Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.
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Artículo de método
Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano
En este artículo
Resumen
Resumen
El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal. El epiplón desempeña un papel clave en la provisión de un microambiente de apoyo a las células de cáncer de ovario metastásico, así como señales inmunomoduladoras que permiten la tolerancia tumoral. Sin embargo, tenemos modelos limitados que imitan de cerca la interacción entre las células de cáncer de ovario y los tejidos ricos en tejido adiposo. Para comprender mejor los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el epiplón proporciona un microambiente protumoral, desarrollamos un modelo único ex vivo en 3D de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. Utilizando epiplón humano, podemos cultivar células de cáncer de ovario dentro de este microambiente rico en tejido adiposo y controlar los factores responsables del crecimiento tumoral y la regulación inmunitaria. Además de proporcionar una plataforma para el estudio de este microambiente tumoral rico en adiposo, el modelo proporciona una excelente plataforma para el desarrollo y la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos para atacar las células cancerosas metastásicas en este nicho. El modelo propuesto es fácil de generar, económico y aplicable a investigaciones traslacionales.
Introducción
El cáncer de ovario es la neoplasia maligna ginecológica más mortal en todo el mundo1. El riesgo de por vida de desarrollar este cáncer es de aproximadamente 1 en 70, con una mediana de edad de diagnóstico de 63 años2. Las neoplasias malignas primarias de ovario se clasifican histológicamente como epiteliales o no epiteliales. Los cánceres epiteliales de ovario (COE) representan más del 90% de los tumores, y el subtipo más común es el carcinoma seroso de alto grado (HGSC), que representa aproximadamente el 70-80% de los COE. En la actualidad, no existen métodos de cribado eficaces para detectar la enfermedad de forma precoz. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada (es decir, la Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] etapa III o IV) después de que el cáncer se ha diseminado por toda la cavidad peritoneal2.
El tratamiento estándar de primera línea es la cirugía citorreductora para extirpar toda la enfermedad macroscópica visible, seguida de quimioterapia adyuvante basada en platino para destruir cualquier enfermedad microscópica residual. Si bien ha habido muchos avances en el tratamiento del cáncer de ovario en las últimas dos décadas, aproximadamente el 70% de las pacientes con enfermedad avanzada recaerán dentro de los 3 años posterioresal tratamiento. Dado el mal pronóstico general de estos pacientes, los esfuerzos de investigación traslacional en curso y futuros en EOC tienen como objetivo identificar biomarcadores para la detección temprana, prevenir la metástasis, mejorar las terapias actuales para evadir la resistencia y desarrollar nuevos tratamientos personalizados contra el cáncer.
La metástasis generalizada dentro de la cavidad peritoneal y su quimiorresistencia asociada son dos de las principales limitaciones para la mejora del tratamiento de las pacientes con cáncer de ovario 4,5. El epiplón, una estructura grasosa parecida a un delantal que cuelga desde el estómago sobre los intestinos, es un sitio principal de metástasis de cáncer de ovario 6,7. Además de su función como barrera física, se ha demostrado que el epiplón tiene capacidades regenerativas y angiogénicas y posee actividades inmunitarias, que en conjunto promueven la vascularización, aceleran la cicatrización de heridas y limitan la infección8. Contiene una alta concentración de células madre que pueden diferenciarse en varios tipos de células y pueden ayudar a reparar los tejidos dañados. El epiplón puede inflamarse en respuesta a una lesión o infección, lo que desencadena la migración de las células inmunitarias al sitio dela lesión. Estas células inmunitarias liberan factores de crecimiento y otras moléculas que ayudan a promover la reparación y regeneración del tejido dañado. Las células inmunitarias, como los macrófagos, los linfocitos y las células plasmáticas, localizadas en el epiplón son estructuras conocidas como "manchas lechosas", que se encargan de detectar y atacar a los patógenos y de regular la inmunidad peritoneal. También se ha demostrado que el epiplón desempeña un papel en la inducción de la tolerancia inmunitaria10, que es la capacidad del sistema inmunitario para tolerar los autoantígenos y no atacar los tejidos sanos. Sin embargo, las mismas actividades relacionadas con el sistema inmunitario también están involucradas en las respuestas patológicas, como el crecimiento de tumores de epiplón, la metástasis y el escape de la vigilancia inmune 9,11. Estudios previos de nuestro laboratorio y de otros han demostrado un papel único y activo del microambiente adiposo en la inhibición de las respuestas inmunes antitumorales y en la adquisición de quimiorresistencia12,13,14. Desafortunadamente, tenemos información limitada sobre los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el epiplón proporciona un microambiente protumoral.
Para comprender mejor las interacciones entre las células cancerosas y el epiplón, se desarrolló un sistema de cultivo en 3D que consiste en células de cáncer de ovario humano y explantes de epiplón derivados de pacientes. El protocolo descrito aquí representa un nuevo modelo ex vivo de carcinomatosis peritoneal. Este modelo imita la progresión natural de la tumorigénesis del cáncer de ovario en este tejido rico en adiposo. El modelo propuesto es fácil de generar, económico y potencialmente aplicable a las investigaciones traslacionales en la investigación del cáncer de ovario.
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Protocolo
El siguiente protocolo de investigación fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Estatal de Wayne. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de la cirugía. La figura 1 ilustra los tres pasos generales de este protocolo.
1. Preparación del tejido del epiplón humano
- Preparar medios de cultivo de epiplón (DMEM/F12 + 10% de suero fetal bovino + 1% de penicilina-estreptomicina) y conservar a 4 °C. Alícuota 30-40 mL de este medio en un tubo cónico estéril de 50 mL o en un recipiente de muestras quirúrgicas.
- Obtener muestras quirúrgicas de una biopsia de epiplón o de una cirugía de omentectomía. Sumerja la muestra estéril en un medio de cultivo de epiplón inmediatamente después de la extracción en el quirófano. Si el flujo de trabajo no lo permite, coloque la muestra en un medio de cultivo de epiplón lo antes posible. Transfiera la muestra colocándola en hielo y guárdela a 4 °C hasta su procesamiento.
NOTA: El tamaño de la muestra de epiplón extraída determinará la cantidad de tejido trabajable. - Procese la muestra de epiplón dentro de 1-2 h después de la recolección utilizando una campana de flujo laminar. Asegúrese de que todos los materiales y herramientas estén estériles o esterilizados.
- Retire el epiplón del recipiente de recolección y transfiéralo a una placa de cultivo de 100 mm. Sumerja la muestra en 1 solución salina tamponada con fosfato (1 PBS) y lave suavemente la muestra para eliminar cualquier coágulo de sangre o desecho.
- Cortar el tejido en trozos (0,5 cm x 0,5 cm o 100-200 mg; Figura 2A) utilizando unas tijeras quirúrgicas pequeñas o un bisturí de 10-15 mm. Use pinzas quirúrgicas pequeñas para ayudar a manipular el tejido y evitar aplastar el epiplón. Si se utilizó un dispositivo de energía para extirpar quirúrgicamente la muestra de epiplón, evite usar el tejido distorsionado en el borde sellado.
- Coloque cada pieza de epiplón cortada en pocillos individuales de una placa de cultivo de 24 pocillos y llene los pocillos con 500 μL de medio de cultivo de epiplón o hasta un volumen que sea suficiente para cubrir el epiplón sin permitir que la pieza de epiplón flote sobre el piso del pocillo (Figura 2B).
- Almacenar los trozos de epiplón en medios de cultivo frescos a 4 °C hasta que estén listos para la inyección.
2. Preparación de células de cáncer de ovario
- Cultivar células de cáncer de ovario humano en un matraz de cultivo de 75cm2 a 37 °C y 5% de CO2 a al menos 75% de confluencia el día de la recolección del epiplón.
NOTA: Este protocolo utiliza células de cáncer de ovario humano OCSC1-F2 mCherry positivas descritas anteriormente15,16,17,18. Se puede modificar a cualquier línea celular cancerosa marcada con una señal de fluorescencia. - Prepare las células dentro de una campana de flujo laminar inmediatamente después de la recolección de la muestra de epiplón. Asegúrese de que todos los materiales y herramientas estén estériles o esterilizados.
- Añadir 10 ml de 1x PBS estéril al matraz de cultivo y lavar las células meciendo suavemente el matraz. Retire el PBS 1x y luego agregue 3 ml de tripsina-EDTA al 0,05%.
- Meca suavemente el matraz de cultivo para cubrir todas las células y, a continuación, colóquelo en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante no más de 5 minutos. Golpee el matraz de cultivo para separar completamente las células y luego neutralice la tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo de epiplón.
- Mezcle la suspensión celular pipeteando y luego transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 1.200 x g a 24 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 6 ml de medio de cultivo de epiplón fresco.
- Cuente las células con un hemacitómetro. Diluir la suspensión celular a al menos 100.000 células por cada 100-200 μL de suspensión. Este es el volumen de inyección en cada pieza cortada de epiplón.
- Transfiera un número adecuado de células a un nuevo matraz de cultivo para continuar el paso de las células.
3. Inyección de células de cáncer de ovario
- Use una jeringa de 1 ml para extraer la suspensión celular y luego coloque una aguja de 26 G. No extraiga la suspensión celular con la aguja, ya que esto puede fragmentar las células.
- Use unas pinzas quirúrgicas pequeñas para levantar un pedazo de epiplón cortado. Transfiera el epiplón a un plato estéril de trabajo separado para facilitar la inyección. Perforar suavemente el epiplón con la punta de la aguja e inyectar un pequeño volumen de suspensión celular en el tejido (Figura 2C).
- Repita la inyección en varias áreas de epiplón hasta un volumen total de al menos 100 μL o 100.000 células. Tenga en cuenta que gran parte de la suspensión celular puede parecer que se acumula alrededor del espécimen. Si existe preocupación con respecto a la calidad de la inyección, repita la inyección o inyecte un volumen mayor de suspensión celular en la muestra.
- Regrese las muestras de epiplón inyectadas a cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos. Tenga en cuenta que el volumen de los medios de cultivo de epiplón está a un nivel que cubre el epiplón sin permitir que flote. Manipule con cuidado la placa y colóquela dentro de una incubadora (37 °C y 5% de CO2).
- OPCIONAL: Use Matrigel (matriz de membrana basal) para suspender el tejido del epiplón en una matriz sólida para permitir una inyección más fácil y una administración de suspensión celular más concentrada.
- Descongelar la matriz de la membrana basal a 4 °C y mezclar en una proporción de 1:1 con medios de cultivo de epiplón inmediatamente antes de su uso. Almacenar la mezcla de la matriz de membrana basal en hielo o a 4 °C hasta la inyección. Llene los pozos vacíos con suficiente mezcla de matriz de membrana basal para sumergir un trozo cortado de epiplón.
- Coloque las muestras en la mezcla de matriz de membrana basal y luego coloque la placa de cultivo de 24 pocillos en una incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante 20 min. Una vez que la mezcla se haya solidificado, continúe con la inyección como se describió anteriormente.
- Confirme que la inyección se ha realizado correctamente mediante imágenes fluorescentes. Asegúrese de que se visualice una raya de señal fluorescente en los sitios de inyección (Figura 2D). Tenga en cuenta que el número real de células adheridas al epiplón después de la inyección es impredecible.
4. Cocultivo de epiplón humano y células de cáncer de ovario
- Cambie el medio cada 48-72 h añadiendo 500-2000 μL de medio de cultivo de epiplón fresco. No pipetee los medios directamente sobre el tejido del epiplón, ya que esto puede desplazar las células cancerosas. Tenga en cuenta que si el color del medio cambia a amarillo, cambie el medio.
NOTA: La frecuencia del cambio de medio dependerá del volumen de medios utilizados y de la trayectoria de crecimiento de las células cancerosas. Una vez que las células cancerosas han sembrado el epiplón, ya no es importante si el fragmento de epiplón está flotando o no. - OPCIONAL: Si se utilizara una matriz de membrana basal, la matriz normalmente se disolvería en el momento del primer cambio de medio.
- Monitorear el crecimiento de los tumores de cáncer de ovario mediante imágenes fluorescentes. La frecuencia de las imágenes queda a discreción del investigador. Anticipe la evidencia de tumores pequeños a los 14 días (Figura 3A-C). Los resultados pueden variar dependiendo de la calidad de la inyección.
- Finalice el experimento en función del punto de conexión del experimento.
NOTA: Se ha observado crecimiento tumoral e integridad del tejido epiplático después de 50 días.
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Resultados
El establecimiento exitoso de células de cáncer de ovario en especímenes de epiplón fue evidente alrededor del día 14 (Figura 3A-C). Se prepararon e inyectaron al menos 24 réplicas por espécimen recolectado para permitir una mayor experimentación. El crecimiento tumoral se monitorizó mediante la toma de imágenes fluorescentes (Figura 3D,E). Las imágenes tuvieron que ser interpretadas cuidadosamente, ya que una m...
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Discusión
Utilizando este protocolo, se desarrolló un modelo preclínico de carcinomatosis peritoneal para el cáncer de ovario utilizando una combinación de técnicas básicas in vitro y ex vivo. Se observó un crecimiento tumoral progresivo a lo largo de 50 días de cocultivo después de sembrar muestras de epiplón con células de cáncer de ovario humano mCherry+ OCSC1-F2. Este método fue desarrollado y optimizado a través de varios ensayos experimentales utilizando diferentes especímenes de epiplón. El crecimiento exi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio está financiado en parte por la Fundación Janet Burros Memorial. Agradecemos a las pacientes y al Departamento de Oncología Ginecológica del Instituto Oncológico Karmanos por la recolección de muestras de epiplón. También reconocemos al Biobanco y al Núcleo de Ciencias Correlativas del Instituto Oncológico Karmanos por la coordinación del reclutamiento de pacientes y la preparación de las diapositivas de patología. El Biobanco y el Núcleo de Ciencias Correlativas están financiados en parte por la subvención P30 del Centro de los NIH CA22453 al Instituto de Cáncer Karmanos de la Universidad Estatal de Wayne.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.05% Tripsina-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Jeringa de insulina con aguja desmontable de 26 g | BD | 329652 | |
| 10 mL Pipetas serológicas | CELLTREAT | 229010B | |
| Plato de cultivo de tejidos de 100 mm | Fisherbrand | FB012924 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | CELLTREAT | 229411 | |
| Célula de 24 pocillos Placa de cultivo | Costar | 3524 | |
| 50 mL Tubo de centrífuga | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 matraz de cultivo de tejidos | CELLTREAT | 229341 | |
| Contador de células de Corning | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamina, +2.438 g/L de Sodio Bicarbonato | Gibco | 11320033 | |
| Suero Fetal Bovino, | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Matriz de membrana basal |
| Nº 10 Bisturí desechable de acero inoxidable | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicilina Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 ( 1x) | Gibco | 10010023 | |
| Microscopio giratorio | Echo |
Referencias
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