Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.
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Artículo de método
En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata
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Resumen
Resumen
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten que las técnicas de imagen monitoricen los cambios en el calcio intracelular en las poblaciones celulares objetivo. Su gran relación señal-ruido hace que los GECI sean una poderosa herramienta para detectar la actividad evocada por estímulos en las neuronas sensoriales. Los GECI facilitan el análisis a nivel poblacional de la codificación de estímulos con el número de neuronas que se pueden estudiar simultáneamente. Esta codificación poblacional se realiza de forma más apropiada in vivo. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que albergan el soma de las neuronas sensoriales que inervan las estructuras somáticas y viscerales debajo del cuello, se utilizan más ampliamente para la obtención de imágenes in vivo porque se accede a estas estructuras con relativa facilidad. Más recientemente, esta técnica se utilizó en ratones para estudiar las neuronas sensoriales del ganglio trigémino (TG) que inervan las estructuras orales y craneofaciales. Hay muchas razones para estudiar la TG además de la GRD, incluida la larga lista de síndromes de dolor específicos de las estructuras orales y craneofaciales que parecen reflejar cambios en la actividad de las neuronas sensoriales, como la neuralgia del trigémino. Los ratones se utilizan más ampliamente en el estudio de las neuronas DRG y TG debido a la disponibilidad de herramientas genéticas. Sin embargo, con las diferencias en el tamaño, la facilidad de manejo y las diferencias de especies potencialmente importantes, hay razones para estudiar neuronas TG de rata en lugar de ratón. Por lo tanto, desarrollamos un enfoque para obtener imágenes de neuronas TG de rata in vivo. Inyectamos crías neonatales (p2) por vía intraperitoneal con un AAV que codifica GCaMP6s, lo que resultó en una infección del >90% de las neuronas TG y DRG. La TG se visualizó en el adulto después de la craneotomía y la decorticación, y los cambios en la fluorescencia de GCaMP6s se monitorizaron en las neuronas TG después de la estimulación de las regiones mandibular y maxilar de la cara. Confirmamos que los aumentos de fluorescencia fueron evocados por estímulos con el bloqueo de nervios periféricos. Si bien este enfoque tiene muchos usos potenciales, lo estamos utilizando para caracterizar la(s) subpoblación(es) de neuronas TG cambiadas después de una lesión de los nervios periféricos.
Introducción
La somatosensación, la codificación neuronal de estímulos mecánicos, térmicos y químicos que inciden en la piel u otras estructuras corporales, incluidos los músculos, los huesos y las vísceras, comienza con la actividad de las neuronas aferentes primarias que inervanestas estructuras. Los enfoques electrofisiológicos basados en una sola unidad han proporcionado una gran cantidad de información sobre los subtipos aferentes involucrados en este proceso, así como sobre cómo sus propiedades de estímulo-respuesta pueden cambiar con el tiempo 1,2,3. Sin emb....
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Protocolo
Todos los experimentos que involucraron el uso de animales en investigación se realizaron de acuerdo con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud y la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (protocolo # 22051100). Al final de cada experimento, las ratas fueron sacrificadas a través de la exanguinación con perfusión cardíaca de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS), un enfoque aprobado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y la Universidad de Pittsburgh IACUC.
1. In....
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Resultados
Debido a que anteriormente hemos tenido éxito con el serotipo AAV9 para la infección de neuronas sensoriales de rata15, utilizamos este serotipo para la expresión de GCaMP6s en neuronas TG de rata. Por lo tanto, primero buscamos evaluar la eficiencia de la infección neuronal sensorial de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) cuando este virus se administró a crías de ratas neonatas20. Este virus utiliza el promotor CAG, que impulsa y mantiene altos niveles de expresión gé.......
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Discusión
Aquí, demostramos una forma rápida y no invasiva de generar una rata GECI para obtener imágenes del TG. Elegimos un promotor CAG para impulsar y mantener altos niveles de expresión génica. Si bien estudios previos sugieren que otros serotipos de AAV pueden impulsar eficientemente la expresión génica en las neuronas DRG39, nuestros resultados son consistentes con un estudio reciente que involucra la inyección intraperitoneal de AAV en neonatos32, lo que indica que el serotip.......
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Divulgaciones
El Dr. Gold recibió una beca de Grünenthal durante el desarrollo de esta preparación. No hubo superposición entre el enfoque del estudio de Grünenthal y la preparación descrita en este manuscrito. Ninguno de los otros autores tiene ningún otro conflicto de intereses potencial que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los doctores Kathy Albers y Brian Davis por el uso de su microscopio Leica y su programa Metamorph, a Charles Warwick por ayudar a construir nuestro dispositivo térmico Peltier y al Dr. Raymond Sekula por ayudar a solucionar problemas de preparación quirúrgica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) y R01NS122784 (MSG y RS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 | Addgene | 100844-AAV9 | Virus AAV9-GCaMP6s |
| ACEpromazina maleato | Covetrus | 11695-0095-5 | 10 mg/mL |
| AnaSed (xilacina) inyección | AKORN Animal Health | 23076-35-9 | 20 mg/mL |
| CTR5500 Caja electrónica | Leica | 11 888 820 | Fuente de alimentación |
| Broca de rebaba de pozo cortado | Ransom & Randolph | ¼ redondo | |
| DM 6000 FS | Leica | 11 888 928 | Soporte base |
| EL6000 | Leica | EL6000 | Fuente de luz con bombilla de mercurio de 120 W |
| Pinza | FST | 11252-00 | Dumont No. 05 |
| Friedman rongeurs | FST | 16000-14 tamaño de | copa de 2,5 mm |
| Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16021-14 | 1 mm tamaño de la taza |
| Almohadilla térmica (almohadilla de terapia de temperatura) | STRYKER | 8002-062-022 | |
| Clorhidrato de ketamina | Covetrus | 1695-0703-1 | 100 mg/mL |
| Plan Fluor 20x/0.40 | Leica | MRH00105 | 20x objetivo, 0.4 NA10.8 mm WD |
| Power handle pluma de cauterización de alta temperatura | Bovie | HIT1 | pluma de cauterización de mano Change-A-Tip |
| Prime 95B | Cámara Fotométrica | Prime 95B | CMOS |
| Salina | Fisher Scientific | NC0291799 | 0.9% estéril |
| Hoja de bisturí de | Fisher Scientific | 22-079-701 | tamaño 15 hoja desechable |
| Espátula | BRI | 48-1460 | espátula de cerebro |
| Tijeras de resorte | FST | 91500-09 | Student Vannas, filo de corte de 5 mm |
| Tijeras de resorte | FST | 15012-12 | Noyes, filo de corte de 14 mm |
| STP6000 Panel táctil inteligente | Leica | 11 501 255 | Panel de control |
| Jeringa | Hamilton | 80201 | 25 μ L Modelo 1702 Jeringa Luer Tip Calentador |
| agua | Adroit | HTP-1500 |
Referencias
- Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
- Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
- Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L.
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Reimpresiones y permisos
