Artículo de método

Medición de cambios en la integridad de la barrera endotelial cerebral con dos biosensores basados en impedancia en respuesta a células cancerosas y citocinas

DOI:

10.3791/65959

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22 de septiembre de 2023

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1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 2Centre for Brain Research, University of Auckland, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

En este artículo

Resumen

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Aquí demostramos la técnica de uso de biosensores basados en impedancia: ECIS y cellZscope, para medir la fuerza de la barrera endotelial cerebral. Detallamos la preparación y técnica de adición de diversos estímulos a un modelo in vitro del endotelio cerebral. Medimos, registramos y damos un análisis representativo de los hallazgos.

Resumen

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La barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) protege el parénquima cerebral contra patógenos dañinos en la sangre. La BHE consiste en la unidad neurovascular, que comprende pericitos, procesos astrocíticos del pie y células endoteliales fuertemente adheridas. Aquí, las células endoteliales del cerebro forman la primera línea de barrera contra los patógenos transmitidos por la sangre. En enfermedades como el cáncer y la neuroinflamación, los factores circulantes en la sangre pueden alterar esta barrera. La progresión de la enfermedad empeora significativamente después de la disrupción de la barrera, lo que permite el acceso o el deterioro de regiones del cerebro. Esto empeora significativamente el pronóstico, particularmente debido a las limitadas opciones de tratamiento disponibles a nivel cerebral. Por lo tanto, los estudios emergentes tienen como objetivo investigar posibles terapias que puedan evitar que estos factores perjudiciales en la sangre interactúen con las células endoteliales del cerebro.

Los instrumentos Electric Cell-Substrate Impedancia Sensing (ECIS) y cellZscope, disponibles en el mercado, miden la impedancia a través de monocapas celulares, como el endotelio BBB, para determinar su resistencia de barrera. Aquí detallamos el uso de ambos biosensores en la evaluación de la integridad de la barrera endotelial cerebral tras la adición de diversos estímulos. De manera crucial, destacamos la importancia de su capacidad de alto rendimiento para la investigación concurrente de múltiples variables y tratamientos biológicos.

Introducción

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En este artículo se discuten las tendencias actuales en la evaluación de las células microvasculares. En concreto, detallamos el uso de dos plataformas disponibles en el mercado para medir las propiedades de barrera de las células endoteliales microvasculares cerebrales. Las células endoteliales son células que se encuentran frente a la sangre, que recubren la pared de los vasos. Sin embargo, los microvasos cerebrales son únicos, ya que ayudan a formar la barrera hematoencefálica protectora (BBB)1,2,3. La función BBB es regular el transporte de moléculas de la sangre al cerebro. Las enfermedades periféricas que afectan al sistema nervioso central (SNC) suelen estar relacionadas con un fallo funcional de la BHE 4,5. Las estructuras anatómicas que forman la BHE no están presentes en la interfaz sanguínea y tejido en otras partes del cuerpo6. Estas estructuras anatómicas comprenden los pericitos, que se encuentran cerca de las células endoteliales cerebrales, y regulan su proliferación y permeabilidad; procesos astrocíticos del pie, que están involucrados en la mezcla de nutrientes y el soporte anatómico 7,8; la microglía, que son los macrófagos residentes en el cerebro, a menudo implicados en la neuroinflamación y la isquemia 9,10,11,12, y el endotelio cerebral, que forma una monocapa de células fuertemente adheridas sin fenestraciones13,14. El endotelio cerebral se conoce típicamente como la "barrera endotelial cerebral" y forma una barrera estructural y funcional de cinco maneras distintas. En primer lugar, el componente de la barrera paracelular se forma por adhesión en las uniones laterales célula-célula. En segundo lugar, el componente de barrera transcelular se sostiene mediante la regulación de la endocitosis. En tercer lugar, una membrana basal especializada ancla y sostiene el endotelio a través de una rica matriz extracelular compuesta en gran parte por colágeno15,16. Los dos últimos mecanismos se encuentran a través de enzimas y transportadores que ayudan a regular el metabolismo de los fármacos y la absorción de moléculas grandes, respectivamente17.

Las interacciones paracelulares forman el componente principal de la barrera endotelial cerebral, facilitada por uniones estrechas (TJs), que comprenden proteínas de membrana claudinas, ocludina y moléculas de adhesión de uniones (JAMs)18. La fuerte unión homotípica de las proteínas de membrana forma la primera barrera estructural, aunque las JAMs también se unen a las proteínas accesorias zonula occludens, uniendo así las TJs al citoesqueleto de actina 19,20. Los enlaces de actina colocan las TJ en la región apical del endotelio21, que polariza funcionalmente las células endoteliales para formar la barrera estructural en este lado apical o "orientado hacia la sangre". En la región basolateral del endotelio, las uniones adherentes (AJ) altamente especializadas desempeñan un papel regulador en el mantenimiento de la morfología celular. Las AJ comprenden cadherinas dependientes de calcio, que unen el citoesqueleto de las células endoteliales vecinas a través del complejo de la familia de las cateninas20,22. La cadherina endotelial vascular (VE-Cadherin) es una de esas cadherinas, que regula la expresión de las proteínas TJ y la función general de la barrera endotelial para mantener la integridad de la monocapa endotelial 23,24,25,26,27. Los moduladores inflamatorios, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), señalan la internalización de la VE-cadherina lejos de las uniones celulares, lo que conduce a la desestabilización de la barrera endotelial 28,29,30. La molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM)31 es otra cadherina AJ que estabiliza y remodela las uniones endoteliales32,33. La densidad de estas proteínas de unión restringe el flujo de electrones a través del espacio paracelular entre las células endoteliales. Este atributo se utiliza para medir la fuerza de la barrera endotelial o la resistencia eléctrica transendotelial (TER) a través de monocapas celulares confluentes como el endotelio cerebral.

Los estudios terapéuticos se centran en el endotelio cerebral debido a su papel vital en la interfaz hematoencefálica. Varias enfermedades afectan negativamente al endotelio cerebral, incluidas las afecciones neuroinflamatorias como la esclerosis múltiple, el accidente cerebrovascular, las enfermedades neurodegenerativas y el cáncer 34,35,36,37. Una vez que se rompe la barrera endotelial cerebral, la progresión de la enfermedad empeora significativamente, ya que el cerebro se expone efectivamente a los estímulos dañinos en la sangre38. Hemos demostrado previamente que los mediadores inflamatorios y las células de melanoma metastásico alteran la barrera endotelial cerebral mediante el uso de dos tecnologías que miden la fuerza de la barrera endotelial 39,40,41.

La detección eléctrica de impedancia de sustrato de celda (ECIS) es un biosensor basado en impedancia que permite la evaluación en tiempo real y sin etiquetas de la integridad de la barrera de células endoteliales. Aquí, los pocillos de ensayo están revestidos con electrodos chapados en oro, lo que introduce corriente alterna (CA) en el sistema de ensayo. Las células endoteliales del cerebro se siembran en estos pocillos, lo que significa que la CA se puede aplicar a través de las células. (Figura 1A-pozo; vista lateral). Esto establece el circuito eléctrico, que se utiliza para calcular la impedancia (Figura 1A-diagrama de circuitos). La impedancia aumenta cuando las células endoteliales del cerebro se adhieren a la placa y comienzan a formar sus uniones paracelulares. La impedancia se estabiliza cuando las células endoteliales se vuelven confluentes, formando una monocapa y restringiendo el flujo de corriente. La aplicación de CA a diferentes frecuencias influye en la ruta del flujo de corriente a través de las células endoteliales. La corriente fluye a través del cuerpo de la célula endotelial cuando se aplica a una frecuencia más alta (>10,4 Hz). Esto proporciona información sobre la capacitancia de la monocapa de la célula, que se utiliza para evaluar la unión y la propagación de la célula. A bajas frecuencias (102-10 4 Hz) la impedancia de la membrana es alta, lo que restringe el flujo de corriente a través de las células. En este caso, la mayor parte de la corriente navega entre las celdas. Aproximadamente a 4.000 Hz, la resistencia al flujo de corriente se atribuye principalmente a las uniones endoteliales célula-célula, a través del espacio intercelular . Por lo tanto, cualquier cambio en la resistencia a esta frecuencia proporciona información sobre la integridad de la barrera endotelial.

Si bien las mediciones de impedancia bruta pueden proporcionar información sobre las propiedades de la barrera, el software ECIS puede modelar matemáticamente la resistencia total medida en múltiples frecuencias de CA y, de manera más precisa, separarla en dos parámetros clave de integridad de la barrera. Estos parámetros son la resistencia paracelular entre las membranas laterales de las células vecinas (resistencia beta-Rb; barrera paracelular; Figura 1A-flechas verdes), y la resistencia basolateral entre la capa de células basales y el electrodo (resistencia alfa-alfa; barrera basolateral; Figura 1A-flechas azules). Un tercer parámetro modelado también se mide como la capacitancia de la membrana celular (Cm; Figura 1A-flechas rojas). El Cm muestra el flujo capacitivo de corriente a través de las células, indicativo de la composición de la membrana celular. En este trabajo, los cambios en la Rb o barrera paracelular indican alteraciones en las TJs y AJs, cruciales para mantener la integridad de la barrera endotelial. Para interpretar de manera confiable el Rb, se hacen cuatro supuestos clave, desarrollados por Giaever y Keese42 y discutidos críticamente por Stolwijk et al.43. Aunque estas suposiciones son importantes para garantizar la validez del modelo ECIS, se cumplen fácilmente con una monocapa endotelial confluente.

Al igual que ECIS, el cellZscope permite la medición de cambios en la resistencia de la barrera endotelial; sin embargo, las células se cultivan en un inserto de membrana porosa. En este sistema, el circuito eléctrico se encuentra entre dos electrodos a cada lado de un inserto de membrana. La monocapa endotelial se cultiva en la parte superior de este inserto de membrana, lo que permite la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TER) (Figura 1B; vista lateral). Al igual que con ECIS, en este sistema, la impedancia total se puede atribuir a varios componentes de barrera, dependiendo de la frecuencia de corriente aplicada44. A bajas frecuencias, la capacitancia del electrodo (CEl) domina la impedancia total del sistema. Alternativamente, a altas frecuencias, la resistencia del medio (medio R) domina la impedancia total. Por lo tanto, las mediciones más útiles se encuentran dentro del rango de frecuencia media (102-10 4 Hz), que proporciona información sobre dos componentes clave de la barrera endotelial (Figura 1B-diagrama de circuito). Primero, a 103-10 4 Hz, la capacitancia de la capa celular (CCl) domina la impedancia general, ya que la resistencia de la membrana (membrana R) es lo suficientemente alta como para ser descuidada, y la corriente fluye predominantemente a través del condensador. Por lo tanto, el CCl indica cambios en la resistencia a través de la membrana celular. Alternativamente, TER imparte predominantemente la impedancia general a 102-10 3 Hz, donde el flujo de corriente se canaliza a través de espacios de unión entre células vecinas, unidas por proteínas de unión. Por lo tanto, esto proporciona información sobre el componente paracelular de la barrera endotelial, como se ha visto anteriormente con Rb en ECIS.

La figura 1C detalla cómo regiones específicas del endotelio cerebral se ven alteradas por el tratamiento con células de melanoma. Esta interrupción es detectada por los biosensores mediante un cambio en el flujo de corriente a través del espacio paracelular (medido como Rb o TER); el espacio basolateral (medido como Alfa); y la membrana celular (medida como C, m o CCl). Utilizamos los dos biosensores detallados en esta introducción para medir el cambio de la barrera endotelial cerebral después del tratamiento con diversos estímulos como citocinas o células de melanoma invasivo. La resistencia medida disminuye si un estímulo dado rompe la barrera endotelial, creando un camino de menor resistencia para permitir el flujo de corriente. Por lo tanto, una disminución en la "resistencia de la barrera" sugiere pérdida de la integridad de la barrera o interrupción de la barrera endotelial cerebral. En estos ensayos, hemos estudiado esta disrupción interpretando la resistencia y modelando parámetros en tiempo real. La aplicación de ECIS y cellZscope para abordar tales preguntas de investigación se detalla en otra parte 39,41,45,46.

La investigación in vitro permite el descubrimiento de mecanismos cruciales de la enfermedad mediante la revelación de moléculas y vías funcionales que hacen progresar la enfermedad. Sin embargo, esto requiere una replicación confiable de la enfermedad in vitro, que difiere sustancialmente de un cuerpo funcional. En un escenario ideal, la investigación in vitro debería ser reproducible, no invasiva, sin etiquetas, cuantitativa e imitar las influencias estructurales encontradas in vivo. En este artículo, detallamos la metodología para utilizar estas dos tecnologías en competencia para medir los cambios inducidos por el tratamiento en la integridad de la barrera endotelial cerebral. Discutimos las ventajas de combinar sus resultados para proporcionar una imagen más completa de la disrupción de barreras y compartimos las limitaciones que aún deben superarse.

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Protocolo

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1. Uso de ECIS para monitorear cambios en la integridad de la barrera endotelial cerebral en respuesta a diversos tratamientos

  1. Configuración del software, la estación de matriz y la máquina
    1. Conecte la estación de matriz de 96 pocillos a la máquina. Coloque la estación del array en una bolsa de plástico y colóquela en la incubadora al menos 1 h antes del ensayo para permitir que se caliente. Retira la bolsa de plástico inmediatamente antes del experimento.
    2. Una vez listo, encienda la máquina y abra el software correspondiente en la computadora. Presione el botón Configuración en la pestaña Recopilar datos . El software completará una verificación de conexión, que detectará el tipo de adaptador conectado (por ejemplo, una estación de matriz de 96 pocillos) y mostrará pocillos rojos en el mapa de placas representado. Esto indica que el software detecta el adaptador pero no puede detectar una placa conectada. El sistema ya está listo para la placa de 96 pocillos.
  2. Preparación de la placa del biosensor de 96 pocillos
    NOTA: Se utiliza la disposición de placa de 96 pocillos. La base de cada pocillo está modelada con dedos interdigitados de electrodos chapados en oro. Las placas vienen en paquetes estériles que solo deben abrirse en una campana estéril / gabinete de seguridad biológica. Los electrodos de oro primero deben estabilizarse químicamente agregando 10 mM de cisteína para mantener la capacitancia del electrodo.
    1. Prepare la cisteína de 10 mM en un recipiente estéril y, con un tubo multicanal, pipetee cuidadosamente 100 μL en cada pocillo. Incubar la cisteína durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego aspirar con cuidado, pipeteando solo en los bordes del pocillo, para evitar rayar el electrodo. Lave la cisteína al menos 2 veces con agua desionizada estéril (no PBS) utilizando la misma técnica de pipeteo.
      NOTA: Los electrodos de placa también se pueden estabilizar eléctricamente utilizando medios calientes en el aparato ECIS, en lugar de usar un recubrimiento de cisteína, como se detalla en el protocolo del fabricante.
    2. Prepare el sustrato de ECM para que actúe como una membrana basal en el fondo del pozo.
      NOTA: Los sustratos de ECM como el colágeno o la laminina pueden elegirse en función de los requisitos de la línea celular endotelial cerebral. Aquí utilizamos colágeno para una línea celular endotelial microvascular cerebral humana (hCMVEC).
    3. Preparar 1 μg/cm2 de colágeno de cola de rata disuelto en ácido acético 0,02 M en un comedero fresco y estéril (100 μL por pocillo). Deje el colágeno durante 1 h con poca luz en la campana estéril, luego lave 2 veces cuidadosamente con agua desionizada y pipeteo cuidadoso.
      NOTA: Asegúrese de eliminar la mayor cantidad de agua desionizada con el mayor cuidado posible después del último lavado y deje que la placa se seque en la campana. Se recomienda utilizar la placa poco después del recubrimiento; sin embargo, puede almacenarse en agua a 4 °C temporalmente (menos de una semana). La placa ya está lista para su uso.
  3. Preparación de las células endoteliales cerebrales para la siembra en la placa biosensora de 96 pocillos
    NOTA: Se recomienda optimizar primero la fase de crecimiento y la densidad de siembra de la línea celular endotelial que se va a utilizar. En este protocolo se utilizó la línea hCMVEC, que tarda 48 h en alcanzar la confluencia después de sembrar a 20.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos.
    1. Recoja las células endoteliales del cerebro en una campana estéril utilizando un reactivo de disociación suave y realice un recuento celular preciso. Utilice 20.000 hCMVEC en 100 μL de medio por pocillo para una fase de crecimiento constante durante 48 h. Prepare el exceso de células endoteliales cerebrales para garantizar un pipeteo óptimo de los 96 pocillos.
      NOTA: Por lo tanto, para una placa de 96 pocillos, se necesitan aproximadamente 2.000.000 de células en 10 ml de medios precalentados.
    2. Transfiera las células endoteliales cerebrales a un canal estéril fresco y, con una pipeta multicanal, agregue cuidadosamente 100 μL (20,000 células) de la suspensión celular por pocillo. Vuelva a suspender las células suavemente en el canal con regularidad para evitar que las células endoteliales se asienten con el tiempo. Asegúrese de que 1 pocillo tenga solo medios y ninguna celda para permitir el modelado matemático (pocillo sin celdas) y que toda la placa se siembre dentro de los 30 s.
  4. Inicio del experimento
    1. Fije con cuidado la placa al adaptador de la incubadora moviendo los clips rojos a ambos lados del adaptador de placa hacia afuera. Alinee el pocillo A1 de la placa con la región A1 del adaptador. Sostenga suavemente la placa en su lugar con una mano en la parte superior y vuelva a colocar los clips rojos en su lugar con la otra mano.
      NOTA: Asegúrese de que la placa esté estable en el adaptador.
    2. Cierre la incubadora y vuelva a pulsar Configuración . Busque pozos verdes en el mapa de placas que indiquen los pozos detectados correctamente. Los pozos que se muestran en rojo tienen un error de conexión. Para solucionar esto, vuelva a colocar la placa rápidamente,
      NOTA: El tiempo excesivo dedicado a tratar de arreglar pozos con conexiones deficientes puede comprometer la salud de la celda.
    3. Presione Check para volver a verificar los accesorios como lecturas de impedancia absoluta. Esto tomará varios minutos.
    4. Presione la flecha debajo del mapa de placas para asegurarse de que se seleccione el catálogo de placas correcto. En este caso, es 96w20idf.
    5. Presione el botón multifrecuencia para asegurarse de que la impedancia se mida en múltiples frecuencias de CA para permitir futuros modelos matemáticos.
    6. Presione Iniciar para comenzar el experimento. Permita que las células proliferen durante ~ 48 h y formen su monocapa típica de alta resistencia, medida por un aumento en los ohmios.
  5. Tratamiento de las células endoteliales del cerebro con células cancerosas o citocinas en la placa de 96 pocillos
    NOTA: Dado que la placa de 96 pocillos permite realizar pruebas simultáneas de múltiples estímulos, prepare un mapa claro de la placa con las opciones de tratamiento deseadas (Figura complementaria S1-abajo). Cada tratamiento puede y debe ser llevado a cabo al menos por triplicado (tres pocillos replicados) para permitir análisis estadísticos; sin embargo, se muestran cuatro réplicas en Figura complementaria S1.
    1. A las 48 h, comprobar el crecimiento de las células endoteliales cerebrales. Asegúrese de alcanzar una meseta antes de preparar las soluciones de tratamiento.
      NOTA: Las diferentes líneas celulares endoteliales pueden tardar diferentes períodos de tiempo en alcanzar una meseta. Por lo tanto, su fase de crecimiento y densidad de siembra deben optimizarse antes de realizar este experimento. Por lo general, los pozos deberían estabilizarse en la misma hora. De lo contrario, podrían estar comprometidos o pipeteados incorrectamente y no deben incluirse.
    2. Para el tratamiento con citocinas, prepare concentraciones apropiadas de las citocinas en medios completos precalentados junto con sus controles de vehículos y medios relevantes.
      1. Prepare las citocinas a 2 veces la concentración final deseada, ya que se diluirán 1:1 cuando se agreguen a cada pocillo que contenga células endoteliales cerebrales.
      2. Para permitir que cada tratamiento se realice por triplicado, prepare todas las citocinas en más de 300 μL de volumen total (es decir, al menos 350 μL en total), para la adición de tratamiento de 100 μL por pocillo.
    3. Para el tratamiento con células, recoja las células (tres líneas celulares diferentes de melanoma derivadas del paciente utilizadas en este protocolo) con un reactivo de disociación suave y realice un recuento celular preciso. Realizar tratamientos basados en células con las principales proporciones efectora:objetivo (relaciones E:T) de 1:1 donde las células de tratamiento son las células efectoras (por ejemplo, células de melanoma) y las células endoteliales del cerebro son las células objetivo, es decir, agregue 20.000 células de melanoma a 20.000 células endoteliales cerebrales por pocillo.
      1. Diluido en serie para proporciones E:T más pequeñas de 1:10 o 1:100 cuando sea necesario. Para permitir el tratamiento en pocillos triplicados, cuente las células y prepárelas en más de 300 μL de volumen total (es decir, al menos 350 μL en total) para la adición de tratamiento de 100 μL por pocillo.
    4. Etiquete los tubos de grupo de polipropileno de 1.1 mL, que vienen en formato de tira de 8 tubos (es decir, tubos de tira de 1 mL), de acuerdo con el mapa de placas de 96 pocillos (Figura suplementaria S1-Top). Inserte los tubos de tira en las placas de tubos de tira y autoclave antes del experimento. Añada el volumen total de citocinas o células de tratamiento (es decir, 350 μL completos de tratamiento) a los tubos de tiras estériles y déjelos en la incubadora para que se mantengan calientes.
    5. En el software, presione Pausa para pausar el experimento. Esto puede tardar unos segundos en completarse. Una vez en pausa, abra la incubadora y suelte con cuidado ambos clips rojos con una mano mientras estabiliza la placa con la otra mano. Mantenga el experimento en pausa y acerque la placa a la campana estéril.
    6. Retire los tubos de las tiras de tratamiento de la incubadora. Con una pipeta multicanal, vuelva a suspender con cuidado el contenido de los tubos de la tira de tratamiento y, a continuación, añada 100 μL de tratamiento de los tubos de la tira a los pocillos correctos de la placa de 96 pocillos sin tocar el fondo del pocillo. Agregue cuidadosamente el tratamiento a todos los pocillos y medios solo al pocillo libre de células y complete este paso en menos de 5 minutos para obtener una placa completa de 96 pocillos, ya que el enfriamiento excesivo afectará la resistencia de la monocapa endotelial.
    7. Regrese la placa tratada a la máquina, conéctela como se hizo anteriormente y luego verifique las conexiones de los electrodos al adaptador nuevamente presionando Configuración | Compruébalo.
    8. Asegúrese de que se han seleccionado los ajustes correctos de catálogo de placas y adquisición multifrecuencia, y pulse Reanudar para reanudar el experimento. Permita que el experimento progrese y ejecútelo hasta el punto de conexión deseado.
    9. Pulse Finalizar para completar el experimento, que guarda automáticamente el archivo abp grabado. Vaya a Archivo | Exporte datos para recuperar este archivo como xls. o CSV. para su posterior análisis.

2. Uso de cellZscope para monitorear cambios en la integridad de la barrera endotelial cerebral en respuesta a varios tratamientos

  1. Preparación de los componentes metálicos, el adaptador y el inserto de membrana porosa del aparato
    1. Limpie los componentes metálicos secuencialmente con agua desionizada, luego etanol al 70% y luego nuevamente con agua desionizada.
    2. Esterilizar en autoclave el electrodo inferior o "ollas" y los electrodos de inmersión superiores y esterilizar todos los demás componentes del módulo de celda con etanol al 70%.
    3. En una campana estéril, instale los 24 electrodos inferiores/"ollas" atornillándolos en el módulo de celda, teniendo cuidado de mantener la esterilidad en todo momento.
    4. Agregue 900 μL de medio base a los pocillos.
      NOTA: Se agrega un medio base al pocillo inferior, que actúa como el compartimento basal del endotelio. Se recomienda no utilizar suero en este compartimento para replicar de forma más fiable el entorno basal del endotelio cerebral.
    5. Conecte los electrodos de inmersión magnéticamente a la tapa del módulo de celda y cierre la tapa sobre los pocillos para que los electrodos de inmersión encajen en los recipientes de electrodos inferiores.
    6. Conecte el módulo de celdas al adaptador en una incubadora y déjelo durante al menos 1 h para que se equilibre. En esta etapa, abra el software para cargar el mapa de placas experimental en la pestaña Diseño , incrustando así el mapa de placas de tratamiento en los archivos, que finalmente contendrán los datos.
    7. Cuando se requiera recubrimiento, recubra los insertos de membrana en una cubierta estéril utilizando una placa de cultivo estéril de 24 pocillos para sujetar los insertos y agregando el sustrato de ECM (por ejemplo, colágeno) a la sección interna del pocillo, como se detalla en la sección 1.2.3 Utilice una pipeta de un solo canal para cargar el sustrato de ECM en cada pocillo con cuidado.
  2. Preparación de las células endoteliales del cerebro para su siembra en el inserto de membrana e inicio del experimento
    1. Recolectar y contar las células endoteliales cerebrales según la sección 1.3, pero preparar la valoración celular final requerida en un tubo centrífugo de 50 mL. Asegúrese de que las células recolectadas estén en medios completos y calientes, incluidos todos los factores de crecimiento y suero necesarios.
    2. Con una pipeta monocanal, siembre cuidadosamente las células endoteliales cerebrales (80.000 en este protocolo) en la cámara apical de un pocillo insertado en 350 μL de medio completo.
    3. Incluya un pocillo libre de células pipeteando medios completos solo en uno de los insertos.
    4. Retire el módulo de células de la incubadora y colóquelo en la campana estéril. Transfiera los insertos preparados a los recipientes de electrodos inferiores con un par de pinzas para manejar solo los soportes superiores del inserto. Evite que se formen burbujas debajo de la membrana.
    5. Vuelva a colocar el módulo de celdas en la incubadora sobre el adaptador.
    6. En el software, en la pestaña del experimento , en la sección Espectro , seleccione Iniciar a 1 Hz y Detener a 100 kHz para adquirir datos en todo el rango de frecuencias; Seleccione Pasos finos .
    7. En Tiempo de espera, seleccione 15 minutos para permitir mediciones continuas a la velocidad más rápida realizada por el software.
    8. Presione Inicio para comenzar el experimento y permitir que las células endoteliales del cerebro proliferen y formen una monocapa con alta resistencia. Este paso dura aproximadamente 48 h.
  3. Tratamiento de las células endoteliales del cerebro con células cancerosas y citocinas en los insertos de la membrana
    1. A las 48 h, prepare las citocinas o células de tratamiento (por ejemplo, células de melanoma) según la sección 1.5, incluida la realización de recuentos celulares cuando corresponda, y recoja en tubos de tiras de 1 ml o equivalente.
    2. Prepare el tratamiento en las concentraciones correctas para agregar 70 μL a cada pocillo (inserto). Coloque los tratamientos en la incubadora para mantener el calor.
    3. Dado que el instrumento aquí indicado realiza mediciones cada 15 minutos, elija un tiempo de tratamiento que comience inmediatamente después de que se complete la medición. En este momento, retire el módulo de celdas de la incubadora y límpielo suavemente con etanol al 70% con toallitas sin pelusa.
    4. En una campana estéril, abra el módulo de células y pipetee cuidadosamente 70 μL del tratamiento en la cámara apical del inserto correspondiente. Hazlo con una pipeta monocanal y añádela con movimientos circulares, evitando que queden burbujas. Complete este paso en menos de 10 minutos para devolver el módulo de celda al adaptador antes de que comience la siguiente medición.
    5. Pulse Detener para finalizar el experimento. Exporte los datos directamente a un xls. en el archivo Archivo | Asigne un nombre a este archivo y guárdelo correctamente después de abrirlo.

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Resultados

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Interpretación de los datos de impedancia ECIS

Comprensión de las condiciones experimentales óptimas
Aquí, los datos se pueden ver directamente utilizando el software (Figura 2A) o exportarse para su análisis y trazado gráfico (Figura 2B). La Figura 2A muestra un ejemplo de los datos que se muestran en la interfaz de software real. El gráfico de la izquierda mue...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los estudios terapéuticos sobre las enfermedades que afectan a la BHE deben tener en cuenta la importancia de la integridad y regulación de la barrera endotelial cerebral. Por ejemplo, la ruptura de la barrera endotelial cerebral se investiga críticamente en la metástasis del cáncer al cerebro desde otros sitios anatómicos. Esto se debe a que el endotelio cerebral forma la primera barrera contra las células tumorales circulantes. Como se mencionó anteriormente en la introducción, los estudios in vitro sobre la i...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akshata Anchan fue financiada por la Fundación Neurológica de Nueva Zelanda para la Beca Gillespie (referencia de la subvención: 1628-GS) y la Primera Beca (referencia de la subvención: 2021 FFE). El costo de la investigación también fue financiado parcialmente por la Beca de la Fundación Neurológica-2021 FFE y el Fondo de Desarrollo de Investigación de la Facultad de la Universidad de Auckland. James Hucklesby fue financiado por una beca de la Fundación de Investigación Médica de Auckland. Gracias al equipo de Baguley y al Centro de Investigación de la Sociedad Oncológica de Auckland por las líneas celulares NZM de melanoma de Nueva Zelanda derivadas de pacientes.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
aMEMGibco12561072Melanoma base celular cell base
media cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I— cola de rataGibcoA1048301sustrato ECM para recubrimiento
dibutiril-cAMPSigma-AldrichD0627Suplemento de medios endoteliales
cerebrales ECIS array  Biofísica AplicadaECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha matriz de biosensores
de medición ECIS plate  Biofísica Aplicada96W20idf Placa biosensor de 96 pocillos
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Suplemento de medios endoteliales cerebrales
hCMVECMateriales Biológicos AplicadosT0259Línea celular endotelial cerebral
hEGFPeproTechPTAF10015100Suplemento de medios endoteliales cerebrales
HeparinaSigma-AldrichH-3393Cerebro suplemento de medios endoteliales
hFGFPeproTechPTAF10018B50Suplemento de medios endoteliales para el cerebro
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Suplemento de medios endoteliales para el cerebro
IL-1βPeproTech200-01BCitocina
Insulina-Transferrina-Selenito de SodioSigma-Aldrich11074547001Suplemento de medios celulares para melanoma
M199Gibco11150-067 Medios debase de células endoteliales cerebrales
Agua MilliQ Aguadesionizada
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACitocina
Inserto TranswellCorning CLS3464 Insertode membrana porosa
TrypLE Express EnzimaGibco12604021Reactivo de disociación

Referencias

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