa un flujo de aire que obliga al ratón a volver al área de la portería; Esto no se cuenta como una prueba por parte del software.
   2. Seleccione y represente el tiempo en la escalera después de las señales, medido como el tiempo que se tarda en cruzar la escalera una vez que el ratón abandona el cuadro de la portería (Figura 2B).
      NOTA: Una regresión no lineal de potencia es un método robusto para evaluar el aprendizaje. Los coeficientes de Pearson o Spearman (R) proporcionarán una medida de si el ajuste de los datos es bueno (valores de R cercanos a uno cuando los animales aprenden/mejoran a lo largo de las sesiones; Los valores de R cercanos a 0 implican que los datos son constantes y los ratones no aprenden).
   3. Seleccione y represente los parámetros del patrón de pasos , como el porcentaje de ensayos con pasos en falso como parámetro de aprendizaje sensible (Figura 2C).
      1. Defina un paso correcto como un paso de un peldaño alto a otro peldaño alto (H-H), independientemente de la longitud del paso. Considere los tipos de pasos que implican un peldaño inferior como pasos en falso.
      2. Divida los pasos correctos y los pasos en falso en pasos cortos y largos, pasos hacia atrás y saltos dependiendo de la longitud y direccionalidad del paso entre los peldaños presionados (véase la Figura 1A).
2. Seleccione y grafique parámetros específicos para evaluar el aprendizaje motor desafiante (ensayos solo en EE. UU.) y el aprendizaje asociativo (ensayos emparejados) durante los últimos 4 días.
   1. Seleccione y represente gráficamente el tiempo en la escalera después de las indicaciones (Figura 3).
   2. Seleccione y grafique el porcentaje de ensayos con pasos en falso (Figura 4A).
   3. Seleccione y represente gráficamente los tiempos de paso previos y posteriores a la perturbación, definidos como una diferencia de precisión de ms entre la activación del peldaño justo antes (paso de control) y después del obstáculo (paso adaptado) en el mismo lado de la escalera (Figura 4B).
      NOTA: Se debe realizar un análisis de los tiempos de paso antes y después de la perturbación para comparar los datos dentro de cada tipo de sesión. El parámetro mide la capacidad de los ratones para predecir y superar los obstáculos durante el aprendizaje asociativo.
3. Analice los datos con un software estadístico dedicado (por ejemplo, SigmaPlot). Realice un análisis de regresión no lineal de potencia de los datos recopilados del mismo tipo de ensayo en todas las sesiones para describir el proceso de aprendizaje de manera más eficiente y utilice ANOVA de medidas repetidas (RM) bidireccionales para comparar entre los tipos de ensayo.

Resultados

En la Figura 1 se presentan el dispositivo, la configuración y el protocolo aplicados de Erasmus Ladder. El protocolo consta de cuatro sesiones ininterrumpidas y cuatro sesiones de desafío (42 ensayos cada una). Cada prueba es una carrera en la escalera entre las casillas de meta inicial y final. Al comienzo de la sesión, se coloca un ratón en una de las casillas de inicio. Después de un tiempo establecido de 15 ± 5 s (estado de "reposo"), la luz se enciende (cue 1, durante un máximo de 3 s)...

Discusión

La Escalera Erasmus presenta grandes ventajas para la evaluación del fenotipo motor más allá de los enfoques actuales. Las pruebas son fáciles de realizar, automatizadas, reproducibles y permiten a los investigadores evaluar varios aspectos del comportamiento motor por separado utilizando una sola cohorte de ratones. En el presente estudio, la reproducibilidad permitió la generación de datos robustos con un pequeño número de ratones WT aprovechando las características del dispositivo, el diseño experimental y los métodos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones C57BL/6J (Mus musculus)	Charles Rivers
Dispositivo Erasmus Ladder	Noldus, Wageningen, Países Bajos
Software Erasmus Ladder 2.0	Noldus, Wageningen, Países Bajos
Software Excel	Microsoft
Sigmaplot software	Systat software, Inc.