Artículo de método

Entrenamiento de conejos de laboratorio para refinar los procedimientos rutinarios de cría

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DOI:

10.3791/66008

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16 de febrero de 2024

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1German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), German Federal Institute for Risk Assessment

En este artículo

Resumen

Se desarrollaron protocolos de entrenamiento que incluían refuerzo positivo para los procedimientos rutinarios de cría en conejos y demostraron ser exitosos, ya que los conejos mostraron de manera confiable los comportamientos entrenados en el examen general semanal. Recoger los conejos con la caja de transporte era menos aversivo que la técnica de manipulación convencional.

Resumen

Se requieren técnicas de manejo y entrenamiento no aversivos para animales de laboratorio para facilitar los procedimientos experimentales y rutinarios de cría, mejorando tanto el bienestar animal como la calidad científica. El entrenamiento con clicker se utilizó para desarrollar protocolos de entrenamiento para conejos con el fin de refinar los estresantes procedimientos de cría de rutina generalmente asociados con levantarlos (es decir, ser levantados del suelo) / restringirlos (es decir, ser sostenidos en los brazos de un humano). Trece conejas blancas de Nueva Zelanda fueron entrenadas durante tres semanas. Todos los conejos aprendieron los comportamientos objetivo predefinidos: siguieron el palo objetivo, saltaron a la báscula, entraron en una caja de transporte y se encabritaron mientras colocaban sus patas delanteras en la mano del entrenador. Además, diez animales saltaron del suelo al regazo del entrenador sentado y permitieron que el entrenador levantara sus patas de la superficie mientras estaban sentados en el regazo del entrenador. Para algunas personas, los protocolos tuvieron que adaptarse mediante medidas provisionales adicionales. Al final del entrenamiento, los conejos mostraron de forma fiable los comportamientos de gol esperados, incluso después de pausas de entrenamiento cortas y largas. Con pocas excepciones, una persona conocida que no fuera el entrenador podía obtener los comportamientos objetivo de los conejos (generalización), aunque se requerían sesiones adicionales para la generalización. En la prueba de enfoque voluntario, los conejos prefirieron interactuar con el entrenador en la1ª prueba, pero pasaron tanto tiempo con una persona desconocida como con el entrenador en la2ª prueba. Las observaciones conductuales sugirieron que recoger a los conejos con la caja de transporte, como se describe en el protocolo, en lugar de sujetarlos con el pescuezo y levantarlos sobre el brazo, era menos aversivo. Con todo, los protocolos de entrenamiento fueron factibles y pueden servir como una estrategia de refinamiento en las instalaciones de animales de laboratorio. En aras del bienestar animal, los protocolos de adiestramiento deben aplicarse siempre que sea posible.

Introducción

Entre 2015 y 2019, se utilizaron más de 49 millones de animales con fines científicos en la Unión Europea (y Noruega); De ellos, 1.745.037 (3,5 %) eran conejos1. Los conejos se utilizan principalmente para la investigación regulatoria (por ejemplo, control de calidad, toxicidad y otras pruebas de seguridad, incluida la farmacología) y la producción rutinaria de sustancias biológicas (por ejemplo, productos a base de sangre)2. Aunque se están haciendo esfuerzos para reemplazar los experimentos con animales por métodos sin animales, el uso de animales sigue siendo necesario para algunos de estos fines. Siempre que un experimento con animales no pueda ser reemplazado, es crucial reducir el número de animales y refinar las condiciones experimentales, así como las de alojamiento y cría para minimizar el sufrimiento. Russel y Burch describieron esta estrategia como el principio de las 3R (reemplazar, reducir, refinar) en 19593 y , en 2010, se implementó en la Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales de laboratorio utilizados para fines científicos4. El papel del refinamiento, a veces referido como "Cenicienta" de las 3R5, ha ganado cada vez más importancia. Si bien la sustitución y la reducción son estrategias a largo plazo para alcanzar el objetivo final de la Directiva de sustituir completamente los experimentos con animales, el perfeccionamiento permite la mejora inmediata del bienestar animal5, lo que a su vez tiene el potencial de mejorar la calidad científica6. Las partes esenciales del perfeccionamiento son el manejo y la formación de los animales, como se señala en el anexo III de la Directiva 2010/63/UE. La Directiva estipula que los animalarios deben diseñar programas de habituación y adiestramiento de los animales de laboratorio adaptados a la especie, al procedimiento y al proyecto4. El Apéndice A del ETS Nº 123 sugiere que el personal de los animales de laboratorio pasa tiempo "hablando, manipulando, entrenando y acicalando a los animales"7.

Algunos procedimientos de manipulación causan estrés, especialmente para los animales de presa terrestres como los conejos. Algunos ejemplos son ser acorralados, restringidos (es decir, agarrados por un ser humano, sostenidos en los brazos de un humano o inmovilizados por un dispositivo) y levantados (es decir, recogidos del suelo) para una inspección de salud o procedimientos experimentales8. Una encuesta centrada en conejos domésticos reveló que entre el 57 % y el 61 % de ellos tenían problemas al ser levantados 9,10 y algunos incluso mostraban agresividad relacionada con el miedo (es decir, mordiscos)11. Esto enfatiza la necesidad de técnicas de manejo y entrenamiento suaves. Ya se ha demostrado para otros pequeños mamíferos, como los ratones, que las técnicas de manejo suave disminuyen la ansiedad12. Además, el manejo suave en combinación con el entrenamiento reduce el estrés, la ansiedad y el comportamiento similar a la depresión en ratones13. En macacos rhesus y chimpancés, las medidas fisiológicas relacionadas con el estrés se vieron menos afectadas cuando fueron entrenados previamente en un procedimiento14,15. Se puede suponer que si un animal puede optar por participar en el entrenamiento de forma voluntaria, puede participar activamente y controlar la situación, lo que mejora el bienestar del animal y también puede contribuir a obtener datos científicos más sólidos y fiables16.

Muchos procedimientos de entrenamiento animal se basan en los principios del condicionamiento operante, en particular el uso del refuerzo positivo y la formación 17,18,19. El condicionamiento operante requiere que un animal provoque comportamientos que luego pueden aumentaro disminuir. Hay cuatro contingencias comunes que se utilizan para describir el condicionamiento operante: el refuerzo positivo y negativo, así como el castigo positivo y negativo 21,22. En los conejos, el castigo positivo se utiliza cuando una persona se acerca (estímulo no deseado) a un animal para alejarlo o acercarlo a un lugar en particular23. En el contexto del manejo de un conejo en la mesa de examen, un ejemplo de refuerzo negativo es la eliminación de la presión (estímulo no deseado) en el cuerpo del conejo cuando el conejo se queda quieto; Un ejemplo de castigo negativo es retirar una recompensa de comida (estímulo deseado) cuando el conejo comienza a luchar. Ni el castigo positivo/negativo ni el refuerzo negativo son recomendables en el adiestramiento de animales. El castigo causa afectos emocionales negativos24, como la angustia como se muestra en los perros25. En cambio, el refuerzo positivo debe ser el método de elección cuando se entrenan animales25,26. El entrenamiento de refuerzo positivo (PRT, por sus siglas en inglés) significa que se proporciona un estímulo deseable (por ejemplo, una recompensa de comida) después de que el animal mostró un comportamiento deseado, lo que aumenta la probabilidad de que el animal vuelva a mostrar el comportamiento deseado enel futuro. La PRT a menudo implica la aplicación de un reforzador condicionado. Un reforzador condicionado (reforzador secundario) suele ser un estímulo neutro, como un sonido, que el animal aprende a asociar con un reforzador incondicionado (reforzador primario, por ejemplo, recompensa alimenticia)28. Después de que el animal muestra el comportamiento deseado, se presenta inmediatamente el reforzador condicionado, seguido de la presentación de la recompensa alimenticia26. Un ejemplo bien conocido de PRT es el entrenamiento con clicker, donde se utiliza un clicker para producir un clic como reforzador secundario26.

El entrenamiento debe seguir patrones predecibles, lo que se logra mediante el diseño de un protocolo de entrenamiento. El protocolo de entrenamiento describe cómo se puede alcanzar un comportamiento objetivo paso a paso (es decir, la conformación del comportamiento), mientras que cada paso está definido por criterios objetivos y debe lograrse fácilmente26. Si el entrenamiento sigue un protocolo particular, es posible que el personal de animales de laboratorio alterne con el entrenamiento de los animales. Es importante tener en cuenta que el personal necesita conocer los principios de las técnicas de aprendizaje y entrenamiento para poder aplicarlas correctamente26. El entrenamiento de animales a menudo incorpora la configuración del comportamiento. El modelado del comportamiento a mano fue utilizado deliberadamente por primera vez por Skinner y sus colegas a principios de la década de 194029. En contraste, en trabajos anteriores, Skinner se centró más bien en "hacer pequeños cambios en el entorno físico con el fin de implementar un programa de aproximación sucesiva"29. En un artículo publicado en Scientific American, explicó que reforzar un comportamiento aumenta la probabilidad de que el comportamiento se repita, lo que "hace posible moldear el comportamiento de un animal casi como un escultor da forma a un trozo de arcilla"30. Desde entonces, la conformación ha experimentado una creciente importancia para los animales en cautiverio 29,30,31,32. Para reproducir y mejorar la conformación de los protocolos, es crucial evaluar los protocolos de manera sistemática y objetiva 33,34,35,36.

Una revisión sistemática y meta-análisis recientemente publicada por Pfaller-Sadovsky et al. encontró que el refuerzo condicionado se estudió con mayor frecuencia en caballos y perros, aunque también se investigaron gatos, ganado, peces, cabras y primates no humanos37. En la ciencia de los animales de laboratorio, el PRT se utiliza ampliamente para los primates no humanos 38,39,40 y los perros41,42. Además, cerdos43, cabras44 e incluso pequeños mamíferos, como ratones13 y ratas 45,46,47, fueron entrenados con éxito utilizando un clicker en el laboratorio. Hasta donde saben los autores, la introducción de PRT para conejos de laboratorio solo se ha reportado raramentehasta ahora 48; La literatura existente revisada por pares publicada hace varias décadas está desactualizada y no cumple con los criterios de la investigación ética moderna. Aunque poca información no revisada por pares sugiere que los conejos pueden ser entrenados con éxito utilizando PRT49, parece haber una falta de conocimiento sobre los protocolos de entrenamiento adecuados para los conejos que se alojan en instalaciones de animales de laboratorio. Las razones subyacentes pueden variar. Por ejemplo, es posible que las técnicas de capacitación utilizadas no se describan en detalle en los artículos de investigación o que se generen datos para la investigación regulatoria y, por lo tanto, no se publiquen. Además, es posible que los conejos no sean el foco principal de la investigación de refinamiento, ya que otras especies, como los ratones y las ratas, se utilizan con mayor frecuencia en la investigación. Dado que los conejos pueden enmascarar el estrés y el malestar extremadamente bien, su estado emocional negativo cuando se les manipula a menudo puede pasar desapercibido. El tamaño de un conejo permite a los humanos sujetar a estos animales para procedimientos, mientras que otras especies, como los primates no humanos, pueden no ser sostenidos con las manos para intervenciones similares sin resultar gravemente heridos50. Sin embargo, estos hechos no deben impedir el desarrollo o la difusión de protocolos de PRT para conejos de laboratorio.

En cuanto a los beneficios potenciales del PRT, se realizaron los primeros intentos de llenar el vacío de conocimiento sobre los protocolos de entrenamiento adecuados para los conejos de laboratorio. Para facilitar los procedimientos de rutina, como la manipulación, las inspecciones sanitarias y el pesaje, se desarrollaron protocolos de entrenamiento y se evaluó su viabilidad para las hembras de conejo blanco de Nueva Zelanda. Se realizaron comparaciones para evaluar si la técnica de manejo alternativa descrita en los protocolos de entrenamiento era menos aversiva que la técnica de manejo convencional y si los protocolos de entrenamiento pueden servir como medidas de refinamiento. En la Figura 1 se muestra el cronograma del presente estudio.

Mantenimiento de animales

Trece conejos blancos hembras de Nueva Zelanda se obtuvieron de fuentes comerciales (llegaron a las instalaciones de animales a la edad de aproximadamente siete semanas de edad). Los animales estaban libres de todos los patógenos virales, bacterianos y parasitarios enumerados en las recomendaciones de FELASA51. Se utilizó ropa y equipo de protección (guantes, mascarillas, redecillas para el cabello) al llevar a cabo los pasos del presente protocolo. Un grupo de seis y un grupo de siete animales se alojaron juntos en un corral de suelo de 2,8 m × 2,8 m (vivienda en el suelo), respectivamente. El suelo estaba cubierto con material de cama de madera fino y escamoso (esterilizado en autoclave). Además, el material de anidación y la lana de papel estaban esparcidos sobre la ropa de cama. Tres casas de plástico con dos aberturas cada una (37 cm × 60 cm; altura 30 cm) y un túnel de plástico (longitud: 58 cm; diámetro: 16 cm) servían como refugios. Además, se proporcionaron artículos de enriquecimiento como bloques de madera para roer, bolas de heno y sauce, y bolas de bocadillos rellenas de gránulos de comida, que se caen al mover la pelota. Los conejos tenían libre acceso a agua del grifo, comida granulada y heno esterilizado en autoclave, así como paja. Más información sobre alimentos y artículos de enriquecimiento se enumeran en la Tabla de Materiales. La sala de los animales se limpiaba los jueves.

Los conejos se mantuvieron en condiciones estándar (temperatura ambiente y humedad relativa como media ± desviación estándar: 20,3 ± 0,4 °C y 50 ± 5 %) en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h (luz artificial con incidencia adicional de luz diurna). Se encendió una radio 30 minutos antes del inicio de la fase de luz durante aproximadamente 8 h para habituar a los conejos a los ruidos ambientales.

Protocolo

El mantenimiento de los animales fue aprobado por la Autoridad Estatal de Berlín ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", número de permiso: ZH3 - Instituto Federal Alemán para la Evaluación de Riesgos, Berlín). Los protocolos de capacitación se desarrollaron en el marco de la cría rutinaria de animales para perfeccionar procedimientos como el manejo, la inspección sanitaria y el pesaje. Dado que los protocolos de entrenamiento no causaron ningún dolor, sufrimiento o daño y todas las observaciones se realizaron en el contexto de la cría rutinaria de animales, este estudio no se consideró un experimento con animales según la legislación europea.

1. Requisitos generales para la formación

NOTA: Los siguientes puntos son generalmente obligatorios para el entrenamiento de animales, independientemente del presente protocolo.

  1. Marque claramente a los animales para su identificación.
  2. Asegúrate de tener una recompensa de alta calidad, por ejemplo, comida muy sabrosa.
  3. Defina el plan de entrenamiento que incluya todos los pasos hacia el comportamiento objetivo, es decir, el comportamiento deseado que debe mostrar el animal.
    NOTA: El comportamiento del objetivo se forma paso a paso, mientras que cada paso está definido por criterios objetivos y debe lograrse fácilmente.
  4. Defina si los animales deben tener éxito en realizar el 80% o el 100% de los pasos de entrenamiento antes de continuar con el siguiente paso.
  5. Prepare la documentación (por ejemplo, Tabla complementaria 1).
  6. No entrene a los animales cuando tengan prisa y tenga cuidado con los gestos, el tono de voz y la velocidad de movimiento, es decir, hable suave y tranquilamente, muévase lenta y predeciblemente.
  7. Pruebe los pasos que se entrenaron en la capacitación anterior.
  8. No entrene a un animal cuando el estado de salud general del animal esté deteriorado y/o el animal no esté interesado en interactuar con el entrenador.

2. Rutinas de entrenamiento para el presente protocolo

NOTA: Se definieron las siguientes rutinas de entrenamiento para el presente protocolo.

  1. Montar la pista de entrenamiento en la sala/corral de los animales (Figura 2) y, en función del comportamiento objetivo a entrenar, colocar la báscula o la caja de transporte (suelo de 30 cm × 50 cm; puerta de 27 cm × 25,5; con una abertura en la tapa de 16 cm × 39 cm) en la arena.
  2. Coloque la báscula y la caja de transporte fuera de la arena para familiarizar a los conejos con estos objetos novedosos antes de que se entrenen los comportamientos objetivo "pesaje" y "caja de transporte".
  3. Para los comportamientos de meta (ver pasos 6-9), lleve al conejo al campo de entrenamiento, como se describe en el paso 5.7.
  4. Siéntese en el suelo o use un taburete/escalón bajo para sentarse en el campo de entrenamiento.
  5. Entrene los comportamientos objetivo uno tras otro, en el orden descrito en el protocolo y no simultáneamente. Haga una excepción si un animal no logra aprender un paso de un comportamiento objetivo en dos días consecutivos, en este caso, entrene el siguiente comportamiento objetivo simultáneamente. Cambiar el orden de las conductas objetivo si esto facilita el proceso de entrenamiento para un individuo.
  6. Después de la habituación y la introducción del clicker, comience a entrenar a todos los animales en elprimer paso del comportamiento de la meta "siguiendo el objetivo" (es decir, la pelota al final del palo objetivo se define como objetivo). Tenga en cuenta que, dependiendo de su rendimiento individual, pueden alcanzar diferentes niveles de entrenamiento en este día. Continuar el entrenamiento de acuerdo con el progreso individual de los animales en los días siguientes.
  7. Programe una sesión de entrenamiento (por ejemplo, aproximadamente 30 minutos para un grupo con seis o siete animales) para cada día de trabajo durante la semana.
    NOTA: La sesión de entrenamiento comienza cuando el entrenador está en la sala de animales/corral y está preparado para comenzar el entrenamiento. Una sesión termina cuando ninguno de los conejos participa en el entrenamiento (ya) o todos los conejos alcanzaron el paso final de entrenamiento del comportamiento objetivo para ser entrenados en esta sesión. Comience cada sesión de entrenamiento con el último paso exitoso del protocolo. Una sesión consta de al menos uno o más ensayos por animal.
  8. Comience una prueba pidiéndole al animal que realice un paso de entrenamiento en particular (es decir, el paso 3.1 después de que el conejo aprendió a tocar el objetivo con la nariz / boca) y finalice la prueba cuando el animal ya no participe en el entrenamiento (más) o el animal haya alcanzado el paso final de entrenamiento del comportamiento objetivo a entrenar. Al final del entrenamiento, abre la arena de entrenamiento y guía al conejo fuera de la arena; A continuación, sujeta el palo de objetivo (con el objetivo mirando hacia el techo) y el cuenco de recompensa delante del cofre.
  9. Programe la capacitación antes de la alimentación, la limpieza, los tratamientos o los procedimientos experimentales.
  10. Use un tazón de recompensa con un clicker integrado (Figura 3, Archivo de codificación suplementario 1) y, para algunos comportamientos de meta, un palo de objetivo adicional.
  11. Llene el tazón de recompensa con alimentos sabrosos, por ejemplo, semillas de girasol y golosinas de forrajeo a base de granos.
    NOTA: Los conejos son folívoros y estos ejemplos de recompensas no son óptimos; Sin embargo, debido a las restricciones de higiene en el animalario de laboratorio, eran las mejores alternativas disponibles para estos animales. Si es posible, se deben preferir las hierbas frescas como recompensa alimentaria. Tenga en cuenta que una recompensa solo es una recompensa si el conejo realmente la favorece.
  12. Asegúrese de sostener siempre el tazón de recompensa en la misma posición, por ejemplo, frente al cofre, y comience a mover el tazón de recompensa hacia los conejos solo después del clic. Excepto por el comportamiento de objetivo "levantarse" y "saltar en el regazo", sostenga el palo de objetivo en una mano y el tazón de recompensa en la otra.
  13. Presente la recompensa en el lugar donde estaba la nariz/boca del conejo cuando se mostró correctamente el comportamiento deseado.
  14. Ten cuidado de que el conejo solo coma una pequeña cantidad de comida al presentar la recompensa.
  15. Si un conejo muestra el comportamiento deseado al menos cuatro veces en un bloque de cinco intentos (tasa de éxito del 80%), continúe con el siguiente paso. Si un animal no es capaz de realizar el siguiente paso (es decir, no puede realizar el paso más de una vez), vuelva al paso anterior del protocolo. Si fue necesario volver a un paso anterior o un conejo no participa en el entrenamiento, revise los protocolos de entrenamiento (por ejemplo, defina pasos de entrenamiento más pequeños), elija otra recompensa de alimento (más apetecible) o verifique las habilidades de entrenamiento del entrenador.
  16. Si un conejo realiza correctamente el paso final de entrenamiento de un comportamiento objetivo, termine las sesiones de entrenamiento para este conejo el mismo día.
  17. Imprima la hoja de documentación (Archivo Complementario 1), los protocolos de entrenamiento detallados, así como los protocolos de entrenamiento simplificados (Archivo Complementario 2) y adjúntelos a un portapapeles o ábralos en una tableta. Utilice la hoja de documentación para anotar los pasos de entrenamiento alcanzados por los animales individuales en cada sesión.

3. Condicionamiento/habituación contextual

NOTA: Las sesiones de acondicionamiento contextual / habituación son realizadas diariamente por el entrenador y los cuidadores de animales durante aproximadamente 15 minutos por grupo de conejos durante un período de cinco días consecutivos (de lunes a viernes).

  1. Háblale suavemente a los conejos.
  2. Ofrezca recompensas de comida sabrosa.
    NOTA: Tenga en cuenta que los cambios repentinos en la dieta pueden causar problemas digestivos en los conejos. Por lo tanto, introduzca lentamente la nueva recompensa de comida.
  3. Mueve el cuenco de recompensa lleno de comida sabrosa hacia los conejos y deja que coman de él.
  4. Toca suavemente a los conejos alrededor del cuello, los hombros, la espalda y la grupa sin sujetarlos.

4. Presentación del clicker

NOTA: Comportamiento de la meta: Acércate al entrenador y come la recompensa del tazón después del click. El objetivo es que el conejo asocie la recompensa de comida con el clic, es decir, el conejo se come la recompensa de comida después del clic.

  1. Deja que el conejo se acerque.
  2. Haga clic una vez y mueva el tazón de recompensa hacia el conejo (conocido como clic y golosina o C y T).
  3. Repita el paso 4.2 diez veces. Al hacer clic por décima vez, espere un segundo antes de que se presente la recompensa y observe el comportamiento del conejo.
    NOTA: Si el animal busca la recompensa inmediatamente después del clic, se puede suponer que el condicionamiento del reforzador secundario fue exitoso.
  4. Repita los pasos 4.1.-4.3. Al día siguiente, si un conejo no comió la comida, recompensa después del clic al menos ocho veces.

5. Seguir el objetivo

NOTA: Comportamiento objetivo: Siga y toque al objetivo con la nariz o la boca. Las conductas meta en las secciones 6-9 son modificaciones de la conducta meta presentada en la sección 5.

  1. Coloca el objetivo cerca de la nariz o la boca del conejo.
    NOTA: La bola en el extremo del palo objetivo se define como objetivo.
    1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca.
      NOTA: Asegúrese de que la nariz / boca del conejo no toque el palo en ningún lugar indefinido que no sea la pelota.
    2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
    3. Repita todos los pasos anteriores cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
  2. Coloque el objetivo en un lugar diferente donde pueda ser tocado con la nariz / boca mediante movimientos de cabeza sin mover todo el cuerpo.
    1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
  3. Coloque el objetivo a una distancia más amplia del conejo y deje que el conejo se estire hacia él.
    1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
  4. Aumenta aún más la distancia entre el objetivo y el conejo, lo que requiere que el animal dé un salto para llegar al objetivo.
    1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
  5. Coloque el objetivo justo en frente de la nariz o la boca del conejo para que el conejo pueda tocar el objetivo y luego aleje lentamente el objetivo del conejo. Asegúrate de que el conejo debe hacer un número variable de saltos para seguir al objetivo.
    NOTA: En un bloque de cinco intentos, la1ª,2ª,3ª,4ª y5ª vez el conejo es recompensado después de 2, 1, 2, 3 y 2 saltos, respectivamente (en promedio: después de 2 saltos).
    1. C y T cuando los conejos hicieron el número requerido de saltos y sigue los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
  6. Repita el paso 5.5 y mueva el objetivo a través del pasillo entre los dos objetos.
    NOTA: Para este paso, dos objetos como túneles se colocan paralelos entre sí y forman un corredor.
    1. C y T cuando los conejos hicieron el número requerido de saltos y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
  7. Repita el paso 5.5 y mueva el objetivo hacia la arena de entrenamiento para que el conejo entre en ella.
    1. C y T cuando los conejos hicieron el número requerido de saltos y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.

6. Pesaje

NOTA: Comportamiento de meta: Permanezca en la báscula durante al menos un segundo. Si la superficie de la báscula es demasiado resbaladiza, se puede colocar una almohadilla antideslizante en la parte superior. Sin embargo, algunos conejos tienden a roer la almohadilla.

  1. Conduzca al conejo con el palo de tiro hacia la escala como se describe en el paso 5.5.
    1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca.
    2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
    3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
  2. Mueva el objetivo ligeramente por encima de la escala para que el conejo lo pise con las patas delanteras y toque el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.
  3. Mueve el objetivo ligeramente más allá del centro de la escala para que el conejo lo pise con las patas delanteras y se estire sobre la escama para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.
  4. Mueva el objetivo más allá del centro de la escala para que el conejo se suba a la escala con las patas delanteras y traseras para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.
  5. Conduzca al conejo a la báscula como se describe en 4.4. y espere unos segundos antes de C y T.
    NOTA: En este paso, recompense al conejo después de sentarse durante una cantidad variable de tiempo en la báscula. En un bloque de cinco intentos, el1º,2º,3º,4º y5º tiempo, el conejo es recompensado después de 0,5, 1,0, 2,0, 0,5 y 1,0 segundos, respectivamente (en promedio: 1,2 s). Mientras el conejo permanece quieto durante este tiempo, el peso se puede leer en la báscula. Si la báscula tarda más tiempo en estabilizarse y medir el peso, aumente el tiempo que el animal está sentado en la báscula.
    1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.

7. Introducción de la caja de transporte

NOTA: Comportamiento del objetivo: Entrar y salir de la caja de transporte. Para la sesión de entrenamiento, utilice una caja de transporte (suelo de 30 cm × 50 cm; puerta de 27 cm × 25,5 cm) con una abertura en la tapa (16 cm × 39 cm) cuya parte inferior esté cubierta con material de cama sucio.

  1. Conduce al conejo con el palo de tiro hacia la caja como se describe en el paso 5.5.
    1. C y T cuando el conejo está frente a la entrada de la caja.
    2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
    3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo realice con éxito la tarea al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
  2. Sostenga el palo objetivo a través de la abertura de la tapa y muévalo dentro de la caja, motivando así al conejo a entrar en la caja con las patas delanteras.
    1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
  3. Siga el paso 7.2 y lleve al conejo a la caja (es decir, todas las patas delanteras y traseras entraron en la caja).
    1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
  4. Siga el paso 7.3 y cierre la puerta de la caja durante unos segundos. A continuación, vuelve a abrir la puerta.
    1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
  5. Siga el paso 7.3 y cierre la puerta de la caja. Levante con cuidado la caja un poco (es decir, unos centímetros por encima del suelo). Vuelva a colocar la caja en el suelo y abra la puerta.
    1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
  6. Siga el paso 7.5. A continuación, saca al conejo de la caja con el palo de tiro.
    1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.

8. Crianza

NOTA: Comportamiento objetivo: Coloque las patas delanteras en la palma de la mano mientras se levanta. Para la sesión de entrenamiento, sostenga el palo de objetivo y el tazón de recompensa con la misma mano.

  1. Coloque el objetivo por encima de la cabeza del conejo de modo que el conejo estire la nariz hacia arriba para tocar el objetivo con la nariz o la boca mientras todas las patas permanecen en el suelo.
    1. C y T.
    2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
    3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
  2. Coloque el objetivo por encima de la cabeza del conejo, como se describe en el paso 8.1. Después de que el conejo haya estirado la nariz hacia arriba, mueva el objetivo más hacia arriba para que el conejo levante las patas delanteras del suelo y toque el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 8.1.2 y 8.1.3.
      NOTA: Si el conejo no realiza 8.2, se puede agregar un paso intermedio después de 8.2. Para ello, siga 8.2 y luego acérquese y toque las patas delanteras del conejo (superficie palmar) con la palma de la mano libre. C y T y siga los pasos 8.1.2 y 8.1.3.
  3. Coloque la palma de la mano libre frente al conejo y mueva el objetivo por encima de la cabeza del conejo para que el conejo ponga las patas delanteras en la mano para tocar el objetivo con la nariz / boca.
    1. C y T después de un segundo y siga los pasos 8.1.2 y 8.1.3.
      NOTA: Mientras las patas delanteras descansan sobre la mano del entrenador, el abdomen del conejo se puede inspeccionar visualmente.

9. Saltar en el regazo

NOTA: Comportamiento objetivo: Saltar sobre el regazo del entrenador y permanecer sentado mientras lo tocan. Para los pasos 9.5-9.9, sostenga el palo de objetivo y el tazón de recompensa con la misma mano, ya que una mano debe tocar al conejo.

  1. Lleve al conejo con el palo de tiro cerca del entrenador como se describe en el paso 5.5 del protocolo.
    1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca.
    2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
    3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
  2. Mueva el objetivo por encima de las patas del entrenador para que el conejo ponga las patas delanteras en las patas para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  3. Mueva el objetivo por encima de las patas y un poco más lejos del conejo para que el conejo ponga las patas delanteras en las patas y se estire hacia adelante para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
      NOTA: Si el conejo no logra realizar 9.4, se puede agregar un paso intermedio después de 9.3. Para esto, siga el paso 9.3 y luego atraiga al conejo con el tazón de recompensa al regazo. Cuando el conejo colocó las cuatro patas en el regazo, C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  4. Mueva el objetivo por encima de las patas e incluso más lejos del conejo para que el conejo salte al regazo y toque el objetivo con la nariz o la boca.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  5. Siga el paso 9.4. y acariciar cuidadosamente al conejo con la mano libre desde el cráneo hasta la caudal (empezando por el hombro) mientras el conejo se sienta en el regazo.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  6. Siga el paso 9.4 y acaricie cuidadosamente las orejas del conejo con la mano libre desde el cráneo hasta la caudal mientras el conejo se sienta en el regazo.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  7. Siga el paso 9.4. y agarre suavemente una de las orejas del conejo para inspeccionar visualmente las orejas.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  8. Siga el paso 9.4. y acariciar una pata delantera o trasera con la mano libre mientras el conejo se sienta en el regazo.
    NOTA: Si el lado derecho del cuerpo del conejo mira hacia el entrenador y el lado izquierdo está lejos del entrenador, las patas izquierdas se pueden tocar suavemente (y viceversa). Asegúrate de entrenar ambos lados alternativamente.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
  9. Siga el paso 9.4. y levante con cuidado una pata delantera o trasera con la mano libre mientras el conejo se sienta en el regazo.
    NOTA: Las garras se pueden inspeccionar cuando se levantan las patas. Asegúrate de entrenar ambos lados alternativamente.
    1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.

Resultados

En las siguientes secciones, se proporciona información sobre material y métodos que van más allá del protocolo, junto con los resultados representativos.

Estadística

Los datos obtenidos del protocolo mencionado anteriormente se almacenaron en hojas de cálculo y se analizaron utilizando un software para el análisis estadístico avanzado (Tabla de Materiales). Se realizaron pruebas de normalidad (inspección visual de histogramas y gráficos qq, comparación de media, desviación estándar y mediana) para los parámetros continuos. Las diferencias entre los parámetros investigados en la prueba de enfoque voluntario (tiempo de interacción con el entrenador y la persona desconocida, toques de patas delanteras y patas) se analizaron mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. Las diferencias entre las técnicas de manejo se analizaron mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon o la prueba de McNemar (si es binaria). Las diferencias se consideraron significativas a p < 0,05. Cuando se utilizó la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, la distribución de las diferencias tuvo que ser simétrica de acuerdo con la inspección visual del histograma.

El estudio fue exploratorio. El análisis de potencia basado en el tiempo que los conejos interactuaron con los "dispositivos de manipulación" se realizó después del estudio (prueba de rangos con signo de Wilcoxon; potencia ≥ 0,999) utilizando G*Power (versión 3.1.9.7)52.

Habituación

Todos los conejos, excepto el #4 y el #10, ingirieron comida del tazón de recompensa y dejaron que el entrenador los tocara en todas las sesiones de habituación. El conejo #4 no aceptó la recompensa de comida en la1ª sesión, pero comió cuatro veces del plato de recompensa en la2ª sesión. Sin embargo, la cantidad de ingesta de recompensa aumentó en sesiones posteriores y el conejo también pudo ser tocado. El conejo #10 también requirió más tiempo para habituarse al entrenador y a la recompensa de comida. En la primera sesión, el conejo aceptó la recompensa de comida del entrenador después de 5 minutos, pero no pudo ser tocado. En la 2ª sesión no se observó interés por la comida. En las sesiones posteriores, sin embargo, el conejo #10 aceptó tanto las recompensas de comida como las caricias.

Presentación del clicker

Doce de los trece conejos completaron con éxito la sección 4 del protocolo en un día y asociaron la recompensa de comida (reforzador primario) con el clic (reforzador secundario) dentro de esta sesión de entrenamiento. La asociación se probó observando el comportamiento de los conejos después de que se presentó el clic por décima vez. Cuando un animal buscaba la recompensa inmediatamente después del clic, se asumía que el conejo asociaba el reforzador primario con el secundario. El conejo #4 no comió la recompensa de comida después del clic en el día 1. Al conejo #4 le tomó un día más (es decir, dos días) asociar con éxito el clic y la recompensa de comida.

Siguiendo el objetivo

La Tabla 1 proporciona el número de sesiones de entrenamiento (dadas como mediana, percentil 25y percentil 75) necesarias para enseñar a los conejos los comportamientos objetivo de los protocolos. Los conejos necesitaron 2 sesiones de entrenamiento (mediana) para seguir al palo objetivo en la arena de entrenamiento (Tabla 1). Todos los conejos alcanzaron el escalón final (5.7) de este comportamiento objetivo.

El conejo #4 y el conejo #7 necesitaron 7 y 8 sesiones de entrenamiento respectivamente, antes de seguir al palo objetivo en la arena de entrenamiento. Dado que el conejo #7 no pudo completar el paso 5.4 y no hizo un salto para seguir al palo objetivo, se implementó un paso de entrenamiento adicional (5.3+) en el protocolo después del paso 5.3. En el paso 5.3+, el palo de objetivo se colocó a una distancia mayor del conejo que en 5.3 y el conejo tuvo que estirarse hacia él en diferentes direcciones, pero el palo de objetivo aún era alcanzable sin dar un salto. El conejo #4 tuvo problemas con el paso 5.5 y no pudo seguir el palo objetivo, que estaba colocado justo delante de la nariz / boca, durante un número variable de saltos. Por lo tanto, se agregó un paso adicional 5.4+ al protocolo. En este caso, el palo de objetivo se colocó justo en frente de la nariz / boca del conejo y luego se movió en diferentes direcciones, lo que requirió que el conejo diera un salto. El mismo paso adicional también se utilizó con éxito para el conejo # 7. Después de completar los pasos de capacitación adicionales con una tasa de éxito de al menos el 80%, pudieron continuar con los siguientes pasos.

Pesaje

Los conejos necesitaron 1 sesión de entrenamiento (mediana) hasta realizar el paso 6.5 (es decir, permanecer en la báscula durante un tiempo variable) (Tabla 1). Todos los conejos alcanzaron el escalón final (6.5) de este comportamiento objetivo.

Introducción de la caja de transporte

Los conejos realizaron con éxito todos los pasos de 7.1 a 7.6 (es decir, entrar y salir de la caja de transporte después de levantarla) dentro de 2 sesiones de entrenamiento (mediana) (Tabla 1). Todos los conejos alcanzaron el escalón final (7.6) de este comportamiento objetivo.

Cuando los conejos #2 y #3 realizaron con éxito el paso 7.6 por primera vez, no quisieron volver a entrar en la caja de transporte para repetir este paso. Por lo tanto, se creó el paso 7.5+: después de que el animal siguiera el palo objetivo hacia la caja, el tazón de recompensa se sostenía a través de la abertura de la tapa y el animal era atraído dentro de la caja. Una vez que el conejo entró en la caja, se cerró la puerta y se levantó la caja con cuidado. Después de volver a colocar la caja en el suelo, se abrió la puerta y se sacó al conejo de la caja con el palo de objetivo. Ambos animales lograron realizar el paso 7.5+ al menos 4 veces, seguido del paso 7.6 al día siguiente.

Cría

Se requirió 1 sesión de entrenamiento (mediana) hasta que los conejos completaron con éxito el paso 8.3 (es decir, colocar las patas delanteras en la mano del entrenador) (Tabla 1). Dado que 11 de los 13 conejos (es decir, todos excepto los #3 y #7), no lograron realizar el paso 8.3, se definió un paso de entrenamiento adicional 8.2+ después del 8.2 para estos animales. En el paso 8.2+, el palo de tiro se movió por encima de la cabeza del conejo para que el conejo levantara las patas delanteras del suelo y tocara el objetivo con la nariz/boca. Mientras el conejo tocaba el objetivo, la entrenadora se acercó y tocó las patas delanteras (superficie palmar) con la palma de su mano libre. Después de que el paso 8.2+ se llevó a cabo con éxito en al menos cuatro de cinco intentos, el paso 8.3 se entrenó nuevamente y se completó.

Saltar en el regazo

2.5 sesiones de entrenamiento (mediana) fueron necesarias para entrenar a los conejos en los pasos 9.1. al 9.9. (Tabla 1). Diez conejos fueron capaces de alcanzar el paso final 9.9 (es decir, aceptar que sus patas fueran tocadas mientras estaban sentados en el regazo del entrenador). El conejo #4 alcanzó solo el paso 9.2 (es decir, colocando sus patas delanteras en las piernas del entrenador) y el conejo #10 alcanzó el paso 9.3 (es decir, saltando en el regazo del entrenador). Rabbit #7 alcanzó el paso 9.3+, que fue un paso intermedio adicional después del paso 9.3. En este caso, el conejo colocó las patas delanteras en las patas del entrenador, como se describe en el paso 9.2, y luego fue atraído con el tazón de recompensa en el regazo del entrenador. Una vez que las cuatro patas se colocaron en el regazo del entrenador, se presentó el clic y la recompensa. Este paso se agregó con éxito al protocolo para ocho conejos para facilitar la realización de los siguientes pasos.

Generalización

Para evaluar si los conejos generalizaban las pistas entrenadas para realizar las conductas objetivo con otras personas además del entrenador, una cuidadora de animales, que estaba familiarizada con los conejos pero tenía poca experiencia previa en el entrenamiento con clicker, les pidió a los conejos que realizaran las conductas objetivo entrenadas "pesar", "entrar en la caja de transporte", "criar" y "saltar en el regazo". Si un conejo no aprendió previamente el paso final de "saltar en el regazo", se debe demostrar el último paso de entrenamiento exitoso.

Las sesiones se llevaron a cabo en cinco días consecutivos después de completar el entrenamiento de 3 semanas (Figura 1). El cuidador del animal leyó los protocolos de entrenamiento antes de la1ª sesión. Al comienzo de la1ª sesión, el entrenador hizo una breve demostración de todos los comportamientos objetivo. Luego se quedó en el corral, dio instrucciones durante las sesiones y documentó qué pasos de la meta mostraban los conejos. Si un conejo no mostraba un paso en particular, se le indicaba al cuidador del animal que volviera al paso anterior del protocolo.

Todos los conejos, excepto el conejo #4, realizaron los comportamientos objetivo "pesar", "entrar en la caja de transporte" y "criar" (datos indicados como mediana) después de 1 sesión, 2 sesiones y 2 sesiones, respectivamente (Tabla 2). El Conejo #4 no estaba dispuesto a mostrar ningún paso de estos comportamientos objetivo.

Ocho de cada diez animales que fueron capaces de mostrar el paso final de "saltar en el regazo" (9,9) demostraron este comportamiento después de 3 sesiones (mediana). Aunque el conejo #3 y #11 habían aprendido previamente el paso final de "saltar en el regazo" (9.9), solo mostraron el paso 9.3 con el cuidador del animal. El conejo #4, #7 y #10 mostraron el mismo paso que con el entrenador (9.2, 9.3+ y 9.3).

Rendimiento de las conductas objetivo después de descansos de entrenamiento de 1 semana

Para probar si los animales podían retener los pasos finales de "pesar", "entrar en la caja de transporte", "criar" y "saltar en el regazo", el entrenador recuperó los comportamientos objetivo una semana y dos semanas después de las sesiones de generalización (Figura 1). Durante estos descansos, los animales no fueron entrenados y no recibieron ninguna recompensa.

En ambos momentos, todos los conejos fueron capaces de realizar los pasos finales de "pesaje" (6.5), "entrar en la caja de transporte" (7.6) y "crianza" (8.3) que aprendieron en el entrenamiento previo de 3 semanas. Los animales (n = 10) que aprendieron el paso final de "saltar en el regazo" (9.9) mostraron este comportamiento en ambos puntos de tiempo; Aquellos que no aprendieron el paso final de este comportamiento objetivo (n = 3) fueron capaces de demostrar el último paso que habían alcanzado previamente (conejo #4: paso 9.2; conejo #7: paso 9.3+, conejo #10: paso 9.3) después del primer descanso de 1 semana. Después del segundo descanso de 1 semana, estos tres conejos mostraron los mismos pasos que la semana anterior, pero también se les pidió que realizaran los siguientes pasos y alcanzaron el paso 9.9.

Rendimiento de las conductas objetivo después de una pausa de entrenamiento de aproximadamente 8,5 semanas

Después de que los animales tuvieron un descanso de entrenamiento de aproximadamente 7.5 semanas (# 1-5, # 13) o 9.5 semanas (# 6-12), los comportamientos objetivo se recordaron nuevamente. Todos los animales fueron capaces de mostrar el paso final de "pesaje" (6.5), "ingreso a la caja de transporte" (7.6) y "cría" (8.3). Doce conejos mostraron el paso final de "saltar en el regazo" (9.9), mientras que el conejo #7 solo colocó sus patas delanteras sobre las piernas del entrenador y se estiró hacia adelante para tocar el objetivo con su nariz/boca (9.3).

Acercamiento voluntario hacia el entrenador conocido y una persona desconocida

Tres semanas después del entrenamiento, se probó el comportamiento de acercamiento voluntario de los conejos para investigar su interacción con el entrenador familiar y una persona desconocida (ambas hembras). Antes de la prueba, ambas personas se ducharon con el mismo gel de ducha y champú, se pusieron el mismo tipo de ropa y equipo de protección (guantes, mascarillas, redecillas para el cabello). Se realizaron dos ensayos de 5 minutos con un descanso de 2 minutos entre los ensayos en el corral de los animales. Como se muestra en la Figura 4A, el entrenador conocido y una persona desconocida se sentaron (en la misma posición) uno frente al otro en el piso del corral, con la parte posterior mirando hacia la pared del corral. Dos casas fueron retiradas del corral; El resto de la casa y el túnel se colocaron cerca de las otras dos paredes a la misma distancia de ambas personas. En elsegundo ensayo, intercambiaron la ubicación de sus asientos para considerar las posibles preferencias de lugar de los conejos. No se movieron ni hablaron durante los 5 minutos que duraron los juicios. Si un conejo mordía sus pantalones y le pellizcaba la pierna, una mano se movía suavemente hacia el conejo para que se detuviera. Cabe destacar que las observaciones de los animales individuales se realizaron dentro del grupo, es decir, los conejos pudieron interactuar entre sí durante ambos ensayos.

Los videos se analizaron retrospectivamente utilizando BORIS53. De acuerdo con el etograma definido para esta investigación, un conejo interactuó con una persona cuando las cuatro patas estaban en el cuadrado de 70 cm × 70 cm alrededor de una persona o en la línea fronteriza de este cuadrado. Además, se controló si un conejo colocaba ambas patas delanteras sobre las patas o saltaba sobre el regazo (con las cuatro patas colocadas en el regazo).

La figura 4B muestra el tiempo que los conejos interactuaron con las dos personas. La prueba de rangos con signo de Wilcoxon reveló que el tiempo de interacción con el entrenador y la persona desconocida difirió significativamente en el1er ensayo (z = -2,040, p = 0,041, coeficiente de correlación de Pearson r = 0,57) pero no en elsegundo ensayo ( z = 0,245, p = 0,807, r = 0,07). En la1ª prueba, los conejos pasaron más tiempo interactuando con el entrenador.

Tres (#1, #5, #6) y cinco (#1, #6, #7, #8, #12) conejos colocaron sus patas delanteras sobre las patas del entrenador en la prueba 1 y 2, respectivamente. Cinco animales saltaron con las cuatro patas sobre el regazo del entrenador (prueba 1: #1, #3, #5, #6; prueba 2: #9). Mientras que cuatro animales (#1, #2, #8, #9) en la1ª prueba y tres animales (#1, #4, #8) en la2ª prueba treparon con sus patas delanteras a las piernas de la persona desconocida, ninguno de ellos saltó con las cuatro patas a su regazo. La media de las diferencias entre el número de "toques de patas delanteras y patas" no difirió significativamente entre el entrenador y la persona desconocida en el ensayo 1 (z = -0,264, p = 0,792, r = 0,07) ni en el ensayo 2 (z = -0,707, p = 480, r = 0,20).

Efecto de las técnicas de manejo en el comportamiento de los conejos hacia el "dispositivo de manejo"

Para investigar si las técnicas utilizadas para levantar a los conejos del suelo afectaban su comportamiento, se realizó una observación conductual de 2 minutos después de este procedimiento en el contexto del examen general durante dos días consecutivos (Figura 1). Esta observación se llevó a cabo para siete animales.

El día 1, se recogieron los conejos con la caja de transporte. Para ello, seguían el palo de tiro hasta la caja, la caja se cerraba y se llevaba a la mesa de examen, como se describe en el paso de entrenamiento 7.5. Aquí se levantaban suavemente de la caja a la mesa, con ambas manos/brazos colocados debajo/alrededor del cuerpo del animal. Se llevó a cabo una inspección de salud (que incluyó palpación del cuerpo, inspección visual de oídos, ojos, fosas nasales, incisivos, región anogenital) y posteriormente se les ofreció una recompensa de alimentos. Después de la inspección sanitaria, fueron guiados suavemente con las manos hacia la caja de transporte. El palo de tiro no se utilizó en la mesa de examen para asegurarse de que las manos del entrenador estuvieran libres para asegurar a los animales. Cuando los conejos volvieron a entrar en la caja de transporte y se cerró la puerta, la caja se transfirió al corral y se abrió la puerta. Se hizo que el conejo siguiera el palo objetivo y abandonara la caja, seguido de la presentación de la recompensa de comida, como se describe en el paso de entrenamiento 7.6.

El día 2, los conejos fueron recogidos por la técnica convencional, utilizada rutinariamente por los cuidadores de animales (es decir, se les sujetó por el pescuezo con una mano y se les levantó brevemente sobre el otro brazo con la cabeza hacia el pliegue del brazo). Luego fueron trasladados a la mesa de examen y se realizó una inspección sanitaria, como se describió anteriormente. Después de la inspección sanitaria, se les ofreció una recompensa de comida del tazón de recompensa. Finalmente, fueron nuevamente sujetados por el pescuezo y levantados brevemente sobre el brazo para llevarlos de regreso al corral. Después de ser liberados, se les ofreció de nuevo una recompensa de comida.

Después de ofrecer la recompensa de comida a los conejos en el corral, el entrenador se sentó en el suelo del corral sin interactuar con los conejos y se grabó un video de 2 minutos, que se analizó retrospectivamente utilizando BORIS53. Cabe señalar que las observaciones de animales individuales se realizaron dentro del grupo porque debían ser monitoreados en su entorno familiar. Esto significa que los conejos podrían interactuar entre sí. Se investigaron y definieron los siguientes parámetros: Tiempo de interacción con el entrenador o la caja de transporte (es decir, un conejo estaba en la zona de interacción del entrenador o de la caja de transporte cuando la nariz estaba a menos de una longitud corporal del entrenador o de la caja); Tiempo de permanencia en la caja de transporte (es decir, este evento ocurrió cuando el animal estaba en la zona de interacción de la caja; comenzó cuando los conejos entraron en la caja con las cuatro patas y se detuvo cuando una o más patas se colocaron fuera de la caja); Duración del tiempo que pasó comiendo (es decir, el conejo ingirió paja, heno, gránulos o heces; masticar la ropa o los zapatos del entrenador no se consideró como comer); tiempo de permanencia en la clandestinidad (este evento comenzaba cuando el conejo entraba en una casa o túnel con las cuatro patas; se detenía cuando el conejo salía del refugio con una o más patas); saltar en el regazo (es decir, el conejo saltó sobre el regazo del entrenador y colocó las cuatro patas sobre él; este evento ocurrió cuando el animal estaba en la zona de interacción del entrenador); Colocar las patas delanteras en las patas (es decir, el conejo colocó ambas patas delanteras en las patas del entrenador; este evento ocurrió cuando el animal estaba en la zona de interacción del entrenador).

El análisis conductual fue realizado por el entrenador y una persona totalmente ciega al procedimiento realizado. De acuerdo con Landis y Koch54, la confiabilidad entre el entrenador y la persona ciega calculada usando BORIS53 (Cohens Kappa) fue sustancial hasta casi perfecta. Para su posterior análisis, se utilizaron datos extraídos por el observador ciego.

La prueba de rangos con signo de Wilcoxon reveló que la técnica de manejo convencional redujo significativamente el tiempo dedicado a interactuar con el "dispositivo de manejo", es decir, la suma del tiempo dedicado a interactuar con el entrenador y la caja después de ser recogido (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,89; Figura 5A). La técnica de manejo no afectó significativamente el tiempo de interacción con el entrenador (z = 1,014, p = 0,310, r = 0,28; Figura 5B). Por el contrario, recoger a los conejos por la caja aumentó el tiempo que interactuaron con la caja (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,66; Figura 5C) y gastados en la caja (z = 2,201, p = 0,028, r = 0,61; Figura 5D) en comparación con la técnica de manipulación convencional. Además, los animales pasaron más tiempo escondidos en los refugios después de ser recogidos por la técnica de manejo convencional (z = -1,992, p = 0,046, r = 0,046; Figura 5F).

La técnica de manejo no tuvo efecto significativo en el tiempo que los animales pasaron comiendo (z = 0,944, p = 0,345, r = 0,26; Figura 5E), el número de conejos que colocaron sus patas delanteras sobre las patas del entrenador (McNemar: p = 1.000) o saltaron sobre el regazo del entrenador (McNemar: p = 0.500). Independientemente de la técnica de manejo, el conejo #9 saltó sobre el regazo del entrenador y el conejo #12 colocó sus patas delanteras sobre las piernas del entrenador. Además, los conejos #8 y #11 ponen sus patas delanteras en las patas después de ser recogidos por la caja de transporte.

Mientras que la recompensa de comida ofrecida en la mesa de examen fue ingerida por todos los conejos después del breve transporte en la caja, solo un conejo # 8 la aceptó después de la técnica de manipulación convencional. Esta diferencia fue significativa (McNemar: p = 0,031). En el corral, la recompensa de comida fue aceptada por seis conejos (es decir, todos excepto el #7) después de dejar la caja de transporte y cuatro conejos (#7, #9, #10 y #12) después de ser liberados del brazo (técnica de manejo convencional; McNemar: p = 0,625).

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Figura 1: Horario de tiempo. Todas las sesiones de habituación, entrenamiento y generalización, así como las observaciones del comportamiento, se llevaron a cabo por la mañana antes de la alimentación y la limpieza. En la semana 1 (es decir, cuatro días después de la llegada), se llevaron a cabo cinco sesiones de acondicionamiento/habituación contextual (de lunes a viernes; sección 3 del protocolo) por parte de los cuidadores de los animales y el autor correspondiente (todas hembras), seguidas de un período de entrenamiento de 3 semanas en las semanas 2-4 (de lunes a viernes; sección 4-9 del protocolo). Las sesiones de entrenamiento fueron dirigidas por el autor correspondiente, que es un veterinario especializado en ciencia de animales de laboratorio y con experiencia en el entrenamiento de conejos, ratones, pollos y caballos. Después de eso, se realizaron observaciones de comportamiento durante dos días consecutivos para investigar si la técnica utilizada para levantar a los conejos del suelo afectaba su comportamiento. En la semana 5, se llevaron a cabo cinco sesiones de generalización (de lunes a viernes) para evaluar si los conejos realizarían las conductas objetivo aprendidas con otra persona que no fuera el entrenador. En la semana 6 y la semana 7 (los jueves), así como en la semana 14 (lunes/martes), el entrenador probó en el contexto de la inspección general de salud semanal si los conejos podían retener y mostrar los comportamientos objetivo. En la semana 7 se llevó a cabo una prueba de enfoque voluntario con el entrenador y una persona desconocida para investigar las respuestas conductuales de los conejos hacia los humanos conocidos frente a los desconocidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Campo de entrenamiento. El campo de entrenamiento (ver Tabla de Materiales) se instaló unos minutos antes de que comenzara el entrenamiento. (A) Para facilitar el transporte y la instalación, la arena constaba de dos piezas, que estaban conectadas entre sí en el corral. (B) Dos filas de paneles de plástico transparente crearon una arena de aproximadamente 136 cm × 90 cm × 70 cm. La puerta se fijó a los otros paneles mediante bridas que permitían abrirla y cerrarla. La puerta se puede bloquear con un clip. Como las paredes de la arena de entrenamiento eran transparentes, un conejo tenía contacto visual, olfativo y acústico con los miembros del grupo cuando entraba en la arena de entrenamiento. Un taburete/escalón bajo como asiento para el entrenador y, dependiendo del comportamiento objetivo a entrenar, se puede colocar una báscula o una caja de transporte en la arena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cuenco de recompensa con clicker integrado. El cuenco de recompensa se imprimió en 3D con ácido poliláctico blanco (PLA). Tamaño del cuenco cuadrado: 8 cm × 8 cm × 3 cm; Tamaño del mango cilíndrico: 9,5 cm × 2,3 cm. Un clicker de dedo (ver Tabla de Materiales) estaba unido al mango. Un archivo de impresión 3D para el cuenco de recompensa se puede encontrar en el Archivo de codificación suplementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Prueba de aproximación voluntaria. (A) En los dos ensayos de 5 minutos, el entrenador conocido y una persona femenina desconocida se sentaron uno frente al otro en el corral, con la parte posterior mirando hacia la pared del corral. Se colocó una casa y un túnel cerca de las otras dos paredes a la misma distancia de ambas personas. (B) Se analizó el tiempo de interacción con una persona para cada conejo. Un conejo interactuaba con una persona cuando las cuatro patas estaban en el cuadrado de 70 cm × 70 cm alrededor de una persona o en la línea fronteriza de este cuadrado. Los símbolos indican los datos de cada animal individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Efectos de las técnicas de manejo en el comportamiento de los conejos. (A-F) Ilustraciones de datos de comportamiento recolectados de siete conejos después de que fueron manipulados por la caja de transporte o por la técnica convencional (es decir, fueron sujetados por el pescuezo de su cuello y levantados en el brazo). Dado que el entrenador y la caja de transporte se consideraron como "dispositivos de manipulación", (A) Este panel muestra la suma de los paneles B y C. Los símbolos indican los datos de cada animal individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ConejoNúmero de sesiones de entrenamiento necesarias para entrenar el comportamiento objetivo
Siguiendo el objetivoPesajeIntroducción de la caja de transporteCríaSaltar en el regazo
#111222
#211415
#321314
#472132 (paso 9.2)
#521313
#621211
#781223 (paso 9.3+)
#821211
#921212
#1022335 (paso 9.3)
#1121224
#1221111
#1323124
Mediana (percentil 25-75)21212.5
(2–2)(1–1.5)(1.5–3)(1–2)(1–4)*

Tabla 1: Número de sesiones necesarias para entrenar las conductas objetivo. Si un conejo no aprendió el paso final de un comportamiento objetivo, el último paso de entrenamiento alcanzado se indica entre paréntesis.

Definición de una sesión de entrenamiento: aproximadamente 30 minutos por grupo (6-7 animales); De lunes a viernes durante tres semanas; comienza cuando el entrenador se sienta en el corral y está preparado para comenzar el entrenamiento; termina cuando ninguno de los conejos participa más en el entrenamiento o todos los conejos alcanzaron un paso final de un comportamiento objetivo; Un animal puede realizar más de un ensayo por sesión.

* Los conejos #4, #7, #10 fueron excluidos de este cálculo ya que no llegaron al paso final de "saltar en el regazo".

ConejoNúmero de sesiones de entrenamiento hasta que se alcanzó el paso final del comportamiento objetivo
Pesaje (5 pasos de entrenamiento)Entrada en la caja de transporte (6 pasos de entrenamiento)Cría (3 pasos de entrenamiento)Saltar en el regazo (9 pasos de entrenamiento)
#11311
#21311
#3131F (9.3)
#4FFF3 (9.2)
#52322
#61133
#71133 (9.3+)
#81113
#91113
#101333 (9.3)
#11113F (9.3)
#121133
#131325
Mediana (percentil 25-75)1223
(1–1)(1–3)(1–3)(1.25–3)
(excluyendo el #4)(excluyendo el #4)(excluyendo el #4)(excluyendo #3, #4, #7, #10, #11)

Tabla 2: Generalización. En cinco sesiones (de lunes a viernes), un cuidador de animales familiarizado con los conejos les pidió que realizaran los pasos finales (o el último paso alcanzado) de los comportamientos objetivo entrenados. Si no se alcanzó el paso final de un comportamiento objetivo, el último paso de entrenamiento alcanzado se indica entre paréntesis. F (fracaso) se indicaba cuando un animal no mostraba el último paso de una meta de comportamiento previamente alcanzada en el entrenamiento. Definición de sesión: de lunes a viernes durante una semana; comienza cuando el cuidador y el entrenador del animal se sientan en el corral; termina cuando ninguno de los conejos participa (ya) o todos los conejos mostraron el paso final (o el último paso alcanzado) de un comportamiento objetivo deseado; Un animal puede realizar más de un ensayo por sesión.

Archivo de codificación suplementario 1: Archivo de impresión 3D "cuenco de recompensa". El ácido poliláctico (PLA) se puede utilizar para la impresión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero complementario 1: Ficha de documentación de seis conejos. La hoja debe imprimirse o abrirse en una tableta para documentar el progreso del entrenamiento de cada conejo. En cada sesión de entrenamiento, se debe anotar qué pasos de entrenamiento alcanzaron los animales individuales o si se requirieron adaptaciones al protocolo. También se debe documentar cualquier ocurrencia especial (por ejemplo, factores externos, deterioro del estado de salud). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 2: Protocolos de formación simplificados. Las tablas describen los pasos de las secciones 3-9 del protocolo de manera simplificada. Para más detalles, se deben leer los pasos del protocolo del manuscrito principal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los protocolos de capacitación se desarrollaron para refinar los procedimientos de rutina, como el manejo, las inspecciones sanitarias y el pesaje en conejos de laboratorio. Su factibilidad se evaluó en este estudio exploratorio utilizando trece conejos blancos hembras de Nueva Zelanda. Los protocolos de entrenamiento podrían aplicarse de manera confiable para entrenar con éxito a los conejos. La mayoría de los conejos fueron capaces de aprender los comportamientos objetivo definidos en los protocolos de entrenamiento en menos de 3 semanas de período de entrenamiento, los recordaron después de descansos de entrenamiento de 1 semana y los generalizaron a otra persona que no fuera el entrenador. Se tuvieron que hacer pocas adaptaciones al protocolo para satisfacer las necesidades de los animales individuales. El principal hallazgo del presente estudio fue que la técnica de manejo refinada para recoger conejos, tal como se describe en los protocolos de entrenamiento, fue menos aversiva que la técnica de manejo convencional. Curiosamente, los conejos entrenados mostraron su comportamiento exploratorio no solo hacia el entrenador familiar, sino también hacia una persona desconocida en una prueba de enfoque voluntario.

Significado del objetivo

El objetivo sirvió de base para el presente protocolo de formación. Al introducir el objetivo, los animales aprendieron que su comportamiento afectaba al entorno y generaba consecuencias. La introducción del objetivo genera confianza entre el humano y el animal, como lo demostró el conejo # 4, se necesitaron 7 sesiones de entrenamiento antes de seguir el palo objetivo en la arena de entrenamiento, pero aprendió los siguientes comportamientos de objetivo rápidamente (es decir, dentro de 1-3 sesiones de entrenamiento). Este conejo #4 pareció ganarse la confianza del entrenador durante la introducción del objetivo, lo que facilitó el entrenamiento de los otros comportamientos objetivo. Sin embargo, este conejo todavía carecía de confianza en otras personas y no estaba dispuesto a mostrar la mayoría de los comportamientos objetivo en las sesiones de generalización.

Debe tenerse en cuenta que el objetivo no se definió como punto final en algunas secciones del protocolo. En cambio, por ejemplo, los animales tenían que seguir el objetivo durante un número variable de saltos o permanecer en la báscula durante un número variable de segundos. Se eligió un patrón de recompensa variable para aumentar y mantener la atención y motivación de los conejos en el entrenamiento.

Señales

Después de que los conejos hubieran realizado con éxito el paso 5.1, en todas las sesiones de entrenamiento siguientes, el entrenador colocó el objetivo a una distancia cercana a la nariz del conejo para indicarle que la prueba de entrenamiento comenzaba. Si el conejo tocaba el objetivo con la nariz o la boca, se consideraba la voluntad de participar en el entrenamiento y comenzaba el entrenamiento.

Los protocolos actuales no incluían ninguna otra señal, por ejemplo, la báscula, la caja de transporte o la mano no se consideraban señales. En su lugar, el objetivo se utilizaba para llevar al animal a la arena de entrenamiento, a la báscula, a la caja de transporte, al aire (cría) o al regazo del entrenador. Esto significa que los comportamientos de la meta "pesar", "entrar en la caja de transporte", "levantarse" y "saltar en el regazo" eran modificaciones de "seguir el objetivo". La razón de esto fueron los requisitos para el protocolo de entrenamiento: debía ser factible para ser realizado por el personal de los animalarios, que puede no ser experto en el entrenamiento de animales, y fácilmente integrable en la rutina diaria de trabajo. Por lo tanto, los protocolos deben ser eficientes y lograr los comportamientos objetivo rápidamente.

Sin embargo, la mano que se coloca delante del conejo (paso 8.3), la báscula o la caja de transporte también tienen el potencial de convertirse tanto en una señal como en un objetivo para las patas. Por lo tanto, puede ser posible definir pasos adicionales que vayan más allá de los protocolos actuales y no requieran el uso del palo de destino. Por ejemplo, tan pronto como el conejo ve la escala, la escala les indica a los conejos que salten sobre ella con las cuatro patas.

Adaptaciones de los protocolos

Aunque se puede esperar que el fenotipo de los animales de laboratorio casi genéticamente idénticos sea muy similar, existen "diferencias de comportamiento entre los individuos que son consistentes a lo largo del tiempo y en todas las situaciones [y] se denominan personalidad"55, por ejemplo, algunos animales son bastante tímidos y otrosaudaces56. Los animales tímidos y menos exploradores pueden tardar más en aprender los comportamientos objetivo definidos en el protocolo (por ejemplo, conejo #4). Aunque los protocolos de adiestramiento estándar puedan ser adecuados para la mayoría, el adiestramiento debe tener en cuenta las necesidades de cada animal y adaptarse a ellas, cuando sea necesario26. Por lo tanto, se deben definir pasos intermedios adicionales más pequeños para aquellos conejos que no logren aprender un paso de entrenamiento del protocolo. Las etapas intermedias adicionales de capacitación deberían ayudarles a avanzar con éxito hacia la siguiente etapa. Especialmente debido a que los planes de entrenamiento se desarrollan en teoría y luego se prueban en la práctica, puede resultar evidente que se requieren pasos de entrenamiento adicionales para entrenar un comportamiento objetivo en particular.

Con respecto a los protocolos de entrenamiento actuales, se tuvieron que agregar algunos pasos de entrenamiento intermedios para los comportamientos objetivo "seguir el objetivo", "entrar en la caja de transporte", "criar" y "saltar en el regazo", como se describe en detalle en la sección sobre los resultados representativos, ya que los animales individuales no continuaron con el siguiente paso de entrenamiento. Curiosamente, la mayoría de los conejos requerían los pasos intermedios 8.2+ y 9.3+, lo que enfatiza su importancia. Por lo tanto, estos pasos se agregaron como una nota a los protocolos de capacitación.

Alternativamente, al paso definido 8.2+, el entrenador podría colocar una mano en el suelo con la palma hacia arriba y dejar que el conejo pise la mano con una y eventualmente ambas patas delanteras. Además, es concebible que un conejo requiera pasos intermedios adicionales antes del paso 9.3+, por ejemplo, primero el conejo coloca una pata trasera y luego ambas patas traseras en el regazo del entrenador. Si un conejo no acepta ser tocado en los pasos 9.5-9.9, la duración del contacto con las diferentes partes del cuerpo podría aumentarse gradualmente. Además, inicialmente solo se podían usar los dedos índice y medio para acariciar a los animales con una presión ligera como una pluma. Luego, el número de dedos utilizados para tocar y la presión se pueden aumentar en varios pasos.

Perfeccionamiento de las técnicas de manipulación

Se puede suponer que el manejo es altamente aversivo, especialmente en conejos con un rasgo de personalidad tímido. Los conejos son animales de presa terrestres y es probable que el hecho de ser levantados (es decir, levantados del suelo) o restringidos (es decir, sostenidos en los brazos de un humano) para una inspección de salud y un procedimiento experimental causen ansiedad y angustia. En los protocolos de entrenamiento se introdujo una opción para refinar los métodos de manejo: en lugar de sujetar al conejo por el pescuezo y levantarlo sobre el otro brazo, el conejo puede ser conducido con el palo de diana a la caja y llevado en la caja a la mesa de examen, como se sugirió anteriormente50. 57, donde el conejo se transfiere suavemente de la caja a la mesa. Alternativamente, se puede quitar la parte superior de la caja, o se puede guiar al conejo con el palo de objetivo fuera de la caja.

Las observaciones conductuales realizadas después de que los conejos fueron recogidos utilizando la técnica de manejo convencional o la caja de transporte revelaron que la técnica de manejo convencional se asoció con un comportamiento más relacionado con el estrés y la ansiedad que la técnica alternativa. Esta conclusión se extrajo del alto número de animales que rechazaban la recompensa de comida en la mesa de examen y del mayor tiempo que pasaban escondidos en los refugios cuando se aplicaba la técnica de manipulación convencional. Curiosamente, la técnica de manejo no afectó el tiempo de interacción con el entrenador, lo que indica que el proceso de manejo puede no haber afectado la relación humano-animal. Sin embargo, además del entrenador, la caja de transporte también servía como "dispositivo de manipulación" (es decir, el dispositivo de manipulación de la técnica convencional era el entrenador, los dispositivos de manipulación de la técnica alternativa eran tanto el entrenador como la caja de transporte). Por lo tanto, también se analizó el tiempo de interacción con la caja de transporte. Aunque los conejos acababan de ser recogidos con la caja de transporte, pasaban más tiempo interactuando con la caja o dentro de la caja que cuando eran recogidos por la técnica convencional. Esto sugería que la caja de transporte podría estar asociada con un efecto positivo. Al comparar el tiempo dedicado a interactuar con ambos "dispositivos de manipulación" (es decir, la suma del tiempo dedicado a interactuar con la caja y el entrenador), la técnica de manipulación de la caja aumentó el tiempo de interacción con los "dispositivos de manipulación", es decir, esta técnica tuvo un claro efecto positivo en la respuesta conductual de los conejos hacia los "dispositivos de manipulación" en previsión de ser manipulados. Hallazgos similares se realizaron en ratones de laboratorio, demostrando que las técnicas de manejo suave y el entrenamiento redujeron el estrés y la ansiedad: los animales que fueron recogidos usando un túnel o las manos ahuecadas pasaron más tiempo interactuando voluntariamente con el "dispositivo de manipulación" y mostraron menos comportamiento relacionado con la ansiedadque los ratones con mango de cola. El entrenamiento pareció reforzar este efecto. Leidinger et al. demostraron que los ratones de manejo suave (túnel/taza) mostraron menos micción, defecación y vocalización cuando estaban sujetos por el pescuezo y menos comportamiento de flotación en la prueba del laberinto acuático de Morris cuando fueron entrenados con PRT en comparación con los ratones no entrenados13.

Viabilidad de los protocolos para el trabajo diario: duración de la formación, retención y generalización.

El número de sesiones de entrenamiento necesarias para aprender un comportamiento objetivo dependía del animal individual y de los comportamientos objetivo, que comprendían un número diferente de pasos que iban desde la sección 3 hasta la sección 9 del protocolo presentado anteriormente.

De acuerdo con el número de animales que lograron aprender un comportamiento objetivo y el número de adaptaciones que se tuvieron que hacer a los protocolos para los animales individuales, los pasos de entrenamiento tuvieron diferentes niveles de dificultad. El comportamiento de "seguir al objetivo" fue la primera experiencia de entrenamiento de los conejos y, por lo tanto, a algunos animales les tomó más tiempo entrenarse en este comportamiento que en el otro comportamiento objetivo, como se discutió anteriormente. Si bien todos los animales podían ser entrenados en el "pesaje" de acuerdo con el protocolo actual, se requerían medidas provisionales adicionales para "entrar en la caja de transporte" por dos animales y para la "cría", así como para "saltar en el regazo" por casi todos los conejos. Esto puede explicarse por el grado de contacto físico entre el animal y el entrenador que fue necesario para realizar las diferentes conductas objetivo. El "pesaje" y la "entrada en la caja de transporte" no implicaban ningún contacto físico entre el animal y el ser humano. El paso final de la "cría" (8.3) y los pasos 9.2-9.4 de "saltar en el regazo" requerían que los conejos hicieran contacto físico con el entrenador. Además, el entrenador tocó el hombro, la espalda, la grupa, las orejas o las patas del conejo en los pasos 9.5-9.9 de "salto en el regazo", aumentando el grado de contacto físico entre el animal y el entrenador. Aceptar que los tocaran fue más difícil para algunos conejos que para otros. Como se ha comentado anteriormente, fue beneficioso adaptar los protocolos de entrenamiento de estas conductas objetivo y añadir pasos intermedios.

Sin embargo, tres conejos requirieron sesiones de entrenamiento adicionales para completar el comportamiento objetivo "saltar en el regazo" (# 4, # 7, # 10). Se podían excluir las deficiencias físicas que impedían a estos animales saltar sobre el regazo del entrenador. Además, los conejos podían saltar a sus casas, las alturas de estas eran más altas que el regazo del entrenador.

Se notó que dos de estos tres conejos (#4 y #10) necesitaron más tiempo para acostumbrarse al entrenador, así como a la recompensa de comida en las sesiones de habituación, y parcialmente necesitaron más sesiones de entrenamiento para alcanzar el paso final de otros comportamientos objetivo. Esto también fue cierto para el conejo #7, que tuvo una lesión en la cola debido a peleas dentro del grupo desde la cuarta sesión de habituación. Por lo tanto, el conejo # 7 fue recogido, transferido a la mesa de examen, tratado e inspeccionado diariamente durante 15 días, lo que puede haber resultado en una mayor precaución hacia los humanos. Por un lado, es crucial tener en cuenta que el rendimiento del entrenamiento puede verse afectado, por ejemplo, por un estado de salud deteriorado, un aumento de los niveles de estrés o una relación humano-animal perturbada debido a otras intervenciones. Por otro lado, estas observaciones demostraron la importancia de la habituación para el entrenador y la recompensa de la comida. Algunos animales pueden necesitar más tiempo para familiarizarse con la presencia del entrenador y aceptar la recompensa de comida del entrenador. Si se hubieran realizado sesiones de habituación adicionales, el conejo # 4 y # 10 podría haberse desempeñado mejor en las sesiones de entrenamiento. La relevancia de habituar a los conejos para los humanos ya ha sido reportada en la literatura. El criador comercial, al que se compraron los conejos utilizados en este estudio, introdujo recientemente sesiones regulares de caricias, lo que redujo el comportamiento relacionado con el estrés y eliminó las agresiones58. En un estudio anterior, se demostró que las caricias y el manejo de conejos jóvenes disminuyen el comportamiento relacionado con la ansiedad, aumentan su aumento de peso y reducen la tasa de mortalidad59.

Una vez que los conejos habían aprendido los diferentes comportamientos objetivo, aún podían mostrarlos después de dos descansos de entrenamiento cortos (una semana) y largos (aproximadamente 7,5-9,5 semanas), excepto con excepciones individuales. Estas observaciones pueden indicar que es suficiente pedir a los conejos que realicen los comportamientos de gol entrenados una vez a la semana cuando se realiza el examen general y se limpia la habitación/corral.

Para la viabilidad del protocolo para la vida laboral diaria, también es crucial que los conejos generalicen los comportamientos objetivo entrenados a otras personas que no sean el entrenador. En caso de vacaciones o enfermedad, otra persona tiene que continuar con el entrenamiento y cuidado de los animales. La mayoría de los conejos (doce de trece) generalizaron las conductas objetivo "pesar", "entrar en la caja de transporte" y "criar" al cuidador del animal, aunque, en algunos casos, los conejos necesitaron más de una sesión de entrenamiento para mostrar el comportamiento deseado. "Pesar" parecía generalizarse mejor; seguido de "introducción de la caja de transporte" y "cría". Sin embargo, "saltar en el regazo" parecía ser más difícil de generalizar a otra persona. Los animales tardaron más en demostrar el comportamiento deseado (9.9.) y dos conejos, que previamente habían aprendido el paso final 9.9, no lograron mostrar este comportamiento objetivo, posiblemente debido al mayor contacto físico necesario (ver arriba). Un conejo (#4) no mostró ningún paso de los comportamientos objetivo "pesar", "entrar en la caja de transporte" y "criar" y no estaba interesado en interactuar con el cuidador del animal. El conejo #4 fue uno de los animales que necesitó más tiempo para acostumbrarse al adiestrador y a la recompensa de comida en las sesiones de habituación. Esto puede indicar que, para algunos individuos, las sesiones adicionales en las que los cuidadores de los animales pasan tiempo con los conejos, los habitúan a aceptar la recompensa de la comida de ellos y construyen un vínculo positivo son beneficiosas23. Los conejos pueden ser capaces de distinguir entre diferentes personas, como se ha demostrado en el caso de las ratas60. Otros factores que tienen el potencial de afectar el rendimiento de los conejos en las sesiones con el entrenador y el cuidador del animal pueden ser señales inconscientes que el entrenador dio a los animales durante las sesiones de entrenamiento, por ejemplo, la posición del palo objetivo o el tazón de recompensa, la posición del cuerpo o el movimiento. Si el entrenador no está consciente de estas señales, no se documentarán y las otras personas no imitarán estas señales.

Además, las habilidades de entrenamiento de las personas que trabajan con los animales, incluida la rutina de manejo del palo de tiro y la presentación de recompensas, pueden influir en el comportamiento de los animales. Además del conocimiento de los principios de aprendizaje y la comunicación animal, se necesitan experiencias prácticas para entrenar con éxito a un animaly recuperar un comportamiento objetivo. Dado que no se compararon las sesiones de generalización en las que participaba una persona cualificada y una no cualificada, no se puede determinar la pertinencia del factor "habilidades de formación". Sin embargo, según el conocimiento de los autores, una gran proporción del personal de animales de laboratorio no está capacitado en el entrenamiento de animales y, por lo tanto, las condiciones en las que se realizaron las sesiones de generalización (es decir, involucrar a un cuidador de animales con poca experiencia previa en el entrenamiento de clicker) representaban un entorno realista en las instalaciones de animales de laboratorio.

Los datos representativos de los protocolos proporcionan a los animalarios una idea de la carga de trabajo asociada al entrenamiento de las diferentes conductas objetivo. Los datos pueden ayudar a los animalarios a crear sus propios horarios de trabajo al implementar (partes de) el protocolo. Dependiendo del animal individual y de los comportamientos objetivo, se debe reservar un tiempo adicional para el proceso de generalización. Sin embargo, la duración del tiempo puede variar cuando se trabaja con conejos machos u otra raza de conejo. En las instalaciones para animales, se debe mantener una discusión sobre si existe el tiempo adecuado y qué debe cambiarse para permitir tiempo para el entrenamiento de los animales.

Además del tiempo necesario para el adiestramiento de los animales, hay que tener en cuenta que la formación requiere formadores cualificados y enseñar al personal a adiestrar a los animales también puede llevar mucho tiempo. Si la capacitación fuera una parte obligatoria de la educación del personal de animales de laboratorio, es decir, cuidadores de animales, veterinarios e investigadores, la implementación de la capacitación de animales en las instalaciones se facilitaría y tomaría menos tiempo. Según el anexo III de la Directiva 2010/63/UE, "los establecimientos establecerán programas de habituación y formación adecuados a los animales, los procedimientos y la duración del proyecto", es decir, el adiestramiento de los animales es obligatorio por ley. En Alemania, estos programas deben presentarse al solicitar una licencia de experimentación con animales. Esto requiere que las personas que planifican experimentos con animales y trabajan con animales de laboratorio estén capacitadas en el entrenamiento de animales. Sin embargo, al menos en Alemania, el adiestramiento de animales no forma parte del programa de formación de los cuidadores de animales en el campo de la investigación y la clínica 62,63,64. Además, no se menciona explícitamente en las recomendaciones de la UE para el marco de educación y formación65. Por lo tanto, mientras la formación no se haya implementado en estas normas, el desarrollo profesional continuo centrado en la formación en refuerzo positivo necesita más atención. El personal de los animales de laboratorio necesita aprender los principios de las técnicas de aprendizaje y entrenamiento, los criterios necesarios, la transferencia de procedimientos entre los entrenadores, el mantenimiento de registros y cómo responder a los animales que no participan de la manera deseada para garantizar la coherencia y la previsibilidad.

Interacción humano-animal

El tiempo intensivo de interacción humano-animal durante las sesiones de entrenamiento proporciona un entorno óptimo para fortalecer la relación entre los conejos individuales y el entrenador26,66. Una relación positiva entre el ser humano y el animal es beneficiosa para el bienestar de los animales, ya que puede reducir sus niveles de estrés en la cría y en entornos experimentales67. En los protocolos de entrenamiento presentes, el entrenador considera la agencia de los conejos y pueden decidir participar (o no participar) en el entrenamiento de forma voluntaria. Proporcionar a los animales agencia es beneficioso para su bienestar 16 y, por lo tanto, debe perseguirse en los experimentos, así como en el alojamiento y la cría. Existen diferentes niveles de agencia conductual68; la participación en el PRT puede atribuirse al nivel de agencia impulsado por la acción, es decir, "comportarse activamente para lograr los resultados actuales [por ejemplo, procurar alimentos]"68.

Al analizar el acercamiento voluntario de los conejos hacia el entrenador y una persona desconocida, se pudo observar una intensa interacción humano-animal. Los resultados revelaron que todos los conejos, excepto un animal en elprimer ensayo ( #12), interactuaron tanto con el entrenador como con la persona desconocida. Parecían reconocer al entrenador ya que mostraron una clara preferencia por interactuar con el entrenador en la1ª prueba y algunos de ellos saltaron con las cuatro patas en el regazo del entrenador; Un comportamiento que no se mostró hacia la persona desconocida. Aunque los conejos pasaron más tiempo interactuando con el entrenador que con la persona desconocida en la1ª prueba, el tiempo de interacción ya no difirió en la2ª prueba. Una razón para esta observación puede ser que los conejos esperaban recibir una recompensa de comida del entrenador en elprimer ensayo y , debido a la falta de recompensas de comida en la prueba de enfoque voluntario, ya no pasaron más tiempo con el entrenador en elsegundo ensayo. Sin embargo, estos datos enfatizaron que los conejos entrenados se habituaron rápidamente a la presencia de una persona desconocida y ninguno de ellos era demasiado tímido para interactuar. Por el contrario, eran muy exploradores e interesados en la persona desconocida. Sin embargo, dado que no se investigó un grupo de control no entrenado, el efecto del entrenamiento en el comportamiento de acercamiento voluntario de los conejos no está claro.

Una hipótesis que explica el comportamiento del conejo #12 en el 1erensayo es que este individuo todavía tenía que habituarse a la presencia de la persona desconocida en elprimer ensayo y estaba más interesado en interactuar tanto con el entrenador (70 segundos) como con la persona desconocida (9 segundos) en elsegundo ensayo. Los conejos tienen diferentes rasgos de personalidad que pueden afectar el nivel de comodidad alrededor de personas desconocidas y, a su vez, la latencia para acercarse o la duración del tiempo de interacción con una persona69,70.

Limitaciones

Somos conscientes de que todos los conejos en el corral/habitación, no solo el que participa en el entrenamiento, pueden escuchar el clic (es decir, el reforzador condicionado) durante una sesión de entrenamiento y su efecto reforzante puede debilitarse ya que la recompensa de la comida (es decir, el reforzador natural/incondicionado) no se presenta. Si un conejo fuera de la arena de entrenamiento muestra un comportamiento entrenado y escucha el clic, pero no se le presenta comida (y este escenario ocurre varias veces), el comportamiento entrenado puede extinguirse. Este fenómeno se conoce como extinción64,71. Sin embargo, dado que todos los comportamientos de los objetivos de los protocolos presentes dependen del objetivo presentado por el entrenador, es poco probable que ocurra la extinción en nuestro entorno de entrenamiento.

Dado que las paredes del campo de entrenamiento eran transparentes y el campo de entrenamiento estaba ubicado en el corral, los conejos podían verse, escucharse y olerse entre sí durante el entrenamiento, lo cual es una clara ventaja relacionada con el bienestar. Además, es posible que los conejos hayan observado a los miembros de su grupo durante las sesiones de entrenamiento y hayan aprendido unos de otros. En ratas, se demostró previamente que los individuos aprendieron a realizar un comportamiento objetivo al observar a su compañero de jaula siendo entrenado por PRT45. Este hecho puede considerarse tanto como una ventaja como una desventaja. El progreso del aprendizaje de los animales puede ser más rápido cuando pueden observarse unos a otros. Sin embargo, los datos de los animales individuales pueden verse influidos por el rendimiento de los miembros del grupo y no pueden atribuirse únicamente al entrenamiento del animal individual. Por lo tanto, el entrenamiento de animales sin ningún contacto con los miembros de su grupo o conejos de un solo hogar podría llevar más tiempo.

Las observaciones conductuales de los individuos (en la prueba de enfoque voluntario y después de aplicar las diferentes técnicas de manejo) se llevaron a cabo en su entorno social y grupal familiar para evitar el estrés y la distracción causados por un entorno novedoso y la separación de su grupo, lo que a su vez habría afectado las observaciones conductuales. La desventaja es, sin embargo, que los conejos pueden haber influido en el comportamiento de los demás durante las sesiones de observación.

Los efectos de las técnicas de manejo solo se investigaron en siete animales involucrando al entrenador como persona que manejaba a los animales. Los autores planean un estudio de seguimiento que incluya un cálculo del tamaño de la muestra a priori para reproducir los hallazgos con otros manipuladores y examinar más a fondo las diferencias entre las técnicas de manipulación.

Todos los seres humanos involucrados en el entrenamiento, el manejo y la prueba de enfoque voluntario eran mujeres. No se investigó si el rendimiento del entrenamiento de los conejos o su comportamiento variarían si hubiera personas de sexo masculino involucradas.

Los protocolos de entrenamiento actuales deben dar al lector una idea de lo que se puede entrenar en conejos, pero no comprenden todos los posibles comportamientos objetivo que sería beneficioso entrenar en un conejo de laboratorio. Por ejemplo, marcar un conejo como se sugiere en la sección de protocolo sobre requisitos generales también valdría la pena entrenarlo usando PRT.

Como se señaló más arriba, la elección de la recompensa correcta no es trivial. Debido a las restricciones de higiene, el uso de hierbas frescas como recompensa alimentaria no está permitido en algunas instalaciones de animales de laboratorio y, por lo tanto, se deben usar recompensas alimentarias menos apropiadas, como semillas de girasol o golosinas de forrajeo a base de granos. Con respecto a la decisión sobre la recompensa alimentaria, algunas reglas y regulaciones de las prácticas actuales de laboratorio son perjudiciales para el bienestar de los animales y el entrenamiento efectivo y, por lo tanto, puede que deban reconsiderarse caso por caso. También puede ser posible utilizar alternativas a las recompensas de comida, por ejemplo, toques suaves o interacciones con el entrenador o elementos de enriquecimiento. Sin embargo, el entrenador debe asegurarse para cada animal individual de que la alternativa es recompensar al animal porque una recompensa solo es una recompensa si el conejo realmente lo favorece. Especialmente, las caricias pueden no ser recibidas como gratificantes por todos los conejos.

Conclusiones

En resumen, el presente estudio fue un primer paso para llenar el vacío de conocimiento sobre los protocolos de entrenamiento adecuados para conejos de laboratorio. Las hembras de conejo blanco de Nueva Zelanda podrían ser entrenadas para los procedimientos de cría de rutina utilizando PRT y generalizar los comportamientos objetivo aprendidos a otras personas, aunque se debe reservar tiempo adicional para el proceso de generalización. Las conductas de meta sin contacto físico parecían ser más fáciles de aprender que las conductas que requerían contacto físico con los humanos. Después de que los animales completaron con éxito el entrenamiento de un comportamiento objetivo, fue suficiente recuperarlos una vez a la semana en el contexto del examen general y la limpieza del corral. Los protocolos de adiestramiento que se consideran de aplicación general a todos los conejos son convenientes, pero el adiestrador debe ser consciente de que, en algunos casos, debe adaptarse a las necesidades del animal. Los resultados sobre las técnicas de manejo sugirieron que recoger a los conejos con la caja de transporte en lugar de sujetarlos por el pescuezo y levantarlos sobre el brazo era menos aversivo. Con todo, los protocolos actuales proporcionan instrucciones factibles para el proceso de habituación y entrenamiento de los conejos y pueden servir como refinamiento en las instalaciones de animales de laboratorio.

Los animales no deben sufrir debido al ahorro de trabajo, tiempo o dinero (al menos según la Ley Alemana de Bienestar Animal72). Es importante cuidar y manipular a todos los animales de la manera más suave posible. Dado que los animales no entrenados sufren en mayor grado de ansiedad y angustia causadas por los procedimientos experimentales y rutinarios de cría que sus contrapartes entrenadas13, el entrenamiento es una simple medida de refinamiento para prevenir eficazmente que experimenten estados afectivos negativos.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses relacionados con esta publicación.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los cuidadores de animales por cuidar de los conejos y su trabajo compasivo y dedicado. Gracias a Kai Diederich por revisar el manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cama-r' NestThe Andersons, Inc., Maumee, EE. UU. La implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Finger ClickerASCO
https://ascoshop.de/products/fingerclicker G*Powerversion 3.1.9.7
Heu-ProppenSsniff Spezialdiä ten GmbH, Soest, AlemaniaEl éxito de la implementación del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
IBM Corp. Lanzado en 2020. IBM SPSS Statistics para Windows,  Armonk, NY: IBM CorpIBM Corpversión 27.0.en el manuscrito denominado "Software para análisis estadístico avanzado"
Kaninchen Haltung + 25 mg/kg Salinomycin-Natrium-SondermischungSsniff Spezialdiä ten GmbH, Soest, AlemaniaEl éxito de la implementación del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Bloque de lignocelLignocel J. Rettenmaier & Sö hne GmbH + Co KG, Rosenberg, AlemaniaLa implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Lillebro geschä lte Sonnenblumenkerne", Martina GmbH, Mü nchen, Alemania) y Rainbow Foraging Bits (Bio-Serv, Flemington, EE. UU.)  Martina GmbH, Mü nchen, AlemaniaEl éxito de la implementación del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Microsoft Excel para Microsoft 365 MSO MicrosoftCorporationVersión 2305en el manuscrito denominado "hoja de cálculo"
Conejos blancos de Nueva Zelanda Charles River Laboratories Francia
Plattformwaage DE 35K5DLKERN & SOHN GmbH, Balingen-Frommern, AlemaniaEl éxito de la implementación del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Ropa de cama científica de primera calidad (fina y escamas)SAFE, Augy, FranciaEl éxito de la implementación del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Rainbow Foraging BitsBio-Serv, Flemington, EE. UU. La implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Bola de bocadillos fü r Kaninchen – 7 cmTRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, AlemaniaLa implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Palo de tiro con clicker integradoTRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, AlemaniaLa implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Trixi Transportbox Capri Open TopTRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, AlemaniaLa implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.
Weiden-HeuballJR FARM GmbH, Holzheim-Pessenburgheim, AlemaniaLa implementación exitosa del protocolo no depende de este producto en particular. Podría utilizar productos comparables de otras compañías.

Referencias

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