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Artículo de método

Evaluación de la citotoxicidad de los metabolitos de los plaguicidas triazoles típicos en las plantas

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DOI:

10.3791/66048

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22 de diciembre de 2023

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1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University, 3International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology

En este artículo

Resumen

El protocolo describe un nuevo método para evaluar la citotoxicidad integral de los metabolitos de los plaguicidas triazoles en plantas.

Resumen

Varios contaminantes orgánicos han sido liberados al medio ambiente debido a las actividades antropogénicas. Estos contaminantes pueden ser absorbidos por las plantas de cultivo, causando amenazas potenciales para el ecosistema y la salud humana a lo largo de la cadena alimentaria. La biotransformación de los contaminantes en las plantas genera una serie de metabolitos que pueden ser más tóxicos que sus compuestos originales, lo que implica que los metabolitos deben tenerse en cuenta durante la evaluación de la toxicidad. Sin embargo, los metabolitos de los contaminantes en las plantas son extremadamente complejos, lo que dificulta la obtención exhaustiva de la información toxicológica de todos los metabolitos. Este estudio propuso una estrategia para evaluar la citotoxicidad integral de los metabolitos contaminantes en las plantas mediante el tratamiento de los mismos como un todo durante los ensayos toxicológicos. Los plaguicidas triazoles, una clase de fungicidas de amplio espectro, se han aplicado ampliamente en la producción agrícola. Su contaminación por residuos en las tierras agrícolas ha atraído cada vez más atención. Por lo tanto, se seleccionaron cuatro plaguicidas triazoles, incluidos flusilazol, diniconazol, tebuconazol y propiconazol, como los contaminantes analizados. Los metabolitos fueron generados por el tratamiento del callo de zanahoria con plaguicidas triazoles probados. Después de un tratamiento de 72 h, se extrajeron los metabolitos de los plaguicidas en el callo de zanahoria, seguido de pruebas toxicológicas utilizando la línea celular Caco-2. Los resultados mostraron que los metabolitos de los plaguicidas ensayados en el callo de zanahoria no inhibieron significativamente la viabilidad de las células de Caco-2 (P>0,05), demostrando que no hay citotoxicidad de los metabolitos de los plaguicidas. Este método propuesto abre una nueva vía para evaluar la citotoxicidad de los metabolitos contaminantes en las plantas, lo que se espera que proporcione datos valiosos para una evaluación precisa de la toxicidad.

Introducción

Las plantas de cultivo que crecen en tierras agrícolas pueden estar expuestas a diversos contaminantes orgánicos originados por actividades antropogénicas 1,2. Los contaminantes pueden ser absorbidos por las plantas, causando aún más amenazas para el ecosistema y la salud humana a través de las cadenas alimentarias 3,4. Es probable que los xenobióticos de las plantas sufran una serie de biotransformaciones, como los metabolismos de fase I y II5, que generan una serie de metabolitos. De acuerdo con el concepto de hígado verde en las plantas, el metabolismo de las plantas puede reducir la toxicidad de los xenobióticos 6,7. Sin embargo, se ha revelado que la toxicidad de algunos metabolitos podría ser mayor que la de sus padres. Por ejemplo, se ha demostrado que el producto desbromado del tetrabromobisfenol A (TBBPA) y el producto O-metilado del bisfenol A (BPA) son mucho más tóxicos que sus progenitores 8,9, y la desbromación y la O-metilación comprenden las principales vías de metabolismo de la Fase I en las plantas. Por lo tanto, la evaluación de la toxicidad basada únicamente en los progenitores de contaminantes en las plantas no es precisa, mientras que deben tenerse en cuenta los metabolitos correspondientes.

Los metabolitos de los xenobióticos en las plantas son extremadamente complejos10,11, lo que dificulta su identificación y separación exhaustiva. Además, solo se pueden obtener unos pocos estándares de metabolitos identificados. Por lo tanto, no se dispone de datos toxicológicos de todos los metabolitos, lo que dificulta una evaluación exhaustiva de la toxicidad. Este estudio propuso una estrategia para evaluar la toxicidad integral de los metabolitos contaminantes en las plantas tratándolos como un todo durante las pruebas toxicológicas, proporcionando nuevos datos para la evaluación precisa de la toxicidad de los contaminantes en las plantas. Nuestro estudio previo ha revelado que el cultivo de callos vegetales abre una vía sencilla y eficaz para obtener metabolitos de xenobióticos en plantas12. En consecuencia, en este estudio se empleó el cultivo de callos vegetales para generar los metabolitos de los contaminantes en las plantas, seguido de la extracción química y las pruebas toxicológicas utilizando una línea celular humana. El tracto intestinal es uno de los órganos diana directos de los xenobióticos expuestos a animales y seres humanos. La línea celular Caco-2 ha demostrado ser el mejor modelo para investigar el comportamiento intestinal y la toxicidad de los xenobióticos in vitro 13,14,15. Por lo tanto, se seleccionó el modelo de células Caco-2 en este estudio.

Los plaguicidas triazoles, una clase de fungicidas de amplio espectro, se han aplicado ampliamente en la producción agrícola16. La contaminación por residuos en las tierras agrícolas ha atraído cada vez más la atención17,18. Aquí, se seleccionaron cuatro pesticidas triazoles de uso común, incluidos flusilazol, diniconazol, tebuconazol y propiconazol, como los contaminantes típicos. La zanahoria fue seleccionada en este estudio como la planta representativa de las hortalizas frescas y listas para el consumo. El callo de zanahoria se expuso inicialmente a los plaguicidas analizados a una concentración de 100 mg/L. Después de una exposición de 72 h, los metabolitos se extrajeron para evaluar la citotoxicidad utilizando la línea celular Caco-2. Este método puede extenderse fácilmente para evaluar la citotoxicidad integral de los metabolitos de otros tipos de contaminantes en las plantas.

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Protocolo

1. Diferenciación del callo de zanahoria

NOTA: El protocolo detallado para la diferenciación del callo de zanahoria ha sido descrito en un estudio previo12. He aquí una breve descripción.

  1. Esterilizar la superficie de las semillas vernalizadas con etanol al 75% durante 20 min seguido de 20% H2O2 durante 20 min. Lavar con agua destilada al menos 3 veces.
  2. Siembre las semillas en un medio de Murashige y Skoog (MS) gelificado en agar (1% p/v) sin hormonas (pH = 5,8, esterilizado en autoclave a 121 °C) e incube bajo un fotoperiodo de 16 h (350 μmol/m2s) a 26 °C durante 15 días para formar las plántulas.
  3. Coseche los explantes cortando el hipocótilo y el cotiledón de las plántulas en trozos pequeños (0,5 cm) e incube los explantes en medio MS que contenga auximona de 1 mg/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético y fitoquinina de 0,5 mg/L, 6-bencilaminopurina a 26 °C en la oscuridad durante 3-4 semanas para inducir el callo.
  4. Recoja el callo (de alrededor de 1 cm de diámetro, compacto) con bisturíes y pinzas.

2. Tratamiento del callo de zanahoria con pesticidas

  1. Disolver 10 mg de flusilazol, diniconazol, tebuconazol y propiconazol en 100 ml de medio MS estéril con concentraciones finales de 100 mg/L (pH de 5,6-7,0).
    NOTA: La concentración de tratamiento de los plaguicidas analizados se eligió como el máximo del 50% de concentración de inhibición del crecimiento celular (IC50) para la célula Caco-2.
  2. Mezclar 3 g de callo de zanahoria (a partir del paso 1.4) con 10 ml de soluciones plaguicidas preparadas (a partir del paso 2.1) en frascos de vidrio en condiciones estériles.
  3. Mezclar 3 g de callo de zanahoria (a partir del paso 1.4) con 10 mL de medio MS aséptico en matraces de vidrio en condiciones estériles.
    NOTA: Todos los matraces de vidrio fueron esterilizados en autoclave.
  4. Incubar el callo de zanahoria (de los pasos 2.2 y 2.3) a 130 rpm y 26 °C en la oscuridad durante 72 h.
    Establecer todos los tratamientos por triplicado.
  5. Recoja el callo de zanahoria del medio por filtración con filtros de fibra de vidrio (0,45 μm) después de una incubación de 72 h. Lavar el callo con agua ultrapura 3 veces.
  6. Secar los callos con un liofilizador a -55 °C y, a continuación, homogeneizarlos con una trituradora de tejidos de alto rendimiento a 70 Hz durante 3 min.

3. Extracción química del callo de zanahoria

  1. Mezclar 0,2 g de polvo molido del callo liofilizado con 3 mL de acetonitrilo en un tubo de centrífuga (10 mL).
  2. Agite el tubo de la centrífuga durante 8 minutos y, a continuación, sonicéselo durante 5 minutos (150 W, 40 kHz).
  3. Recoja los sobrenadantes pipeteando después de la centrifugación a 8.000 x g a 4 °C durante 10 min.
  4. Repita los procedimientos de extracción 3 veces y agrupe los extractos en un tubo de centrífuga limpio (10 mL).
  5. Concentrar los extractos agrupados hasta que se sequen utilizando un concentrador de soplado de nitrógeno a 40 °C.
  6. Vuelva a disolver los residuos de los extractos (del paso 3.5) con 1 mL del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 0,3% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    NOTA: Los residuos del paso 3.6 se obtuvieron de los extractos de callos tratados con pesticidas (del paso 2.2).
  7. Vuelva a disolver los residuos de los extractos (del paso 3.5) con 1 ml de DMEM con DMSO al 0,3% y disuelva 1 mg de flusilazol, diniconazol, tebuconazol y propiconazol en 4 tubos diferentes, respectivamente.
    NOTA: Los residuos del paso 3.7 se obtuvieron de los extractos de callo en blanco (del paso 2.3).
    NOTA: El DMEM se preparó con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibióticos (penicilina y estreptomicina).

4. Reanimación de la célula Caco-2

NOTA: Todos los reactivos y materiales involucrados en las pruebas de células Caco-2 se esterilizaron en autoclave durante 20 min y se esterilizaron bajo luz ultravioleta durante 2 h.

  1. Retire el tubo de criopreservación (que almacena las células congeladas) del tanque de nitrógeno líquido y transfiéralo rápidamente a un baño de agua a 37 °C. Agítelo continuamente para descongelar la solución congelada.
    NOTA: Evite que el agua fluya sobre la tapa del tubo de criopreservación al agitarlo.
  2. Desinfecte la superficie del tubo de criopreservación con alcohol al 75% después de que la solución congelada se descongele. Transfiera rápidamente la solución celular a un tubo de centrífuga estéril mediante pipeteo.
  3. Retirar los sobrenadantes en el tubo de criopreservación después de la centrifugación a 1.000 x g a 4 °C durante 3 min. Agregue 1 mL de DMEM y suspenda las células golpeando y agitando suavemente.
  4. Transfiera la suspensión celular (del paso 4.3) a un matraz de vidrio mediante pipeteo. Añada 5 ml de DMEM en el matraz de vidrio y agite suavemente el matraz de vidrio para distribuir uniformemente las células.
  5. Incubar las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
    NOTA: Los pasos 4.2-4.4 se realizaron en un banco súper limpio.

5. Paso de la célula Caco-2

  1. Retire el matraz de vidrio de la incubadora y deseche el medio de cultivo cuando la densidad celular alcance más del 80%. Lave las células con PBS 3x.
  2. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA y extenderla uniformemente para asegurar un contacto completo con las células.
  3. Retire la solución digestiva cuando las células se encogan de forma adherente a un pequeño punto redondo y no se hayan suspendido bajo la observación por microscopio (aumento de 100x). Golpee suavemente la pared del matraz para provocar la eliminación de las células.
  4. Agregue 2 mL de DMEM, repita el enjuague de la pared del matraz 10 veces, golpee suavemente la pared del matraz y transfiera 1 mL de suspensión celular a otro matraz de vidrio.
  5. Añada 5 mL de DMEM en matraces de vidrio. Golpee suavemente la pared del matraz para distribuir uniformemente las células.
  6. Incubar las células en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2. Sustituya el medio de cultivo por DMEM fresco cada 24 h hasta que la densidad celular supere el 80%.
  7. Repita los procedimientos de paso de células hasta que haya suficientes células (aproximadamente 2 x 106) recolectadas para las siguientes pruebas de exposición.
    NOTA: Los pasos 5.1-5.5 se realizaron en el banco súper limpio. El número de células se determinó mediante un hemocitómetro19.

6. Exposición de la célula Caco-2

  1. Retire los matraces de vidrio (del paso 5.7) de la incubadora y repita los pasos 5.1-5.4 para recoger las células.
  2. Golpee suavemente la pared del matraz para distribuir uniformemente las células y transferir las suspensiones celulares a un tubo de centrífuga (15 mL).
  3. Diluir la suspensión celular (a partir del paso 6.2) con DMEM en combinación con citometría para alcanzar una densidad celular de aproximadamente 1 x 105 células/mL. Golpee suavemente la pared del matraz para distribuir uniformemente las células.
  4. Agregue 100 μL de PBS en los pocillos exteriores de la placa de 96 pocillos para evitar la evaporación del medio de cultivo debido al efecto de borde.
    NOTA: Golpee continuamente la pared del tubo de centrífuga para mantener uniforme la suspensión de la celda.
  5. Agregue 100 μL de suspensión celular (del paso 6.3) en los pocillos izquierdos de la placa de 96 pocillos y deje reposar durante 10 min.
  6. Incubar las células en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 48 h.
  7. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora después de la incubación de 48 h y deseche el medio de cultivo.
  8. Establezca un grupo de metabolitos de plaguicidas añadiendo 100 μL de soluciones (del paso 3.6) en cada pocillo.
    NOTA: En cada pocillo del Paso 6.8, se generaron metabolitos de plaguicidas a partir de 0,1 mg de progenitores.
  9. Establezca un grupo parental de plaguicidas agregando 100 μL de soluciones (del paso 3.7) en cada pocillo para comparar.
    NOTA: En cada pocillo del Paso 6.9, había 0.1 mg de pesticidas padres.
  10. Establezca un control en blanco agregando 100 μL de DMEM con 0.3% de DMSO en cada pocillo. Utilice seis pocillos para cada grupo (paso 6.8-6.9).
  11. Incubar las células en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.
    NOTA: Los pasos 6.1-6.5 y 6.7-6.10 se realizaron en el banco súper limpio.

7. Evaluación de la viabilidad celular

  1. Retire la placa de 96 pocillos (de 6.11) de la incubadora y deseche el medio de cultivo después de una exposición de 24 h. Lave las células con PBS 2x.
  2. Agregue 100 μL de DMEM en cada pocillo y luego agregue 10 μL de reactivos CCK-8. Agite suavemente la placa para distribuir uniformemente las células.
  3. Incubar las células en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h.
  4. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora después de la incubación de 4 h y mida la absorbancia óptica (OD) a 450 nm con un espectrofotómetro de fluorescencia.
  5. Calcule la viabilidad de la célula mediante la siguiente ecuación:
    viabilidad celular (%) = (grupo experimental OD - ODDMEM) / (control OD - ODDMEM)×100%.
    NOTA: Los pasos 7.1-7.2 se realizaron en el banco súper limpio.

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Resultados

La Figura 1 representa el esquema del método propuesto para la generación, extracción y evaluación de la citotoxicidad de metabolitos de plaguicidas en el callo de zanahoria. En la Figura 2, se muestran las curvas cinéticas de absorción y metabolismo de los plaguicidas analizados, a partir de las cuales podemos encontrar que las concentraciones de plaguicidas en los medios de cultivo disminuyeron exponencialmente, mientras que las del callo de zanahoria comenzar...

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Discusión

Este protocolo se desarrolló para evaluar la citotoxicidad integral de los metabolitos de los plaguicidas triazoles en plantas mediante la combinación de modelos de callos vegetales y células humanas. Los pasos críticos para este protocolo propuesto son el cultivo de callos vegetales y células Caco-2. La parte más difícil y los consejos relativos para el cultivo de callos de plantas se han proporcionado en nuestro estudio anterior12. Aquí, hay que tener en cuenta ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976160) y el Proyecto de Investigación de Aplicación de Tecnología de Bienestar Público (LGF21B070006) de la provincia de Zhejiang.

     

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido 2,4-diclorofenoxiacéticoWAKO1 mg/L
20% H2O<>2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10011218-500ML
6-bencilaminopurinaWAKO0,5 mg/L
75% etanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1269101-500 mL
Placa de 96 pocillosThermo Fisher
AcetonitrileSigma-Aldrich
Incubadora de clima artificialNingbo DongNan Lab Equipment Co., LtdRDN-1000A-4
AutoclavesSTIKMJ-Series
Caco-2 célulasNuoyang Biotechnology Co., Ltd.
Reactivos CCK8Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng, ChinaG021-1-3
CentrífugaThermo Fisher
Incubadora 2LabtripHWJ-3-160
Sulfóxido de dimetiloSolarbio Ciencias de la vidaD8371
Diniconazol, 98.7%J& K Scientific83657-24-3
Medio de Eagle modificado de DulbeccoBalanza electrónica Solarbio Life Sciences11965-500 mL
Shanghai Precision Instrument Co., LtdFA1004B
Suero fetal bovinoCellmax
Espectrofotómetro de fluorescenciaTecanInfinite M200
Flusilazol, 98.5%J& K Científico85509-19-9   
LiofilizadorSCIENTZ
Trituradora de tejidos de alto rendimientoSCIENTZ
Microscopio invertidoLeica BiosystemsDMi1
Sistema Milli-QMilliporeMS1922801-4L
Murashige & Medio SkoogHOPEBIOHB8469-7
Concentrador de soplado de nitrógenoAOSHENGMD200-2
PBSSolarbio Life SciencesP1022-500 mL
Penicilina-estreptomicina líquidaSolarbio Life SciencesP1400-100 mL
Propiconazol, 100%J& K Científico60207-90-1 
Investigación másEppendorf10-1000 μ L
Semillas de zanahoria Little Finger (Daucus carota var. sativus)Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Incubadoras de agitaciónShanghai bluepard instruments Co., Ltd.THZ-98AB
Tebuconazol, 100%J& K Scientific107534-96-3
Solución de tripsina-EDTASolarbio Life SciencesT1300-100 mL
EcógrafoZKIUC-6
Banco súper limpio esterilizado por UVAIRTECH
Instrumento de vórticeWuxi Laipu Instrument Equipment Co., LtdBV-1010

Referencias

  1. Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400(2020).
  2. Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
  3. Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
  4. Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
  5. Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742(2021).
  6. Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the 'green liver' concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
  7. Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034(2021).
  8. Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
  9. McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
  10. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  11. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
  12. Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089(2023).
  13. Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
  14. Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
  15. Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
  16. Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
  17. Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
  18. Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209(2023).
  19. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).

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