Artículo de método

Registros extracelulares duales en el hipocampo y la corteza prefrontal del ratón

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DOI:

10.3791/66003

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16 de febrero de 2024

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1Neural Dynamics Laboratory, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el uso de un dispositivo de registro y electrodos diseñados a medida para registrar los potenciales de campo local e investigar el flujo de información en el hipocampo y la corteza prefrontal del ratón.

Resumen

La técnica de registro de potenciales de campo local (LFPs) es un método electrofisiológico utilizado para medir la actividad eléctrica de poblaciones neuronales localizadas. Sirve como una herramienta crucial en la investigación cognitiva, particularmente en regiones del cerebro como el hipocampo y la corteza prefrontal. Las grabaciones de LFP dual entre estas zonas son de particular interés, ya que permiten explorar la comunicación interregional de señales. Sin embargo, los métodos para realizar estas grabaciones rara vez se describen, y la mayoría de los dispositivos de grabación comerciales son caros o carecen de adaptabilidad para adaptarse a diseños experimentales específicos. Este estudio presenta un protocolo completo para realizar registros de LFP de doble electrodo en el hipocampo del ratón y la corteza prefrontal para investigar los efectos de los fármacos antipsicóticos y los moduladores de los canales de potasio sobre las propiedades de la LFP en estas áreas. La técnica permite medir las propiedades de la LFP, incluidos los espectros de potencia dentro de cada región del cerebro y la coherencia entre ambas. Además, para estos experimentos se ha desarrollado un dispositivo de grabación de bajo coste y diseño personalizado. En resumen, este protocolo proporciona un medio para registrar señales con una alta relación señal-ruido en diferentes regiones del cerebro, lo que facilita la investigación de la comunicación de información interregional dentro del cerebro.

Introducción

Los potenciales de campo local (LFP) se refieren a la actividad eléctrica registrada desde el espacio extracelular, que refleja la actividad colectiva de un grupo localizado de neuronas. Exhiben una amplia gama de frecuencias, que van desde ondas lentas a 1 Hz hasta oscilaciones rápidas a 100 Hz o 200 Hz. Bandas de frecuencia específicas se han asociado con funciones cognitivas como el aprendizaje, la memoria y la toma de decisiones 1,2. Los cambios en las propiedades de la LFP se han utilizado como biomarcadores para diversos trastornos neurológicos, como la demencia y la esquizofrenia 3,4. El análisis de los registros de LFP puede ofrecer información valiosa sobre los mecanismos patológicos subyacentes asociados con estas afecciones y las posibles estrategias terapéuticas.

El registro dual de LFP es una técnica utilizada para medir la actividad eléctrica localizada dentro y entre dos regiones específicas del cerebro. Esta técnica ofrece una valiosa oportunidad para investigar la intrincada dinámica neuronal y la comunicación de señales que se producen dentro y entre las distintas regiones del cerebro. Estudios previos han revelado que la detección de alteraciones en las propiedades neuronales de regiones cerebrales individuales puede ser compleja, pero se pueden observar cambios en la comunicación cortical interregional 5,6. Por lo tanto, la utilización de la grabación LFP dual ofrece un medio potente para abordar este problema.

La conectividad hipocampo-prefrontal juega un papel crucial en la modulación de las funciones cognitivas, y la disfunción se ha relacionado con diversos trastornos neurológicos 7,8. Los registros de electrodos duales de estas regiones pueden proporcionar información sobre estas interacciones. Desafortunadamente, hay poca información disponible sobre los métodos para realizar registros de LFP de doble electrodo entre estas áreas. Además, los dispositivos de grabación disponibles en el mercado son generalmente caros y carecen de adaptabilidad a diseños experimentales específicos. El método convencional para registrar las LFP consiste en utilizar un cable blindado para conectar el dispositivo de grabación a los electrodos implantados en el cerebro de un animal. Sin embargo, este enfoque es susceptible a los artefactos de movimiento y al ruido ambiental, lo que afecta a la calidad y fiabilidad de las señales grabadas.

Este protocolo describe un procedimiento exhaustivo para realizar registros de LFP de doble electrodo en el hipocampo y la corteza prefrontal del ratón, utilizando una plataforma de cabeza de bajo costo diseñada a medida que se puede colocar en la cabeza del animal. Estos métodos permiten a los investigadores investigar los patrones oscilatorios específicos de la región dentro de dos regiones cerebrales discretas y explorar el intercambio de información interregional y la conectividad entre estas áreas.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de Florey (Universidad de Melbourne, No. 22-025UM) de acuerdo con el código australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 (8 semanas), obtenidos del Centro de Recursos Animales (Australia).

1. Diseño y fabricación de la cabecera

NOTA: La placa PCB de la cabeza es una placa compacta de cuatro capas de 14 mm x 12 mm diseñada para colocarse directamente sobre la cabeza del animal. Utiliza un chip amplificador comercial (ver Tabla de Materiales), y todos los archivos de diseño y Gerber están disponibles en línea (enlace de GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

  1. Proporcione las siguientes especificaciones al fabricante: Espesor del tablero: 0,6 mm; Seguimiento/espaciado mínimo: 4 milésimas de pulgada; Tamaño mínimo del orificio: 0,2 mm.
  2. Durante el proceso de ensamblaje de PCB, siga este orden:
    1. Suelde el chip amplificador a la placa con una pistola de aire caliente ajustada a 350 °C.
    2. Suelde los componentes pasivos.
    3. Suelde el conector SPI y el conector del electrodo (consulte la tabla de materiales).
  3. Inspeccione la soldadura bajo un microscopio para garantizar la calidad. Asegure el conector SPI en su lugar con epoxi para mayor estabilidad.
  4. Utilice un software de grabación de terceros y un tablero de control (consulte la Tabla de materiales) para la adquisición de señales. Consulte la guía del usuario del software para obtener instrucciones detalladas.
  5. La cabecera diseñada admite 8 canales. En el software, habilite los canales 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 y 23 para grabar.

2. Fabricación de electrodos

  1. Corte alambres de tungsteno recubiertos de PFA (consulte la Tabla de materiales) a longitudes específicas para diferentes tipos de electrodos: electrodo de corteza prefrontal (12 mm), electrodo de hipocampo (10 mm) y electrodo de tierra (6 mm).
  2. Corte el tubo de latón (ver Tabla de Materiales) en segmentos de 3 mm.
  3. Retire 2 mm del recubrimiento en el extremo de cada cable con un encendedor, luego suelde firmemente el cable del electrodo al tubo de latón. El tubo de latón tiene un diámetro interior de 0,45 mm y un diámetro exterior de 0,60 mm.
  4. Para el electrodo de tierra, suelde un tornillo de acero inoxidable M1.2 (consulte la Tabla de materiales) al electrodo. Aplique fundente a base de ácido fosfórico al tornillo para mejorar la soldadura. Después de soldar, limpie el tornillo con alcohol.
    NOTA: Use guantes para protegerse durante el proceso de soldadura.

3. Procedimiento quirúrgico

  1. Anestesiar al ratón en una cámara de anestesia con isoflurano al 3% y flujo de oxígeno de 1 L/min.
  2. Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla térmica y asegúrelo en un marco estereotáxico (consulte la tabla de materiales).
  3. Ajuste la tasa de mantenimiento de isoflurano al 2,5-3% y reduzca el flujo de oxígeno a 500 mL/min. Con el pellizco del dedo del pie, verifique si el animal todavía está bajo anestesia profunda.
  4. Por vía subcutánea, inyecte carprofeno a 0,5 mg/kg y aplique ungüento ocular para protegerlos.
  5. Afeitar y esterilizar la cabeza del ratón con povidona yodada y etanol al 80%.
  6. Realice una incisión de 8 mm a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, eliminando el tejido conectivo en el área de la incisión.
  7. Aplique peróxido de hidrógeno para limpiar la superficie del cráneo, teniendo cuidado de no tocar la piel circundante.
  8. Alinee los puntos de referencia bregma y lambda al mismo nivel para una colocación precisa de los electrodos (bregma y lambda son donde la sutura sagital se cruza con las suturas coronal y lambdoide).
  9. Taladre orificios para electrodo de referencia/rectificado, tornillos de anclaje (rebaba de perforación de 0,9 mm) y electrodos activos (rebaba de perforación de 0,3 mm) en coordenadas especificadas.
  10. Conecte el electrodo hecho a medida (paso 2) al brazo del marco estereotáxico y asegúrese de que esté perpendicular al cerebro.
  11. Implante el electrodo en el área CA1 del hipocampo (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
    NOTA: AP: anteroposterior; ML: mediolateral; DV: dorsoventral.
  12. Repetir la implantación del electrodo en la corteza prefrontal (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
  13. Asegure los electrodos con un adhesivo potente y cemento dental disponibles en el mercado (consulte la tabla de materiales).
  14. Implante dos tornillos de anclaje de 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) para evitar el movimiento.
  15. Coloque el electrodo de referencia/tierra en contacto directo con la duramadre, 2 mm posterior y 2 mm unilateral con respecto al punto de referencia lambda.
  16. Conecte el lado del tubo de latón de los electrodos a un conector hembra multicanal (consulte la Tabla de materiales) con el electrodo de tierra en el medio.
  17. Utilice un tubo termorretráctil de 0,8 mm en el exterior del pin central para el aislamiento.
  18. Asegure los electrodos, los tornillos de anclaje y el conector con adhesivo y cemento dental.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Para aliviar el dolor postoperatorio, inyecte carprofeno a una dosis de 5-10 mg/kg por vía subcutánea cada 12-24 horas sobre la base de una evaluación del dolor durante un período de tres días.
  2. Proporcione al animal un período de recuperación de una semana antes de comenzar cualquier procedimiento de registro o experimentación.

5. Procedimiento de grabación

  1. Manipule al animal durante 15 minutos, dos veces al día, durante tres días consecutivos.
  2. Levanta a los ratones cerrando suavemente la mano alrededor de ellos sin aplicar una presión excesiva.
  3. Coloque la tabla del escenario en la cabeza del animal durante 30 minutos una vez al día durante tres días consecutivos.
  4. El día de la grabación, aclimatar al animal a la sala de grabación durante 30 min.
  5. Coloque al animal en una pequeña cámara de registro dentro de una jaula de Faraday para reducir la interferencia eléctrica externa. Conecte el escenario principal personalizado para la grabación.
  6. Abra el software de grabación y seleccione una frecuencia de muestreo de 2,00 kHz. Deshabilite todos los canales excepto el 13 y el 20 seleccionando cada canal y presionando la barra espaciadora.
  7. En la ventana de ancho de banda de hardware, establezca el ancho de banda inferior en 2 Hz y el ancho de banda superior en 100 Hz.
  8. En la ventana de filtrado de software, ajuste el filtro de paso bajo a 100 Hz y el filtro de paso alto a 2 Hz.
  9. Elija la ruta de almacenamiento haciendo clic en Seleccionar nombre de archivo y luego haga clic en Grabar.
  10. Comience cada sesión de grabación con un período de habituación de 10 minutos seguido de un registro de EEG de referencia de 15 minutos.
  11. Después del registro basal, administre el fármaco mediante inyección intraperitoneal y continúe registrando durante 30 minutos adicionales sin demora.
    NOTA: Consulte la sección de Resultados para obtener detalles sobre los medicamentos utilizados.

Resultados

Los resultados que se muestran aquí demuestran los efectos de varios fármacos sobre las propiedades de los potenciales de campo local (LFPs) probados en cuatro cohortes de ratones machos C57BL/6 (n = 8 para cada cohorte; edad: 8 semanas; peso: 24,0 ± 0,42 g). Los fármacos analizados incluyeron el fármaco antipsicótico clozapina, los moduladores de los canales de potasio 4-aminopiridina (4-AP) y retigabina, así como el vehículo de control solución salina.

Como se muestra en la Figura 1, el ratón se colocó en una pequeña cámara de registro y se recolectaron LFP del hipocampo (HIP) y la corteza prefrontal (PFC) utilizando una cabecera diseñada a medida. Dado que este estudio se centró principalmente en el examen de las bandas de frecuencia theta y gamma, la señal registrada se sometió primero a un filtrado inicial de paso de banda dentro de un rango de frecuencia de 2-100 Hz, seguido de un muestreo a 2000 Hz. A continuación, la señal se seccionó en varias épocas de 2 s. Se identificaron todas las épocas que mostraban artefactos de movimiento pronunciados y posteriormente se excluyeron de los procesos de análisis posteriores. Los espectros de potencia de las LFP tanto en el HIP como en el PFC, así como la coherencia HIP-PFC, se midieron utilizando un método de análisis basado en múltiples conos9. El análisis utilizó cinco conos de Slepian, y el ancho de banda de tiempo se estableció en tres para lograr la concentración espectral óptima. Se utilizó una ventana deslizante de 1 s y un tamaño de paso de 100 ms para generar los espectrogramas de tiempo-frecuencia y el curso temporal de la coherencia HIP-PFC.

Como se muestra en la Figura 2 y la Figura 3, la administración de solución salina no produjo ningún efecto perceptible sobre los espectros de potencia de las LFP en HIP y PFC, ni sobre la coherencia HIP-PFC. Tanto la retigabina como la clozapina demostraron claras reducciones en la potencia de la banda gamma (30-100 Hz) en HIP y PFC, así como en la coherencia HIP-PFC de la banda gamma. Por el contrario, 4-AP mostró los efectos opuestos, caracterizados por una mayor potencia de la banda gamma en HIP y PFC, junto con una mayor coherencia dentro de la banda gamma entre HIP y PFC.

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Figura 1: Esquema de la configuración experimental. Se implantaron electrodos en el hipocampo (HIP) y la corteza prefrontal (PFC) para registrar los potenciales de campo local. El animal se colocó en una pequeña cámara de registro y se conectó una cabecera diseñada a medida al conector del electrodo. Cada sesión de grabación comenzaba con una sesión de referencia de 10 minutos, a la que seguía una sesión de drogas de 30 minutos. Se probaron los efectos de la solución salina, la clozapina, el 4-AP y la retigabina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Impacto de los fármacos antipsicóticos y los moduladores de los canales de potasio en la actividad electrofisiológica en curso en el hipocampo (HIP) y la corteza prefrontal (CPF). El espectrograma normalizado de los potenciales de campo local en el HIP y el PFC, junto con la coherencia HIP-PFC, mostró efectos dependientes del tiempo para todos los fármacos estudiados. Los fármacos se administraron mediante inyección intraperitoneal en el tiempo t = 15 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: El impacto de los fármacos antipsicóticos y los moduladores de los canales de potasio en la densidad de los espectros de potencia en HIP y PFC. El 4-AP mejoró significativamente la potencia de la banda gamma en ambas regiones cerebrales, mientras que la clozapina y la retigabina suprimieron la potencia de la banda gamma en ambas regiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo presentado aquí describe el procedimiento para construir una cabecera personalizada diseñada específicamente para el registro simultáneo de potenciales de campo local (LFP) duales en el hipocampo (HIP) y la corteza prefrontal (PFC). Los pasos detallados proporcionados en este protocolo ofrecen suficiente información para que los investigadores examinen a fondo la comunicación de señales tanto dentro de cada región como entre el HIP y el PFC.

La cabecera diseñada a medida utiliza un chip amplificador comercial. Si bien la configuración actual admite la grabación de 8 canales, la etapa principal se puede adaptar fácilmente para acomodar la capacidad total de 32 canales, lo que brinda el potencial para ampliar la capacidad de canal adecuada para la grabación de guías de electrodos. Teniendo en cuenta el bajo costo de la cabecera, una opción es fijar permanentemente la tabla a la cabeza del animal. Este enfoque ofrece la ventaja de minimizar los artefactos de movimiento y reducir el nivel general de perturbación causada por el movimiento.

El electrodo hecho a medida demuestra un registro estable a largo plazo de LFP, manteniendo una buena calidad de señal durante un período de 3 a 5 meses. Otro enfoque viable consiste en emplear placas de circuitos flexibles a base de poliimida como guías de electrodos10,11. Estas placas de circuito flexibles se pueden integrar con el cabezal de grabación para permitir la grabación multicanal. Este método ofrece la ventaja de simplificar la preparación de los electrodos y los procedimientos quirúrgicos. El peso del implante con y sin cabecera es muy ligero, de 0,198 g y 0,812 g, respectivamente, por lo que es adecuado para ratones muy jóvenes.

Una limitación de la técnica de registro actual es la posible interferencia causada por el cable colgante, que puede interferir en el comportamiento natural del animal durante los experimentos. Para abordar este problema, se pueden considerar soluciones alternativas, como la utilización de una tarjeta SD para el almacenamiento de datos o la implementación de un módulo transmisor de señal inalámbrica.

Un paso esencial y crítico del protocolo implica el posicionamiento preciso del electrodo. Es crucial garantizar una colocación precisa y coherente de los electrodos para permitir la comparabilidad entre los experimentos. Para verificar la ubicación del electrodo, se debe realizar una histología12. Una técnica útil para mejorar la posición adecuada del electrodo en el HPC es registrar mientras el electrodo está insertado verticalmente, ya que los fuertes ritmos theta y el disparo neuronal indicarán la ubicación correcta. Es aconsejable utilizar ratones adultos mayores de 8 semanas, ya que la calidad de la señal puede disminuir con el tiempo o dar lugar a una ubicación incorrecta a medida que los ratones envejecen. Tener en cuenta estas consideraciones ayudará a mantener la fiabilidad y validez de los resultados experimentales.

En conclusión, el protocolo presentado en este artículo proporciona un marco para estudiar la comunicación de señales entre distintas regiones cerebrales. Permite a los investigadores explorar la dinámica neuronal y las interacciones dentro y entre estas regiones.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Neurociencia del Royal Melbourne Hospital (A2087).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de latón Albion Alloys, EE. UUDiámetro interior de 0,45 mm
Carprofeno Rimadyl, Salud Animal de Pfizer  
Chip amplificador comercialIntantechRHD 2132
Tablero de controlde grabaciónIntantech
Cemento dental Paladur
TermorretráctilesPanduit0,8 mm de diámetro
Tornillo de acero inoxidable M1.2Herramientas de relojTornillo de reloj y reloj Conector
de enchufe multicanal Harwin, AU1,27 mm paso, zócalo
de tungsteno recubiertos de PFA A-M SYSTEMS, EE. UUDiámetro interior de 150 y micro; m 
Fundente a base de ácido fosfóricoChip QuikCQ4LF-0.5
Software de grabaciónIntantechRHX Software
estereotácticoWorld Precision InstrumentsInstrumento estereotáctico de ratón Pegamento
UHUUltra rápido
. Sistema RHDde PCB alambres . de grabación Marco

Referencias

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