Una técnica sencilla de manguito para el trasplante de pulmón izquierdo murino

Resumen

El presente protocolo describe una técnica de manguito para un modelo de trasplante de pulmón izquierdo en ratón. Esta técnica se ha desarrollado a lo largo de varios años y ha funcionado bien, sirviendo eficazmente en la investigación inmunológica.

Resumen

Durante la última década, nuestro laboratorio ha logrado avances significativos en el desarrollo y refinamiento de modelos de trasplante de pulmón de ratón vascularizado utilizando una "técnica de manguito" de trasplante eficiente y altamente confiable. Este artículo describe un método sofisticado y completo para el trasplante pulmonar ortotópico en un modelo de pulmón ortotópico vascularizado, que representa el modelo de trasplante pulmonar de ratón más relevante desde el punto de vista fisiológico y clínico hasta la fecha. El proceso de trasplante consta de dos etapas diferenciadas: la recolección de la donante y la posterior implantación en el receptor. El método se ha dominado con éxito y, con varios meses de formación suficiente, un profesional cualificado puede realizar el procedimiento en aproximadamente 90 minutos de piel a piel. Sorprendentemente, una vez que los individuos superan la curva de aprendizaje inicial, la tasa de supervivencia durante el período perioperatorio se acerca a casi el 100%. El modelo de ratón permite el uso de múltiples cepas de ratones transgénicos y mutantes disponibles en el mercado, lo que permite el estudio de la tolerancia y el rechazo. Además, las características únicas de este modelo lo convierten en una herramienta valiosa para investigar la biología tumoral y la inmunología.

Introducción

Si bien existen terapias de reemplazo, como la diálisis y los dispositivos de asistencia ventricular, para las personas con insuficiencia renal y cardíaca, el trasplante de pulmón sigue siendo la principal opción de tratamiento para los pacientes que padecen enfermedad pulmonar en etapa terminal. Este procedimiento es la única opción que salva vidas para las personas diagnosticadas con fibrosis pulmonar¹. Además, se emplea para prolongar la vida útil de aquellos que enfrentan enfermedades pulmonares obstructivas en etapa terminal como el enfisema, así como aquellos con afecciones supurativas como la fibrosis quística¹.

Si bien las tasas de supervivencia a corto plazo han mejorado debido a los refinamientos técnicos, las mejoras en la atención perioperatoria y los avances en la inmunosupresión, los resultados a largo plazo después del trasplante de pulmón son marcadamente inferiores a los de otros órganos sólidos. La tasa de supervivencia general a cinco años de solo el 50% para los receptores de injertos pulmonares es mucho más baja que para los que reciben aloinjertos de corazón, riñón o hígado¹. Nuestro equipo y otros han sospechado que la razón de tal discrepancia es la falta de modelos biológicos clínicamente relevantes para comprender completamente las vías que conducen al rechazo y/o tolerancia del injerto pulmonar, ya que la manipulación experimental de modelos de ratón fisiológicamente relevantes ha contribuido significativamente a la supervivencia a largo plazo de otros aloinjertos sólidos o celulares².

Antes del desarrollo del modelo de trasplante ortotópico de pulmón en ratones, los investigadores se basaban en modelos animales más grandes para sus estudios. Sin embargo, estos modelos más grandes tenían limitaciones, incluida la falta de mutantes transgénicos necesarios para explorar cuestiones mecanicistas³. Además, los estudios en ratas enfrentaron limitaciones similares⁴, y los modelos de trasplante traqueal heterotópico no vascularizado en ratones también se limitaron a su utilidad⁵. Las investigaciones han demostrado la importancia de utilizar modelos de trasplante vascularizados en lugar de no vascularizados en varios sistemas de órganos. Por ejemplo, los injertos no vascularizados de tejido cardíaco neonatal insertados en el pabellón auricular de ratones receptores carecen de interacción directa con el endotelio vascular y el torrente sanguíneo receptor. Por lo tanto, su relevancia es limitada en comparación con los injertos cardíacos humanos vascularizados⁶. De manera similar, el modelo heterotópico de trasplante traqueal, que carece de vascularización y aireación, difiere significativamente de los trasplantes de pulmón humano, particularmente en los cambios observados en las vías respiratorias pequeñas después del trasplante. Además, el rápido inicio de la oclusión fibrótica en aloinjertos traqueales heterotópicos no refleja las observaciones en pulmones humanos o en injertos pulmonares vascularizados en animales más grandes o ratas⁷.

En nuestro laboratorio de investigación, la creación del modelo de trasplante ortotópico de pulmón en ratón se inspiró en el modelo de trasplante ortotópico de pulmón único establecido en ratas ^8,9. A diferencia de los humanos, los ratones y las ratas poseen un solo lóbulo en su pulmón izquierdo, que constituye apenas el veinticinco por ciento de la masa pulmonar total. Esta característica permite la ejecución exitosa del trasplante pulmonar izquierdo en modelos murinos sin necesidad de soporte circulatorio^10,11. Con el tiempo, hemos introducido modificaciones técnicas en el modelo y, en este contexto, se dilucidan los pasos clave que mejoran la facilidad de realizar el procedimiento.

Más allá de sus implicaciones en la investigación de inmunobiología del trasplante, el modelo de trasplante de pulmón ortotópico de ratón ofrece un instrumento robusto para explorar el papel de las células estromales pulmonares no hematopoyéticas en diversos procesos patológicos. Esto ocurre porque un trasplante de pulmón único singénico mutante conduce a un reemplazo casi completo de las células hematopoyéticas por las derivadas del receptor, mientras que las células estromales no hematopoyéticas continúan proviniendo del donante. En consecuencia, se puede crear un "órgano quimérico" sin irradiación del huésped o expresión pulmonar específica de un transgén¹². Además, el pulmón nativo del lado opuesto puede funcionar como un control interno dentro del mismo animal sin causar cambios generalizados en el sistema inmunológico del huésped. Este modelo es muy prometedor para el avance de la investigación en el trasplante de pulmón y otras vías de enfermedades que involucran células del estroma pulmonar.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con los animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland, Baltimore, y recibieron su aprobación. Se recomienda utilizar ratones machos, de 8-12 semanas (20-25 g), BALB/c como donante y ratones C57BL/6 como receptores. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación de manguitos bronquiales y vasculares

Tiempo: 10 min (para tres puños)

1. Prepare el manguito bronquial con un angiocatéter de 18 G y el manguito venoso pulmonar con un angiocatéter de 20 G con una longitud de 1 mm (excluyendo el mango de extensión) (ver Tabla de materiales). Utilice un bisturí #11 y la aguja metálica del angiocatéter que sirve como superficie de corte (Figura 1).
2. Prepare el manguito de la arteria pulmonar con un angiocatéter de 24 g con una longitud de 0,6 mm (ver Tabla de materiales) de manera similar.
   NOTA: Los principios fundamentales generales de la técnica del manguito para la creación de anastomosis microvasculares son los siguientes: al establecer anastomosis microvasculares para el trasplante de pulmón de ratón, se utilizan técnicas específicas de manguito debido al pequeño tamaño de los vasos. A diferencia de los vasos más grandes, que se pueden suturar directamente, las conexiones bronquiales y vasculares microscópicas requieren un método distinto. El principio fundamental consiste en hacer pasar el vaso donante a través de un manguito circular rígido que es ligeramente más grande que el propio vaso.

2. Procedimiento del donante

Tiempo: 10-15 min

1. Administrar inyección intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina (ver Tabla de Materiales) para anestesiar al ratón donante (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
2. Después de asegurar una anestesia adecuada mediante un pellizco en los dedos de los pies, afeitar el ratón donante y colocarlo en posición supina bajo el microscopio quirúrgico con un aumento de 10x.
3. Inyecte 50 uL de heparina (ver Tabla de Materiales) a través de la vena del pene (Figura 2A).
4. Cortar la tráquea e insertar un angiocatéter de 20 G y luego rodearla con una sutura de seda 6-0 (ver Tabla de Materiales). Conecte el catéter al ventilador (Figura 2B).
5. Realizar una incisión en la línea media del abdomen (laparotomía) y hacer una incisión circunferencial en el diafragma (Figura 2C).
6. Realizar una esternotomía de la línea media¹² y colocar dos pinzas a cada lado del esternón para la hemostasia y la retracción de los bordes óseos (Figura 2D).
7. Extirpar el timo y extirpar los apéndices auriculares derecho e izquierdo para facilitar la ventilación de cualquier drenaje de los pulmones.
8. Inyecte 3 mL de solución de conservación fría a 4 °C disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) directamente en el ventrículo derecho o raíz de la arteria pulmonar, utilizando una aguja de 27 G en una jeringa de 3 mL para eliminar toda la sangre de los pulmones.
   NOTA: La inyección intraventricular o de la arteria pulmonar puede causar lesiones en el pulmón del donante. Es crucial mantener una ventilación adecuada en el momento de la descarga para garantizar una distribución uniforme de la solución de conservación.
9. Pinza la tráquea proximalmente y luego divida la tráquea distalmente. A continuación, diseccionar la tráquea caudal y posteriormente¹².
10. Retire el bloqueo corazón-pulmón y transfiérelo a una pequeña placa de Petri, estéril y forrada con gasa humedecida con una solución de conservación fría. Luego, coloque esta placa de Petri en una más grande llena de hielo (Figura 2E).
11. Para exponer el hilio izquierdo, coloque una gasa pequeña en los tejidos pulmonares izquierdo y derecho para su retracción (Figura 2F).
12. Separe suavemente las estructuras hiliares entre sí con pinzas curvas con precisión. Diseccionar la arteria pulmonar (AP) izquierda desde el bronquio (Figura 2G). A continuación, diseccionar la vena pulmonar (VP), situada en la cara más caudal del hilio desde el bronquio de forma similar (Figura 2H).
    1. Corte el PA y el PV a la mayor longitud posible para un puño adecuado. Trate de evitar extirpar el exceso de grasa o tejido linfoide, ya que esto podría dificultar la realización del paso de manguito.
13. Coloque el manguito PV aproximadamente 2 mm por encima de la arteria pulmonar con la pinza de estabilización y, a continuación, inserte el PV dentro del manguito. Pliegue el PV sobre el manguito, exponiendo así la superficie endotelial (Figura 2I). Asegúrelo alrededor del manguito con una sutura 10-0 (2 nudos) (Figura 2J).
14. Divida el PA del hilio y coloque el manguito en el PA de manera idéntica.
    NOTA: Abstenerse de cortar el bronquio en esta etapa. En su lugar, asegúrese de colocar el manguito en el bronquio justo antes de la implantación para evitar la entrada de la solución de conservación en las vías respiratorias en el momento del almacenamiento. Sumerja el bloque pulmonar en la solución de conservación a una temperatura de 4 °C.

3. Procedimiento del destinatario

Duración: 50-60 min

1. Anestesiar al ratón receptor con una mezcla de ketamina (50 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) (por vía intraperitoneal) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). A continuación, afeitar el tórax izquierdo e intubar¹².
2. Realice la intubación bajo visión directa retrayendo suavemente la lengua fuera de la boca y exponiendo así las cuerdas vocales. Realice esto bajo el visor de disección con un aumento de 10x. Intubar al animal insertando un angiocatéter de 20 G x 1,25" directamente entre las cuerdas vocales.
3. Coloque al animal en decúbito lateral derecho y limpie la pared torácica con etanol al 70%. (Figura 3A).
4. Utilice tijeras para incidir la piel y completar la toracotomía izquierda completamente con electrocauter (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Para minimizar la pérdida de sangre de la pared torácica durante este paso, utilice electrocauterio para todas las partes de esta disección. La piel debe secarse después de limpiarla con etanol, ya que la electrocauterización conlleva un riesgo de quemaduras cuando se combina con etanol.
5. Ingrese al tórax desde el^3er o^4to espacio intercostal y coloque dos retractores de tórax (ver Tabla de Materiales) (Figura 3B).
6. Después de la toracotomía, haga la transición del ratón a una posición supina. Dobla ligeramente el cuerpo del ratón receptor para acercar el pecho izquierdo al operador, lo que mejora la vista del hilio para mejorar la visibilidad y la accesibilidad.
7. Coloque una pinza arterial en ángulo recto (6 pulgadas) en el pulmón izquierdo del receptor y retraiga suavemente el pulmón. Permite la exposición del hilio anterior, lo que facilita el posterior acceso quirúrgico y la manipulación (Figura 3C).
8. Diseccionar la arteria pulmonar (AP) del bronquio con pinzas de disección curvas, asegurándose de no desgarrar el vaso. El lugar óptimo de disección es la parte media, y una distancia de 2 mm es suficiente (Figura 3D).
9. Diseccionar la PV de los bronquios de manera similar (Figura 3E).
10. Para obstruir el flujo de aire y el flujo sanguíneo del pulmón izquierdo del receptor, coloque un microclip de aneurisma (ver Tabla de materiales) en la base del hilio (Figura 3F).
11. Haga una pequeña incisión en forma de V en la arteria pulmonar (AP) y la vena pulmonar (VP) del receptor con unas tijeras. Dilatar suavemente las aberturas bronquiales y vasculares con pinzas rectas o curvas para generar una abertura adecuada para colocar los manguitos donantes.
12. Enjuague suavemente con heparina diluida (heparina: solución salina = 1:9) para eliminar la sangre.
13. Coloque nailon 10-0 alrededor del PA y déjelo suelto (para asegurar los puños en una etapa posterior).
14. A continuación, corte el bronquio donante y pújelo de forma similar a la PA y la PV. Deseche el bloqueo pulmón-corazón derecho del donante.
15. Sosteniendo el pulmón izquierdo del receptor, coloque el pulmón del donante encima de las pinzas de retracción y cúbralo con una gasa pequeña y húmeda.
    NOTA: El pulmón izquierdo del receptor debe mantenerse en posición para aplicar tensión al hilio receptor, facilitando así el proceso de anastomosis.
16. Exponga anteriormente las estructuras hiliares con manguito e inicie las anastomosis colocando al donante en la arteria pulmonar (AP) receptora mientras sostiene el manguito en la parte inferior. En este punto, la AF del donante experimentará cierto estiramiento (Figura 3G).
17. Una vez que la arteria pulmonar (AP) del donante se coloca en la PA del receptor, asegure las estructuras colocando un microclip a través de la extensión del manguito. A continuación, asegure la sutura de nailon 10-0 colocada previamente alrededor de la arteria pulmonar (AP) receptora y el manguito con dos nudos (consulte la figura 3H). Por último, desconecte el microclip del manguito de extensión.
18. Inserte el PV del donante en el PV del receptor de manera similar (Figura 3I).
19. Inserte el bronquio donante en el bronquio receptor, asegurándose de que el bronquio donante esté bajo algún estiramiento (Figura 3J). Suelte el microclip en el hilio para restaurar la perfusión y la ventilación (Figura 3K).
20. En la cavidad torácica, se inserta el pulmón del donante y se extirpa el pulmón izquierdo del receptor cortando los trozos restantes de la arteria pulmonar (AP), la vena pulmonar (VP) y el bronquio del receptor por delante (Figura 3L). Deseche el pulmón izquierdo del receptor.
21. Cierre el tórax con una sutura PDS 6-0 (consulte la Tabla de materiales), asegurando así una costilla por debajo y una costilla por encima de la incisión de la toracotomía. Justo antes de cerrar el cofre, proporcione al animal una gran respiración para expulsar el aire restante del cofre.
    NOTA: A diferencia del modelo de rata, no es necesario insertar tubos torácicos en ratones.
22. Suturar la piel y el tejido subcutáneo subyacente con una sutura de seda subcuticular continua 6-0 (ver Tabla de Materiales).

4. Recuperación de animales

Duración: 12 h

1. Permita que el animal se recupere con acceso sin restricciones a la comida y al agua en la UCI (unidad portátil de cuidados intensivos para animales pequeños, ver Tabla de Materiales) durante la noche.
2. Administrar buprenorfina por vía subcutanea (0,5-1 mg/kg) cada 12 h para minimizar el dolor postoperatorio.

Resultados

Con base en la experiencia con este modelo en los últimos 10 años, los individuos con habilidades microquirúrgicas básicas generalmente requieren una curva de aprendizaje de aproximadamente 50 animales. Una vez que se logra la competencia, los procedimientos del donante suelen durar entre 15 y 30 minutos, mientras que los procedimientos del receptor duran aproximadamente 60 minutos. Después de la curva de aprendizaje inicial, la mortalidad perioperatoria tiende a ser muy baja.

En la Figura 4A, B, la morfología pulmonar siete días después del injerto de los pulmones izquierdos del donante Balb/cJ en los receptores C57/B6J muestra que los ratones tratados con bloqueo coestimulador exhibieron una morfología normal y conservada. Por el contrario, los ratones no inmunodeprimidos mostraron signos de rechazo.

En la Figura 4C, D, la tinción H & E de los ratones tratados con bloqueo coestimulador reveló una inmunorreactividad mínima, lo que sugiere tolerancia inmunitaria. Por el contrario, los ratones no inmunodeprimidos mostraron una infiltración linfocítica prominente, indicativa de una respuesta de rechazo.

Figura 1: Creación del brazalete. Empleando la cuchilla # 11, los manguitos vasculares y bronquiales (A) están hechos con un mango de manguito de extensión para facilitar la colocación. (B) Se utilizaron catéteres de 18 G/20 G/24 G para broncos/vena pulmonar/arteria pulmonar (de izquierda a derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Operación del donante. El procedimiento del donante continúa con la inyección de heparina a través de la vena del pene (A), la intubación (B), la disección del diafragma (C) y una esternotomía de la línea media (D). El bloqueo pulmonar extirpado (E) se mantuvo húmedo con almohadillas de guaze cubiertas (F). El hilio se diseca empezando por la arteria plumonaria donante (G), vena pulmonar (H). El vaso se agarró a través de la luz del manguito y luego se dobló sobre el manguito exponiendo la superficie endotelial/epitelial (I). A continuación, se sujetó con una sutura de nylon 10-0 alrededor del manguito (2 nudos) (J). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Operación del destinatario. El procedimiento receptor procede con intubación endotraqueal, posición de decúbito lateral derecho (A) y toracotomía izquierda (B). El pulmón izquierdo receptor se libera de las inserciones en el hilio, la vista anterior (C) y se diseca la arteria pulmonar receptora (D), la vena pulmonar (E) y el bronquio. El control proximal del hilio receptor se obtiene con una pinza para aneurisma (F). La arteria pulmonar del donante con manguito se inserta en la arteria pulmonar del receptor a través de una arteriotomía de 1/3 en forma de V (G) y el mango del manguito se controla mediante un segundo clip de aneurisma para mantener el manguito estable, luego se asegura con una brida de nailon 10-0 (2 nudos) (H). Se retiró el^2º clip y se siguió el mismo procedimiento para la vena pulmonar (I) y el bronquio (J). Se retiró la^1ª pinza para permitir que el pulmón reperfundiera (K). se infla el pulmón y luego se vuelve a colocar en el tórax (L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Morfología e histología del pulmón trasplantado. Siete días después del injerto de pulmones izquierdos de un donante de Balb/cJ en receptores C57/B6J, los ratones tratados con bloqueo coestimulador mostraron una morfología normal y conservada (A). Por el contrario, los ratones no tratados con inmunosupresión mostraron signos de rechazo (B). La tinción de H & E de los ratones tratados con bloqueo coestimulador reveló una inmunorreactividad mínima, lo que sugiere tolerancia inmune (C). Los ratones no tratados con inmunosupresión mostraron una infiltración linfocítica prominente, indicativa de una respuesta de rechazo (D). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La técnica del manguito para el trasplante de pulmón izquierdo murino representa un avance significativo en la investigación de trasplantes^10,11. Los pasos críticos incluyen la disección precisa y meticulosa de la estructura hiliar y las anastomosis seguras. Se pueden hacer modificaciones para adaptarse a las necesidades experimentales, pero se requiere una curva de aprendizaje. Nuestro grupo ha modificado la posición del ratón receptor de posterior a anterior, obteniendo una mejor visión del hilio al doblar el ratón receptor, lo que acorta la curva de aprendizaje.

Las limitaciones incluyen desafíos con ratones fuera del rango de peso especificado y la necesidad de cirujanos capacitados con experiencia previa en microcirugía. Para mitigar el riesgo de atelectasia del injerto, se recomienda encarecidamente implementar presión positiva al final de la espiración (PEEP) después del injerto y garantizar la administración adecuada de analgésicos. Para la prevención de desgarros venosos, se recomienda emplear un tamaño de manguito más pequeño (22 G). Además, para evitar la torsión arterial, se sugiere minimizar el movimiento del injerto después de la preparación y tener sumo cuidado al ajustar la orientación del pulmón del donante durante el procedimiento de anastomosis.

A pesar de las limitaciones, el enfoque vascularizado del método supera a los modelos no vascularizados y proporciona una mejor relevancia fisiológica. También supera las deficiencias de los modelos traqueales heterotópicos⁷, lo que lo convierte en un modelo ideal para el estudio de la inmunobiología del trasplante y los procesos patológicos. La característica transformadora del modelo permite la sustitución gradual de las células hematopoyéticas del donante por células huésped, lo que facilita la investigación sobre enfermedades y neoplasias malignas¹². Además, ofrece información sobre las contribuciones de las células del estroma pulmonar, esencial para comprender la fisiopatología pulmonar y las terapias dirigidas.

En general, la técnica del manguito es prometedora para avanzar en la investigación en biología de trasplantes, enfermedades pulmonares e inmunología, con aplicaciones potenciales en diversos campos. Los investigadores deben ser conscientes de su curva de aprendizaje y adaptabilidad a las necesidades específicas de la investigación. Nuestro objetivo es mejorar la eficiencia y el éxito del procedimiento mediante la realización de modificaciones prácticas, como la reposición del animal después de la toracotomía para una mejor visión quirúrgica. Si bien la técnica principal sigue siendo la misma, estas mejoras pueden facilitar significativamente el proceso, especialmente para la anastomosis pulmonar oportuna en entornos experimentales. Este artículo proporciona consejos valiosos para un mejor rendimiento de la técnica en el campo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10-0 Sutura de nailon	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 pinzas Dumont #5	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Halsted-Mosquito abrazadera punta curva	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 sutura de seda trenzada	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Sutura de polidioxanona PDS II y	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% Etanol	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Pinzas Adson	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Ratones Balb/c	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, EE. UU	000651	8– 12 semanas; Hombre
Coagulador bipolar	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 ratones	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, EE. UU	000664	8– 12 semanas; Hombre
Clorhexidina	Hibiclens transparente, Mö lnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Electrocauterio	Bovie
Tijeras de resorte estilo vannas finas	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Portaagujas Halsey	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Harvard Apparatus Ventilador de ratón VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	ajustes 3L O2/minuto, frecuencia respiratoria 130 lpm, volumen corriente de 0,4 cc
solución de heparina	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	de 100 U/mL
	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamina	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Konig Mixter Micro Pinzas Pediátricas Mandíbulas en ángulo recto	Medline, Northfield, IL,MDS1247714		Extra Fino, Longitud Total 5 1/2" (14cm)
Medline Cauterio de Alta Temperatura, con punta fina	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Microscopio Leica M80 F12 Soporte de Suelo	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Tijeras de resorte extra finas Moria	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Vaporizador de isoflurano	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex  solución de glucosa de dextrano bajo en potasio	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ		353025 Solución de conservación de electrolitos
poliestireno Petriplacas	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 y 00649-11	150 &veces; 25 mm y 60 &veces; 25 mm
S& Pinzas T SuperGrip con punta recta y en ángulo	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
Sistema de retracción para animales pequeños	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	mini aplicadores cónicos con punta de algodón de 3 pulgadas
Q-tips estériles	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD
intravenoso Surflo etfe de SROX2419Z, amarillo, 24 G x 0,75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Catéter intravenoso Surflo etfe; Verde, 18 G x 2 "	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Catéter intravenoso Surflo etfe; Rosa, 20 g x 1.25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
Sistema de UCI para animales pequeños ThermoCare,	de la A a la Z, Dresde, TN	008679	10 mg/kg
de xilacina	Aesculap, Inc., Valle Centro, PA,	FT480T
Yasargil Aplicador de clips	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Clips de Aneurisma Temporal Medline	, Northfield, IL,