Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Resumen

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Resumen

Un reto importante para comprender las causas de la infertilidad femenina es dilucidar los mecanismos que gobiernan el desarrollo de las células germinales femeninas, llamadas ovocitos. Su desarrollo está marcado por el crecimiento celular y las posteriores divisiones, dos fases críticas que preparan al ovocito para la fusión con los espermatozoides para iniciar la embriogénesis. Durante el crecimiento, los ovocitos reorganizan su citoplasma para posicionar el núcleo en el centro de la célula, un evento predictivo del desarrollo exitoso de los ovocitos en ratones y humanos y, por lo tanto, de su potencial embriogénico. En los ovocitos de ratón, se demostró que esta reorganización citoplasmática está impulsada por el citoesqueleto, cuya actividad genera fuerzas mecánicas que agitan, reposicionan y penetran en el núcleo. En consecuencia, esta transmisión de fuerza citoplasmática a nucleoplasmática sintoniza la dinámica de los orgánulos de procesamiento de ARN nuclear conocidos como condensados biomoleculares. Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar, con alta resolución temporal, el impacto del citoesqueleto en el núcleo a través de escalas espaciales en ovocitos de ratón. Se detallan los pasos y herramientas de imagen y análisis de imágenes necesarias para evaluar i) la actividad citoesquelética en el citoplasma del ovocito, ii) la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito y iii) sus efectos sobre la dinámica del condensado biomolecular en el nucleoplasma del ovocito. Más allá de la biología de los ovocitos, los métodos elaborados aquí se pueden adaptar para su uso en células somáticas para abordar de manera similar el ajuste de la dinámica nuclear basado en citoesqueletos a través de escalas.

Introducción

El posicionamiento nuclear es esencial para múltiples funciones celulares y de desarrollo 1,2,3,4,5. Las células germinales femeninas de mamíferos llamadas ovocitos remodelan su citoplasma para posicionar el núcleo en el centro de la célula a pesar de sufrir una división asimétrica en tamaño, que depende del descentrado posterior del cromosoma⁶ (Figura 1). Este centrado del núcleo predice el desarrollo exitoso de los ovocitos en ratones y humanos ^7,8 y, por lo tanto, su potencial embriogénico (Figura 1).

La remodelación citoplasmática en ovocitos de ratón es impulsada principalmente por el citoesqueleto de actomiosina⁹ (Figura 2). Su actividad genera fuerzas mecánicas que agitan, reposicionan y penetran en el núcleo¹⁰ (Figura 2). En consecuencia, esta transmisión de fuerza citoplasmática a nucleoplasmática sintoniza la dinámica de los orgánulos de procesamiento de ARN mensajero nuclear llamados motas nucleares¹¹, uno de los varios orgánulos sin membrana en el núcleo conocidos como condensados biomoleculares 12,13,14,15,16 (Figura 2).

Las imágenes en vivo han sido decisivas para descifrar las implicaciones funcionales de la agitación nuclear. Las películas de migración nuclear a lo largo de horas, así como las películas de alta resolución temporal de la malla de actina y el citoplasma a granel, contribuyeron en gran medida a la elaboración de un modelo teórico para el posicionamiento nuclear, vinculando diferentes escalas de tiempo⁹. Además, las películas de alta resolución temporal del citoplasma, el contorno nuclear y los componentes nucleares como la cromatina y los condensados nucleares, destacaron el papel de la agitación del núcleo basada en el citoesqueleto en el procesamiento del ARN y la expresión génica en ovocitos de ratón, uniendo diferentes escalas espacio-temporales dentro de la célula^10,11. En conjunto, este enfoque de cruce de escalas basado en imágenes en vivo proporcionó la primera justificación que vincula la agitación citoesquelética del núcleo con el éxito del desarrollo de los ovocitos.

El protocolo proporciona la línea de imágenes y análisis de imágenes utilizada para estudiar la transmisión de las fuerzas citoplasmáticas (generadas principalmente por la actina F y en parte por los microtúbulos) al núcleo y sus componentes internos en los ovocitos de ratón. El resultado de estos experimentos es capturar el continuo de fuerzas a través de escalas espaciales, desde el citoesqueleto en el citoplasma hasta el interior nuclear a través de películas de alta resolución temporal, como se muestra en dos estudios recientes ^10,11, que establecieron el vínculo entre los movimientos citoplasmáticos activos, las fluctuaciones del contorno nuclear, así como el movimiento y las fluctuaciones superficiales de un solo tipo de condensados biomoleculares nucleares: motas nucleares. El mismo enfoque puede aplicarse a otros sistemas modelo en los que se espera que cambien las fuerzas citoplasmáticas, como en el contexto de las células cancerosas malignas¹⁷.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea y fueron aprobados por el Ministerio de Agricultura francés (autorización Nº 75-1170) y por la Dirección General de Investigación e Innovación (DGRI; Acuerdo OMG número DUO-5291). Los ratones se alojaron en el animalario en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con una temperatura ambiente de 22-24 °C y una humedad del 40%-50%. Los ratones utilizados aquí incluyen hembras OF1 (Oncins France 1, 8 a 12 semanas de edad) y hembras C57BL/6 (10 a 14 semanas de edad).

1. Recolección y preparación de ovocitos

1. Recolectar ovocitos de ratones de 8 a 14 semanas de edad como se describe en¹⁸ y¹⁹.
   1. Brevemente, primero extraiga los ovarios de ratones como en¹⁸ en medio precalentado (37 °C) M2 + Albúmina sérica bovina (BSA) suplementado con 1 μM de milrinona¹⁹, que evita la reanudación de la meiosis en los ovocitos.
   2. Punción de los folículos ováricos con agujas quirúrgicas para liberar los ovocitos en crecimiento de los folículos antrales (fin del crecimiento de los ovocitos²⁰).
   3. Recolectar ovocitos del tamaño necesario para experimentos (ovocitos en crecimiento y/o completamente desarrollados) con una micropipeta especializada para la recolección de ovocitos, antes de lavarlos y pasar a platos con medio fresco bajo aceite mineral.
2. Disociar mecánicamente los ovocitos de las células foliculares antrales pipeteando hacia arriba y hacia abajo y dejar estabilizar durante 1 h en el incubador a 37 °C antes de continuar con los siguientes pasos experimentales.
   NOTA: Los ovocitos se mantienen a 37 °C durante todas las etapas experimentales. Para este protocolo, se recolectaron los ovocitos más grandes, que son los adultos.

2. Microinyección de ovocitos

NOTA: Para capturar la actividad basada en el citoesqueleto en el citoplasma, se utilizan imágenes en vivo de campo claro. Por lo tanto, no es necesaria la microinyección de marcadores fluorescentes, y el protocolo se puede reanudar en el paso 3. Para obtener imágenes del contorno nuclear, se utilizó Rango, una sonda que mostraba la etiqueta YFP en su extremo N y una etiqueta CFP en su extremo C^21,22. Cuando se obtiene una imagen en ovocitos a 488 nm, marca todo el núcleo, excepto el nucléolo²³, y muestra un contorno nuclear muy nítido. Para visualizar las motas nucleares, se utilizó SRSF2-GFP (NM_011358), un marcador de motas nucleares¹¹. El mismo medio se utiliza para la recolección de ovocitos, la microinyección, la traducción complementaria de ARN y la obtención de imágenes de células vivas.

1. Linealizar plásmido Rango con SfiI o plásmido SRSF2-GFP con enzimas de restricción AgeI.
2. Sintetizar los ARN complementarios tapados (ARNc) con el kit de transcripción in vitro adecuado según el promotor (T3 para Rango y T7 para SRSF2-GFP) y purificarlos utilizando un kit de purificación en columna, como se ha descrito anteriormente²⁴.
   NOTA: ARN de poliadenilato SRSF2-GFP utilizando un kit de poliadenilación para aumentar la estabilidad del ARNc. Se utilizan dos promotores diferentes debido a las diferencias en la columna vertebral del plásmido.
3. Mida las concentraciones de ARNc con un espectrofotómetro de microvolúmenes.
4. Diluir el ARNc de Rango a 1000 ng/μL y el ARNc de SRSF2-GFP a 600 ng/μL en_dH2O.
5. Centrifugar la alícuota de ARNc a 4 °C durante al menos 60 min a 25.000 x g antes de la microinyección.
6. Inyectar los ARNc que codifican para YFP-Rango o SRSF2-GFP como se describe en^11,25 en el citoplasma de los ovocitos en medio M2+ BSA+Milrinona a 37 °C utilizando un microinyector.
7. Incubar los ovocitos durante al menos 2 h en medio de cultivo a 37 °C para la traducción del ARNc.
8. Depositar los ovocitos en gotas pequeñas (5 μL) del medio de cultivo en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con fondo de vidrio cubierto con aceite mineral. Colocar un ovocito por gota para evitar el fotoblanqueo de los ovocitos vecinos.

3. Obtención de imágenes de células vivas

NOTA: Los ovocitos vivos de ratón se examinaron con un microscopio confocal invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite Plan-APO 40x/1,25 NA, una plataforma de exploración motorizada, una cámara de incubación (37 °C), una cámara CCD acoplada a una rueda de filtros y un disco giratorio. Las imágenes de alta resolución temporal se adquieren utilizando Metamorph (en lo sucesivo, el software de imágenes) en el modo de adquisición de flujos.

1. Abra la ventana Adquirir del software de creación de imágenes.
2. Establezca el tiempo de exposición en 500 ms, el área de la cámara en Full Chip y el binning en 1.
3. En la pestaña Adquirir , defina la iluminación para el canal deseado. Para obtener imágenes de la actividad citoplasmática, ilumine los ovocitos con luz transmitida. Para obtener imágenes del núcleo marcado con YFP-Rango o SRSF2-GFP, ilumine ovocitos con una longitud de onda de excitación de 491 nm.
4. Para la agitación citoplasmática o los experimentos de YFP-Rango, concéntrese en el nucléolo del ovocito que se puede observar fácilmente con luz transmitida (Figura 3A). Se adquirirá un solo avión. En el caso de los experimentos de motas nucleares, concéntrese en las gotas de SRSF2-GFP (Figura 3C).
5. En la pestaña Especial , establezca los parámetros para optimizar la velocidad de adquisición como se muestra a continuación.
   Obturador de la cámara: Abierto para la exposición
   Modo de borrado: CLEAR PRESEQUENCE
6. Abra la ventana Adquisición de flujos del software de generación de imágenes. Establezca los parámetros de transmisión de acuerdo con el experimento. Para ambos estudios ^10,11, utilizar los parámetros que se describen a continuación.
   1. En la pestaña Adquirir , establezca los siguientes parámetros.
      Modo de adquisición: Transmisión a RAM
      Número de fotogramas: 480 (se puede reducir a 240 fotogramas para reducir el tiempo de imagen)
      Parámetros de la cámara: Adquisición de imágenes a velocidad de fotogramas
      Número (Nb) de fotogramas a omitir: 0
   2. En la pestaña Parámetros del controlador de cámara digital , defina los siguientes parámetros.
      Estado de la cámara: HALT
      Modo de obturador: ABRIR NUNCA
      Modo de borrado: CLEAR PRESEQUENCE
      Nº de fotogramas a promedio: 1
      NOTA 1: En el modo Stream, una vez ajustado el tiempo de exposición, la duración del vídeo viene determinada por el número de fotogramas. Por ejemplo, un tiempo de exposición de 500 ms y 480 fotogramas generan una película de 4 min. Se puede mostrar una vista previa durante la adquisición de la imagen.
7. Ajuste una región de interés (ROI) alrededor del objeto. Minimizar el área del ROI reduce el tiempo de adquisición.
8. Haga clic en Adquirir en la ventana Adquisición de transmisión para iniciar la película.
9. Guarde la película como un archivo .tif al final de la adquisición.
   NOTA: Para seguir las estructuras nucleares durante las películas de alta resolución temporal, las sondas nucleares (YFP-Rango y SRSF2-GFP) deben tener una alta relación señal-ruido para facilitar la segmentación de los objetos durante los pasos posteriores del análisis de imágenes. Los perfiles de expresión exógenos de SRSF2-GFP deben ser comparables a los de las inmunotinciones de motas nucleares endógenas (Figura 3C-D). Los cambios en los perfiles de expresión de SRSF2-GFP en relación con la tinción endógena pueden reflejar altas dosis de inyección y traducción de ARNc²⁶ (Figura 3C-D).

4. Análisis de imágenes: Agitación citoplasmática

NOTA: La agitación citoplasmática que refleja la intensidad de la actividad citoesquelética basada en actina en los ovocitos se determina mediante análisis de correlación de imágenes utilizando un software de una publicación anterior del laboratorio⁹ y disponible el²⁷. El software mide la cantidad de intensidades de píxeles que se conservan entre imágenes consecutivas. El resultado es la pérdida de correlación entre las imágenes en el tiempo, comenzando en 1 y disminuyendo exponencialmente con el tiempo, como en⁹.

1. Alinee imágenes de lapso de tiempo sin procesar (Δt = 0,5 s) utilizando el complemento Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Para instalar el complemento StackReg²⁸, habilite el sitio de actualización²⁹ de BIG-EPFL para obtener acceso al complemento.
2. Calcule las correlaciones de imágenes de campo claro en 3 a 4 regiones citoplasmáticas de ~300 μm² siguiendo los pasos a continuación.
   1. Recorte las regiones y guárdelas como archivos de película independientes. Abra la ventana Terminal.
   2. Escriba ovocito, presione la barra espaciadora y, a continuación, presione Entrar. Aparece una ventana llamada Señal y ranura. Elija los archivos de película recortados que se analizarán.
      NOTA: Se pueden seleccionar varias películas al mismo tiempo.
3. La aplicación devuelve archivos en la misma carpeta que las películas. Se generan tres archivos diferentes con extensiones .csv, .eps y .xls. El archivo .xls contiene los datos para dibujar las gráficas de correlación de una región. Valores de correlación promedio de diferentes regiones dentro de una celda.
4. Para fines de claridad visual, transforme los valores finales de correlación restando el valor de cada punto de tiempo de 1 para obtener una curva exponencial invertida como en ¹¹.

5. Análisis de imágenes: Mapas vectoriales citoplasmáticos

NOTA: Los mapas vectoriales de citoplasma de ovocitos de ratón fueron generados por el complemento³⁰ de espectroscopia de correlación de imágenes espaciotemporal (STICS) implementado previamente para detectar flujos citoplasmáticos en ovocitos^{de ratón 31} en Fiji ³² y disponible en ³³. Los mapas muestran la magnitud y dirección de la velocidad del flujo citoplasmático, como en⁹ y¹¹.

1. Convierta imágenes time-lapse de campo claro (Δt=0,5 s) a formato de 32 bits.
2. Vuelva a alinear las imágenes con el complemento Fiji StackReg en Complementos > StackReg y elija Transformación de cuerpo rígido .
3. Con la pila de complementos resta la media móvil jru v2 (en las herramientas Detrend de la suite de complementos STICS), deshazte de las estructuras estacionarias en la película restando la imagen promediada en el tiempo de la película. Marque las casillas Restar promedio estático y Subpila de salida, seleccione Mantener promedio espacial y establezca el período en 5.
4. Dibuja un ROI alrededor del ovocito, excluyendo la corteza para evitar los efectos de borde del complemento.
5. Inicie el complemento STICS map jru V2 (en herramientas ICS), con un tamaño de subregión de 32 píxeles, un tamaño de paso de 16 píxeles, un desplazamiento temporal STICS de 3, desplazamientos X e Y de 0, un multiplicador de velocidad de 8, un umbral de magnitud de 0 y casillas de verificación de Normalizar longitud de vector, Vectores centrales, Velocidades de salida y Usar máscara de película.
   NOTA: El plugin genera un mapa del ovocito en formato .tif, mostrando los flujos citoplasmáticos como vectores con colores que indican las amplitudes de flujo, como en⁹ y¹¹, y un archivo excel con las velocidades de flujo medidas.

6. Análisis de imágenes: Fluctuaciones del contorno nuclear

NOTA: Las fluctuaciones del contorno nuclear que reflejan la agitación de la membrana nuclear pueden determinarse a partir de películas de núcleos marcados con YFP-Rango (Figura 4A, C). El análisis de imágenes para las fluctuaciones del contorno nuclear requiere Fiji y la instalación de los complementos StackReg (habilitar el sitio de actualización BIG-EPFL²⁹ para obtener acceso al complemento StackReg), PureDenoise³⁴ y Ovocyte_nucleus. El complemento StackReg realiza el registro de imágenes para corregir un posible movimiento global. El plugin PureDenoise elimina el ruido de las imágenes multidimensionales corrompidas por el ruido mixto de Poisson-Gaussian y suaviza el contorno nuclear. El complemento Ovocyte_nucleus umbraliza la señal y llena el agujero correspondiente al nucléolo para crear una máscara de núcleo binario, realinearla con StackRreg y calcular la distancia r desde el centroide de la máscara del núcleo hasta la circunferencia de la máscara para todos los ángulos θ (θ° de 0° a 360° en incrementos de 1°), como en la Figura 4. Todos los códigos para estos complementos se pueden encontrar en ³⁵.

1. En Fiji, en el menú Plugins > CIRB > Verlhac , seleccione Forma de núcleo de ovocito.
2. En el cuadro de diálogo, realice la siguiente selección.
   1. Seleccione la carpeta que contiene las películas que desea analizar.
   2. Seleccione el ángulo θ (se puede elegir un valor de 1° a 360° y se utilizó un valor de 1° para una resolución óptima del contorno), los márgenes para el recorte (se recomienda 5 μm para mantener todo el núcleo).
   3. Seleccione la calibración XY y el intervalo de tiempo. Haga clic en Aceptar.
      NOTA: Los resultados se proporcionan como archivos .xls en una carpeta de salida en la carpeta que contiene las películas originales. Este archivo muestra todos los radios medidos para cada tiempo t y cada ángulo θ. En la Tabla complementaria 1 se proporciona un ejemplo de archivo de salida. La carpeta out también contiene una película de la máscara del núcleo.
3. Usando una hoja de cálculo, calcule el radio medio R en todos los puntos de tiempo t para cada ángulo θ definido. Esto permite trazar la forma media a lo largo del tiempo (Figura 4B). Véase el ejemplo de la Tabla Suplementaria 2.
4. Para cada t y θ, reste el radio medio R a lo largo del tiempo del radio r. La varianza (r-R)² es una medida de las fluctuaciones de la envoltura nuclear.
5. Calcule la media de las fluctuaciones para todos los puntos de tiempo t y todos los ángulos θ para cada núcleo y, finalmente, para todos los núcleos de una condición.
   NOTA: Cuando la forma de los núcleos se altera significativamente, como en el caso de un citoesqueleto alterado, los núcleos marcados con YFP-Rango se rotan en Fiji para orientar la parte lisa hacia arriba y la invaginación hacia abajo, antes de proceder con el análisis de las fluctuaciones del contorno nuclear, como en¹⁰.

7. Análisis de imágenes: Movimientos de moteado nuclear (dinámica difusiva)

NOTA: El análisis del movimiento de las motas nucleares permite deducir el tipo de dinámica (impulsada, difusiva o confinada) de esos orgánulos a partir de sus trazas.

1. Seleccione imágenes en modo de flujo de ovocitos que expresan gotitas de SRSF2-GFP que se mueven principalmente en el eje X-Y.
2. Corrección del blanqueamiento de imágenes time-lapse de ovocitos que expresan SRSF2- GFP utilizando el método de coincidencia de histogramas en Fiji (Imagen > Ajuste > Corrección de blanqueo).
3. Vuelva a alinear las imágenes con el complemento Fiji StackReg.
4. Realice un seguimiento de los centros de gotas SRSF2-GFP utilizando el complemento Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Presione Agregar pista para iniciar el seguimiento y presione Finalizar pista cuando haya terminado. No active la corrección de centrado.
5. Copie las pistas en un archivo de hoja de cálculo para continuar con los cálculos de desplazamientos cuadráticos medios (MSD) temporales como en ¹¹, y calcule los MSD temporales a partir de cada trayectoria de gota de 20 s.
6. Ajuste de curvas (msd(t) = beta x t^α) con el método de Nelder-Mead utilizando el software R para estimar el exponente de difusión alfa (α).
7. Medir el coeficiente de difusión efectiva para poder comparar las diferentes condiciones ya que se espera que la difusión sea anómala (α< 1).
8. Calcular el coeficiente de difusión efectivo D_eff a partir de un ajuste lineal (alfa=1) en los 40 primeros puntos (20 s) de la curva temporal MSD y normalizar por tamaño de gota (D_eff en μm²/s x 3/2 πr en μm).

8. Análisis de imágenes: Fluctuaciones de la superficie de las motas nucleares

NOTA: La evolución del contorno del moteado nuclear en el tiempo, una lectura de la transmisión de fuerza activa en estos orgánulos, se midió con un complemento personalizado Radioak³⁶ para su uso en Fiji y disponible en³⁷. El plugin extrae los valores de los radios de una selección dada para todos los ángulos alrededor del centro de selección. La variación de la forma a lo largo del tiempo se midió comparando el valor del radio en relación con su valor promedio para cada ángulo. El plugin permite cuantificar las fluctuaciones de forma y ofrece una opción para visualizar estas dinámicas. Para instalarlo, descargue el archivo Radioak_.jar y colóquelo en la carpeta de complementos de Fiji. Reinicie Fiji. Este complemento es una versión actualizada del complemento utilizado para analizar las fluctuaciones del esquema nuclear anterior e implementar una canalización comparable.

1. En las películas de flujo de gotas SRSF2-GFP, seleccione gotas más grandes de tamaños comparables (radio ~2,5 μm).
   NOTA: Si las gotas son demasiado pequeñas, una resolución insuficiente dará lugar a mediciones aberrantes de fluctuación de la superficie.
2. Recorte imágenes time-lapse de gotas que abarquen 15 s (Δt= 0,5 s) dibujando un rectángulo alrededor de la gota y seleccione Imagen > Recortar (Figura 5).
3. Vuelva a alinear las imágenes con el complemento Fiji StackReg en Complementos > StackReg y elija Transformación de cuerpo rígido .
4. Suavizar imagen para eliminar el ruido alrededor de la gota utilizando la opción Suavizar de Fiji en Procesar.
5. Cree una máscara binaria de gota usando la opción Convertir en máscara en Fiji en Procesar > binario. Utilice el método Predeterminado y Oscuro para el fondo (Figura 5).
6. Analice la máscara de gota binaria generada utilizando la opción Analizar partículas en Fiji en las opciones Analizar, seleccione Borrar resultados y Agregar al administrador y guarde la región de intereses (ROI) en el RoiManager (Más > Guardar) en formato zip para que Radioak la lea. Los ROI deben guardarse en una carpeta llamada contours en la misma carpeta de las películas, en archivos llamados imagename_UnetCortex.zip para que Radioak encuentre cada película.
7. En el menú Fiji Plugins > CIRB > Radioak , seleccione Obtener radios para procesar una sola película o Hacer una carpeta para analizar todas las películas de la misma carpeta.
   NOTA: Aparece una ventana para seleccionar el número de ángulo y la escala. Radioak se lanzó con incrementos de ángulo de 1° de 0° a 360° (entrada de 360) y se extrajeron los valores de los radios.
8. Seleccione la película o la carpeta que contiene las películas que desea analizar. Los resultados se proporcionan como archivos .xls (uno para cada película) en un directorio de radioakres en la carpeta que contiene las películas originales. Cada archivo muestra todos los radios medidos r (en μm si se rellenó el parámetro de escala) para cada tiempo t (en corte) y cada ángulo (en radianes; Figura 5; véase un ejemplo de .xls producto en el Cuadro suplementario 3).
9. En la hoja de cálculo, calcule el radio medio R en todos los puntos de tiempo t para cada ángulo definido (véase el ejemplo en la Tabla complementaria 4). Esto permite trazar la forma media a lo largo del tiempo.
10. Represente la varianza (r-R)² en μm² que corresponde a la medida de las fluctuaciones de la superficie de las gotas.

Resultados

Los paneles de imágenes de la Figura 3 muestran ejemplos de un ovocito adulto típico (Figura 3A), el nucleoplasma de un ovocito completamente desarrollado que expresa YFP-Rango (Figura 3B), el nucleoplasma de un ovocito completamente desarrollado que expresa un (panel izquierdo; Figura 3C) o un excesivo (panel derecho; Figura 3C) dosis de ARNc SRSF2-GFP, y una inmunotinción de motas nucleares en un ovocito completamente desarrollado utilizando el anticuerpo SC35 (Figura 3D). La dosis correcta de ARNc de SRSF2-GFP para microinyectar se definió a partir de comparaciones visuales entre los perfiles de expresión de SRSF2-GFP con perfiles endógenos de motas nucleares.

Las fuerzas de agitación citoplasmática en los ovocitos, como lo demuestra el trabajo previo del laboratorio utilizando mapas vectoriales STICS y análisis de correlación de imágenes (ver⁹ y¹¹), pueden disminuir por perturbaciones del citoesqueleto, tanto genéticas (p. ej., ratón mutante FMN2) como químicas (p. ej., citocalasina D). Los mapas STICS de ovocitos de control muestran numerosos vectores, con colores que indican altas velocidades de flujo, mientras que los mapas de ovocitos con fuerzas citoesqueléticas interrumpidas muestran menos vectores, con colores que indican bajas velocidades de flujo. Del mismo modo, la correlación de la imagen se pierde muy rápidamente en los ovocitos de control en comparación con los ovocitos con fuerzas citoesqueléticas alteradas. Esto es observable en las curvas de correlación, con una disminución más rápida de la curva para los ovocitos de control en comparación con los ovocitos con fuerzas citoesqueléticas alteradas⁹ o un aumento más rápido cuando la curva está invertida¹¹.

Las fuerzas citoesqueléticas agitan el núcleo y sus orgánulos interiores, en particular los condensados nucleares como las motas nucleares^10,11. En la Figura 4A, el núcleo de los ovocitos control está sometido a importantes fluctuaciones periféricas, que son visibles utilizando la sonda nuclear YFP-Rango. La forma del núcleo en los ovocitos con fuerzas citoesqueléticas alteradas es estable en el tiempo (Figura 4C). El análisis de las fluctuaciones del contorno nuclear es clave para cuantificar con precisión la agitación. Al determinar la varianza de la distancia desde el centroide del núcleo hasta su periferia, (r-R)² (Figura 4B), se pudieron cuantificar las fluctuaciones, mostrando que la agitación nuclear es 6 veces mayor en los ovocitos control que en los ovocitos con fuerzas citoesqueléticas alteradas¹⁰. En la Figura 5A-B, se muestran las manchas nucleares (gotas SRSF2-GFP⁺) en contextos de control y disrupción de fuerzas citoplasmáticas a alta resolución temporal. En los controles, la superficie de las gotas fluctúa significativamente más que las superficies de las gotas en los ovocitos con fuerzas citoplasmáticas alteradas, que se pueden visualizar y cuantificar utilizando el complemento Radioak³². Visualmente, los colores verde y rojo (la salida de Radioak se ve en las imágenes inferiores de la Figura 5A-B) indican ángulos en los que el complemento detectó cambios en la superficie entre imágenes consecutivas y el blanco indica una falta de cambios en la superficie.

Figura 1: Ilustración de la ovogénesis tardía del ratón y la embriogénesis temprana. Ilustración del centrado del núcleo que se produce en el crecimiento tardío de los ovocitos, el descentrado cromosómico que se produce durante la división de los ovocitos y los primeros pasos (estadios de 1 y 2 células) de la embriogénesis. Los genomas femeninos (núcleo de ovocitos y pronúcleo femenino) están en rosa, el pronúcleo masculino está en azul. Los núcleos embrionarios (después de la fusión de los genomas parentales) son de color púrpura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ilustración de la remodelación citoplasmática y nuclear a través de escalas en ovocitos de ratón en crecimiento. Esta figura resume los hallazgos clave de ^9,10,11. Ilustración de la remodelación del citoplasma basada en actomiosina, la agitación nuclear y la remodelación funcional del condensado biomolecular nuclear a través de escalas espaciotemporales. La remodelación de las manchas nucleares mejora las reacciones biomoleculares asociadas con su función (es decir, el empalme del pre-ARNm). Obsérvese que este protocolo permite la evaluación de la agitación nuclear sólo a través de escalas espaciales, pero no temporales, ya que todas las imágenes se realizan con la misma resolución temporal de 0,5 s entre fotogramas de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de muestra del ovocito completamente desarrollado y del nucleoplasma. (A) Imagen de campo claro de un ovocito completamente desarrollado que muestra cromatina (cian) que rodea el nucléolo. Un círculo blanco punteado delinea el núcleo. (B) Núcleo de ovocitos vivos que expresan YFP-Rango; Nótese la ausencia de fluorescencia en el nucléolo. (C) Ejemplo de núcleo de ovocito vivo que expresa SRSF2-GFP después de la microinyección de dosis correctas de ARNc (panel izquierdo) o dosis altas de ARNc (panel derecho); Obsérvese las fases condensadas (gotas) y disueltas a la izquierda y su ausencia en la condición de la derecha. (D) Inmunotinción de motas nucleares en un ovocito fijo; nótese el perfil de expresión endógena que es comparable al de C (panel izquierdo). Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Salidas del complemento de control y fluctuaciones de contorno nuclear interrumpidas. (A) Lapso de tiempo de un núcleo de ovocito de control que expresa YFP-Rango (arriba) y su correspondiente máscara binaria generada por el complemento Ovocyte_nucleus (abajo). (B) Principio de las mediciones de las fluctuaciones del contorno nuclear a lo largo del tiempo y en una dirección dada. Las direcciones se definen mediante un ángulo de giro θ de incremento de 1° de 0° a 360°. Se representan dos formas representativas en t=0 s (amarillo) y t=135 s (morado). La forma azul corresponde a la forma media a lo largo del tiempo. (C) Fluctuaciones del contorno nuclear de un núcleo en un ovocito con fuerzas citoesqueléticas disminuidas debido a la interrupción tanto de la actina F (ratón mutante FMN2) como de los microtúbulos (tratamiento con nocodazol; como en¹⁰). Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Salidas del plugin de control y fluctuaciones interrumpidas de la superficie de las gotas. (A) Recorte de una gota nuclear SRSF2-GFP de control fotografiada a 500 ms por fotograma y mostrada en la Tabla de Búsqueda de Hielo (LUT) (arriba); máscara binaria de la misma gota generada por Fiji (centro); y las salidas del complemento Radioak después del análisis de las fluctuaciones de la superficie de la gota (abajo), con verde y rojo que indican los ángulos en los que el complemento detectó cambios en la superficie entre imágenes consecutivas y el blanco que indica la falta de cambios en la superficie. (B) Fluctuaciones superficiales de una gota nuclear en ovocitos con disminución de las fuerzas citoesqueléticas debido a la interrupción tanto de la F-actina como de los microtúbulos (como en¹¹). Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Ejemplo de Ovocyte_nucleus resultado de análisis de complementos. El mismo núcleo analizado que el que se muestra en la Figura 4A. Theta (θ) es el ángulo en grados y t1 a t600 corresponden al número de fotograma, que se puede convertir en el tiempo. Los radios están en μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Ejemplo de hoja de cálculo utilizada para calcular las fluctuaciones del esquema nuclear. El mismo núcleo analizado que el que se muestra en la Figura 4A. Theta (θ) es el ángulo en grados y t1 a t600 corresponden al número de fotograma, que se puede convertir en el tiempo. Pestaña Sin procesar y promedio: Los radios están en μm. Tab r-R: Las distancias r-R están en μm. Tabla (r-R)²: Los valores de fluctuación se expresan en μm². Las pestañas x e y corresponden a las coordenadas cartesianas de los radios de la pestaña Sin procesar y promedio. Permiten dibujar la forma media del núcleo a lo largo del tiempo en la pestaña de forma media. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Ejemplo de salida de análisis del complemento Radioak. La misma gota analizada que la que se muestra en la Figura 5A. Se muestran los radios medidos en distintos puntos de tiempo y ángulos. Los radios están en μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Ejemplo de hoja de cálculo utilizada para calcular las fluctuaciones de la superficie de las gotas nucleares. La misma gota analizada que la que se muestra en la Figura 5A. Theta (θ) es el ángulo en grados y t1 a t600 corresponden al número de fotograma, que se puede convertir en el tiempo. Pestaña Sin procesar y promedio: Los radios están en μm. Tab r-R: Las distancias r-R están en μm. Tabla (r-R)²: Los valores de fluctuación se expresan en μm². Las pestañas x e y corresponden a las coordenadas cartesianas de los radios de la pestaña Sin procesar y promedio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los pasos clave de este protocolo incluyen la microinyección adecuada de ovocitos sin afectar su supervivencia o función normal ^9,10,11, así como la microinyección de cantidades predefinidas de ARNc que permitan la correcta visualización de estructuras relevantes, como las motas nucleares.

Establecer el vínculo entre la dinámica citoplasmática y la dinámica (intra)nuclear es esencial cuando se estudia cómo el citoesqueleto agita el núcleo o su interior. Este protocolo, con ligeras modificaciones, permite correlacionar las intensidades de agitación citoplasmática con la dinámica nuclear de las gotas YFP-Rango o SRSF2-GFP (como en¹¹). Para continuar, los ovocitos deben ser filmados primero durante 120 s en modo de campo claro para capturar la agitación citoplasmática, antes de ser filmados inmediatamente durante 120 s con un láser de 491 nm para capturar el contorno nuclear o la dinámica de las gotas. En el caso de las gotas nucleares de SRSF2-GFP, la correlación puede evaluarse simplemente comparando sus coeficientes de difusión efectiva (véase el paso 7 de este protocolo) con los valores de intensidad máxima invertida de la agitación citoplasmática obtenidos mediante análisis de correlación de imágenes (véase el paso 4 de este protocolo). Otro punto importante es el tamaño de los condensados elegidos para el análisis de las fluctuaciones de la superficie de las gotas. Se deben seleccionar gotas de un diámetro similar para análisis comparativos para evitar sesgos, ya que el tamaño modula la intensidad de las fluctuaciones de la superficie.

Este protocolo tiene algunas limitaciones. Los análisis de las fluctuaciones del contorno nuclear se basan en la tinción intranuclear completa, como YFP-Rango o NLS-GFP. Para los análisis de motas nucleares, la microinyección de cantidades excesivas de ARNc SRSF2-GFP puede conducir a alteraciones aparentes en las propiedades de separación de fase de este marcador de condensado (Figura 3C), como se revisó previamente por otros²⁶. Por lo tanto, es fundamental verificar que los perfiles de expresión de proteínas exógenas sean comparables a los endógenos. Además, las gotas relativamente pequeñas (radio de <2 μm) deben excluirse de las tuberías de análisis de fluctuación de superficie debido a las limitaciones de resolución espacial con las herramientas definidas aquí. Este problema de resolución generalmente se puede resolver mediante el uso de microscopios más resolutivos que, por ejemplo, podrían ser necesarios para sondear las fluctuaciones superficiales de condensados más pequeños en el núcleo del ovocito o en el núcleo significativamente más pequeño de las células somáticas.

En general, este protocolo permite la captura de la agitación basada en el citoesqueleto de actina y microtúbulos del núcleo del ovocito de ratón a través de escamas. Específicamente, permite la documentación de la movilización del citoplasma basada en citoesqueletos, las fluctuaciones del contorno nuclear, junto con los desplazamientos de motas nucleares de tipo líquido y las fluctuaciones de la superficie. Aunque algunos estudios en otros tipos de células abordan algunas de estas cuestiones 38,39,40 a través de distintos protocolos de diversa complejidad a escalas espaciales individuales, este sencillo protocolo proporciona las herramientas necesarias para abordar por primera vez la dinámica celular mencionada a través de múltiples escalas en una sola línea de trabajo. Además, los datos generados a partir de este enfoque, cuando se complementan con modelos biofísicos como en^10,11, permiten una evaluación mínimamente invasiva de: i) cambios en la mecánica nuclear¹⁰; ii) la transmisión de las fuerzas activas basadas en el citoesqueleto en el citoplasma a los condensados en el núcleo¹¹; y iii) la disipación de esta energía activa a través de diferentes compartimentos celulares^10,11. Es importante destacar que este protocolo es versátil, ya que puede adaptarse no solo a otros condensados nucleares como el nucléolo²³, sino también a otros tipos celulares como las células cancerosas, donde se documentaron cambios en los comportamientos tanto del condensado citoesquelético como del condensado nuclear^17,41.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 disco giratorio	Yokogawa
DMI6000B microscopio	Microinyector Leica
Femtojet	Eppendorf
Fiji
Rueda de filtro	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Imágenes universales,		versión 7.7.9.0
Aceite mineral	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Ratones Thermo Scientific
OF1 y C57BL/6	Kit
	Cámara	Thermo Fisher AM1350
Retiga 3	QImaging
RNAkit fácil	Qiagen	74104
SC35 anticuerpo	Abcam	ab11826	Anticuerpo nuclear moteado; ratón IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plásmido	OriGene Technologies	MG202528
NM_011358 Micropipeta Stripper	XLAB Solutions		especializado en la recolección de ovocitos
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMensaje mMáquina	Thermo Fisher	AM13344
Cámara termostática	Life Imaging Service
Excel	Windows