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Detección de polimorfismo de nucleótido único multigénico en cáncer gástrico basada en una plataforma de secuenciación de semiconductores iónicos

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DOI:

10.3791/66058

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10 de mayo de 2024

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1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department, Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, Southern Medical University

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Resumen

Este protocolo propone procedimientos holísticos de laboratorio necesarios para detectar polimorfismos de un solo nucleótido en muestras de cáncer gástrico basados en una plataforma de secuenciación de semiconductores iónicos. También se describen en detalle las secuencias objetivo, los adaptadores de ligadura, la amplificación y purificación de bibliotecas y los criterios de control de calidad.

Resumen

El cáncer gástrico es un tumor heterogéneo común. La mayoría de los pacientes tienen cáncer gástrico avanzado en el momento del diagnóstico y, a menudo, necesitan quimioterapia. Aunque el 5-fluorouracilo (5-FU) se usa ampliamente para el tratamiento, aún es necesario determinar su sensibilidad terapéutica y tolerancia al medicamento, lo que enfatiza la importancia de la administración individualizada. La farmacogenética puede guiar la implementación clínica del tratamiento individualizado. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), como marcador genético, contribuyen a la selección de regímenes y dosis de quimioterapia adecuados. Algunos SNP están asociados con el metabolismo del folato, el objetivo terapéutico del 5-FU. La metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) rs1801131 y rs1801133, la dihidrofolato reductasa (DHFR) rs1650697 y rs442767, la metionina sintasa (MTR) rs1805087, la gamma-glutamil hidrolasa (GGH) rs11545078 y la familia portadora de solutos 19 miembro 1 (SLC19A1) rs1051298 se han investigado en diferentes tipos de cánceres y fármacos antitumorales antifolatos, que tienen una importancia potencial de predicción y orientación para aplicación de 5-FU. La tecnología de secuenciación de semiconductores de próxima generación de torrente iónico puede detectar rápidamente SNP relacionados con el cáncer gástrico. Cada vez que una base se extiende en una cadena de ADN, se liberará un H+ , causando cambios locales en el pH. El sensor iónico detecta los cambios de pH y convierte las señales químicas en señales digitales, logrando la secuenciación por síntesis. Esta técnica tiene un bajo requerimiento de muestras, operación simple, bajo costo y velocidad de secuenciación rápida, lo que es beneficioso para guiar la quimioterapia individualizada por SNP.

Introducción

El cáncer gástrico es una pesada carga en el ámbito de la salud pública mundial. Según las Estadísticas Mundiales del Cáncer 2020, publicadas por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), el cáncer gástrico es el quinto cáncer más diagnosticado y la cuarta causa de muerte relacionada con el cáncer. A nivel mundial, la tasa de incidencia estandarizada por edad en Asia Oriental es la más alta tanto en hombres como en mujeres1. La aparición del cáncer gástrico es insidiosa, lo que significa que los pacientes a menudo no tienen ningún síntoma obvio y específico en la etapa inicial. Entre todos los pacientes con cáncer gástrico, en los países sin cribado rutinario, entre el 80% y el 90% de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada, cuando el tumor no puede ser operado, o recaen dentro de los 5 años posteriores a la operación2.

Para el cáncer gástrico avanzado o metastásico, la quimioterapia es el tratamiento principal, que puede mejorar la tasa de supervivencia y la calidad de vida de los pacientes. Para el tratamiento inicial de los pacientes con cáncer gástrico metastásico, el régimen de fluoropirimidina con platino es la opción principal para el tratamiento quimioterapéutico de primera línea3. La fluoropirimidina incluye principalmente 5-fluorouracilo (5-FU) y derivados orales de la fluoropirimidina, como capecitabina y tegafur. El objetivo principal de 5-FU son las enzimas relacionadas con el metabolismo del folato, que inhiben la síntesis de ADN y ralentizan el crecimiento del tejido tumoral. Las reacciones adversas a los medicamentos limitan su utilidad, con diarrea, mucositis, mielosupresión y síndrome mano-pie entre los efectos secundarios más frecuentes. Se ha reportado que la respuesta terapéutica y las reacciones adversas a los medicamentos están estrechamente relacionadas con factores en la vía metabólica del folato. En particular, la mutación homocigota rs1801131 ha sido identificada como un indicador del síndrome mano-pie (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, IC 95%: 3,84-27,8)4. Aunque las fluoropirimidinas se usan ampliamente en la quimioterapia contra el cáncer, su quimiorresistencia es una emergencia común que causa fracaso terapéutico en el tratamiento del cáncer gástrico. Por ejemplo, la tasa de respuesta general es de solo 10%-15% entre los pacientes con cáncer colorrectal avanzado tratados con 5-FU solo5. Además, las fluoropirimidinas tienen una toxicidad que no se puede ignorar. Las reacciones de toxicidad inducidas por el 5-FU incluyen principalmente diarrea, síndrome mano-pie, estomatitis, neutropenia, trombocitopenia, neurotoxicidad e incluso la muerte6. La toxicidad grave relacionada con el tratamiento ocurre en el 10%-30% de los pacientes tratados con fluoropirimidinas, y la toxicidad fatal ocurre en el 0,5%-1% de estos pacientes7.

En un estudio de calidad de vida de pacientes con cáncer gástrico avanzado, se encontró que la tasa de respuesta fue de menos del 50 % para aquellos que recibieron quimioterapia con 5-FU8. Por lo tanto, comprender los factores relacionados con la sensibilidad de la quimioterapia basada en 5-FU es particularmente importante para un tratamiento preciso que maximice la tasa de respuesta y la eficacia y minimice la toxicidad. Teniendo en cuenta que el 5-FU está estrechamente relacionado con el metabolismo del folato, las variantes genéticas de las enzimas en la vía metabólica del folato pueden ser uno de los factores. Alrededor del 90% de la variación de la secuencia humana se atribuye a mutaciones de una sola base en el ADN, conocidas como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)9. Cuando los SNP cambian las propiedades enzimáticas del metabolismo del folato, pueden dar lugar a diferencias individuales en la eficacia, la toxicidad y la quimiorresistencia al fluorouracilo en pacientes con cáncer gástrico.

La metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) se utiliza principalmente para convertir el 5,10-metilenotetrahidrofolato (5,10-MTHF) en 5-metiltetrahidrofolato. El 5-FdUMP, un metabolito del 5-FU, forma un ternario inactivo con el 5,10-MTHF y la timidilato sintasa (TS), inhibiendo la actividad del TS y conduciendo a la deficiencia de dTMP10. La acumulación de 5,10-MTHF puede mejorar el efecto de inhibición de 5-FU sobre el TS, que se correlaciona con la actividad de MTHFR. MTHFR rs1801131 y rs1801133 son los polimorfismos más comunes, que se relacionan con una menor actividad enzimática (una disminución del 75% para rs1801133 y del 30% para rs181131) y una acumulación de 5,10-MTHF11.

La dihidrofolato reductasa (DHFR) es la enzima clave en el metabolismo del folato y la síntesis de ADN. El DHFR reduce el dihidrofolato, utilizando NADPH, a tetrahidrofolato (THF), que se utiliza para transportar una unidad de un carbono. Los SNP de DHFR pueden afectar su expresión, cambiar la actividad y la abundancia de THF y afectar aún más el metabolismo del folato y la sensibilidad del 5-FU. La mutación puntual DHFR rs1650697 ocurre en el principal promotor del gen DHFR , lo que aumenta la expresión de DHFR12. Un estudio encontró que rs442767 se asocia con la eficacia y toxicidad de los fármacos antifolatos antitumorales, como el pemetrexed y el metotrexato. Con respecto al SNP rs442767, un genotipo GT significa la herencia de un alelo G y un alelo T en el mismo locus en los cromosomas homólogos de cada padre. Del mismo modo, los genotipos GG y TT denotan la herencia de dos alelos G o dos alelos T, respectivamente. En comparación con el genotipo GT+TT, la GG se relaciona con una disminución de la supervivencia libre de eventos y un mayor riesgo13. Esto sugiere que rs442767 puede conducir a cierta influencia potencial en 5-FU.

La metionina sintasa (MTR) cataliza la remetilación de la homocisteína a metionina, que desempeña un papel importante en el metabolismo del folato. MTR rs1805087 es el polimorfismo más común del gen MTR . MTR rs1805087 sustituye la glicina por el ácido aspártico en el sitio potencialmente funcional de la proteína, lo que puede disminuir la actividad de MTR. Los sujetos con el alelo G tenían un aumento del nivel plasmático de folato y una disminución del nivel plasmático de homocisteína14. Por el contrario, un estudio demostró que rs1805087 no tiene una asociación estadísticamente significativa con la eficacia de 5-FU. Pero este estudio se centró en el cáncer colorrectal y el tamaño de la muestra fue pequeño. La relación entre rs1805087 y la eficacia de 5-FU en pacientes con cáncer gástrico aún por explorar15.

La gamma-glutamil hidrolasa (GGH) es una enzima lisosomal que regula las concentraciones intracelulares de folato. El ácido pteroilglutámico es sinónimo de ácido fólico que está formado por pterina, ácido p-aminometilbenzoico y ácido glutámico. Hay dos formas de ácido fólico en los organismos, el folato monoglutamato y el folato poliglutamatado. El THF-poliglutamato es convertido enzimáticamente en folato monoglutámico por GGH, liberando sucesivamente mono-glutamato (mono-Glutamato) o di-glutamato (di-Glu)16. Un estudio sobre la expresión de GGH en pacientes con cáncer gástrico localmente avanzado, mostró que una alta expresión de GGH podría reducir 5,10-MTHF y TS, lo que significa que solo se necesita una pequeña dosis de 5-FU para lograr el efecto inhibidor de TS en estos pacientes17. GG es un biomarcador pronóstico en pacientes con cáncer gástrico localmente avanzado tratados con quimioterapia adyuvante postoperatoria con S-1, un profármaco del 5-FU, y desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis intracelular del ácido fólico18. GGH rs11545078 es una variante sin sentido y altera Thr-127 a Ile-127. Un estudio centrado en la especificidad del sustrato de GGH sugiere que rs11545078, en comparación con el tipo salvaje, da como resultado una mayor Km y una menor eficiencia catalítica para el metotrexato y la estructura es similar al ácido fólico19. En conjunto, explorar la relación entre rs11545078 y los resultados clínicos de 5-FU es una estrategia prometedora para comprender la resistencia a los fármacos.

La familia portadora de solutos 19 miembro 1 (SLC19A1), también llamada transportador de folato reducido, es una proteína transmembrana facilitadora típica que importa folatos reducidos que las células de mamíferos carecen de la capacidad de sintetizar de novo, lo que se reconoce para estimar la respuesta del tumor al 5-FU20. Sin embargo, solo se han realizado pocos estudios sobre la asociación entre el 5-FU y el polimorfismo SLC19A1 21. En pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas que reciben pemetrexed, que es un análogo del folato, el rs1051298 en el gen SLC19A1 contribuyó a aumentar el riesgo de todas las reacciones adversas a los medicamentos y a disminuir la supervivencia global22,23. SLC19A1 rs1051298, una variante de la región 3' no traducida sobre el metabolismo del folato, puede ayudar a explicar algunas de las diferencias individuales sobre la terapia con 5-FU. El objetivo es evaluar la asociación entre rs1051298 y la resistencia a 5-FU en pacientes con cáncer gástrico.

Para la detección cualitativa in vitro de genes (Figura 1) se utiliza un kit basado en secuenciación de semiconductores, que permite detectar 7 SNPs seleccionados en 5 genes, las mutaciones rs1801131 y rs1801133 del gen MTHFR , las mutaciones rs1650697 y rs442767 del gen DHFR , la mutación rs1805087 del gen MTR , la mutación rs11545078 del gen GGH y la rs1051298 del SLC19A1 gen en muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer gástrico. En primer lugar, se extrajo el ácido nucleico de la muestra y se amplificó específicamente el fragmento objetivo mediante PCR. Se añadió un adaptador de secuenciación universal en ambos extremos del fragmento de ADN para construir una biblioteca que se puede utilizar para la secuenciación. A continuación, se realizó la amplificación de la biblioteca de secuenciación por PCR para formar una plantilla de secuenciación. La plantilla positiva se enriqueció para cumplir con los requisitos de secuenciación. Usando el sistema de secuenciación de semiconductores, fijando la hebra de ADN en el pequeño orificio del chip semiconductor. La ADN polimerasa toma el ADN monocatenario como molde y sintetiza la cadena de ADN complementaria de acuerdo con el principio de emparejamiento de bases complementarias. Cada vez que una base se extiende en una cadena de ADN, se libera un protón, lo que provoca cambios locales en el pH. Un sensor iónico detecta los cambios de pH y convierte las señales químicas en señales digitales, de modo que las bases se pueden interpretar en tiempo real y, finalmente, se puede obtener la secuencia de bases de cada segmento de ADN. Se utilizó el análisis bioinformático para hacer coincidir estas secuencias con el mapa de referencia del genoma humano. Cuando los genes relacionados con el cáncer gástrico mutan, sus secuencias de bases de ADN correspondientes cambian, para obtener la información de mutación de los genes relacionados.

El resultado puede mostrar el estado de la mutación genética y proporcionar una referencia para que los médicos seleccionen los tipos y dosis adecuados de medicamentos de quimioterapia y predigan la resistencia a los medicamentos para los pacientes con cáncer gástrico. Sin embargo, los resultados de las pruebas son solo para referencia clínica y no se recomiendan como la única base para el tratamiento individualizado de los pacientes. Los médicos deben hacer un juicio exhaustivo basado en la condición del paciente, las indicaciones de los medicamentos, las reacciones al tratamiento y otros indicadores de pruebas de laboratorio.

Protocolo

Todos los protocolos y las muestras de tejido de cáncer gástrico (paso 1), obtenidas de endoscopia digestiva alta o cirugía, utilizados en este estudio fueron revisados y aprobados por el comité de ética médica el 24 de julio de 2023 (NFEC-2023-298). Además, este protocolo está diseñado exclusivamente para ilustrar la detección multigénica en el cáncer gástrico sin entrar en comparaciones de cohortes, por lo que no impone criterios específicos para incluir o excluir pacientes. Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

1. Preparación de bloques incrustados de cáncer gástrico

  1. Configurar el sistema de inclusión de tejidos, compuesto por un depósito y un dosificador de parafina, junto con placas calientes y frías, siguiendo las pautas operativas prescritas.
  2. Extraiga el tejido preparado para la incrustación del deshidratador y deposítelo en la ranura de almacenamiento del centro de incrustación.
  3. Seleccione los moldes de inclusión de ajuste según el tamaño del tejido, vierta suficiente cantidad de parafina derretida para cubrir el tejido y luego coloque el molde en la placa tibia.
  4. Recupere el tejido de los casetes y coloque la mucosa gástrica perpendicular a la base del molde de inclusión para asegurarse de que el plano de la sección transversal corte todas las capas de tejido. Alinea el tejido en el molde.
  5. Coloque el casete en la parte superior del molde, seguido de un vertido secundario de parafina, llenando el molde.
  6. Coloque el molde incrustado en la placa fría y, después de la solidificación de la parafina, separe los bloques incrustados de los moldes.

2. Extracción de ácido nucleico de muestras

  1. Utilice kits de extracción y purificación de ácidos nucleicos para extraer ácidos nucleicos de muestras de tejido incluidas en parafina.
  2. Utilice un cuantificador de ácido nucleico para cuantificar el ácido nucleico extraído. Se recomienda que la concentración de ácido nucleico sea superior a 2 ng/μL.
    NOTA: Los materiales utilizados aquí están disponibles en la Tabla de Materiales.

3. Preparación para la biblioteca de secuenciación

  1. Preparación antes del experimento
    1. Encienda la lámpara UV en el banco de trabajo ultralimpio, esterilice durante 30 minutos. Luego, apague la lámpara UV y encienda el ventilador para ventilar durante 10 minutos.
    2. Saque el ácido nucleico del refrigerador de -20 ± 5 °C, verifique y registre la identificación de la muestra, el código de barras del ácido nucleico y el número de etiqueta específica asignado a la muestra. Colóquelo en la rejilla de tubos de la centrífuga para su disolución a temperatura ambiente (RT) después de la verificación, y centrifugue durante 10 s, con un valor fijo de 2.500 x g en espera.
  2. Amplificación por PCR de un fragmento diana
    1. Tome la solución de reacción de captura de fragmentos, el cebador de amplificación del cáncer gástrico y el cebador de amplificación de fusión del kit de detección de articulaciones multigénicas de cáncer gástrico hecho a medida y colóquelos en hielo para que se derritan. Agítalos y mézclalos después de derretirlos, centrigíralos durante 10 s y prepara agua sin nucleasas. La información detallada del cebador se muestra en la Tabla 1.
      NOTA: El kit aún no está disponible comercialmente, póngase en contacto con los authotrs para obtener más detalles.
    2. Prepare un tubo de reacción PCR de 0,2 mL, agregue reactivos en el tubo a su vez de acuerdo con la Tabla Suplementaria 1, vórtice y mezcle durante 5 s, y centrifugue instantáneamente durante 10 s, con un valor fijo de 2.500 x g, de modo que no haya gotas obvias en la pared y la tapa del tubo. Las muestras de ARN se transcribirán a la inversa en ADNc y luego se utilizarán para la construcción posterior de la biblioteca. Los productos de ADNc se añadirán sucesivamente a los tubos de acuerdo con la tabla complementaria 2.
    3. Coloque cada tubo de reacción en el termociclador. Para las muestras de ADN, ejecute el programa de amplificación como se detalla en la Tabla 2. Para los productos de ADNc, ejecute el programa de amplificación como se detalla en la Tabla 3.
  3. Digestión de la secuencia de cebadores
    1. Saque la enzima de digestión del cebador y póngala en hielo para que se derrita. Después de la amplificación, saque los tubos de reacción anteriores, agregue 2 μL de enzima de digestión cebadora a cada tubo y asegúrese de que el volumen total sea de 22 μL.
    2. Agitar y mezclar la solución de reacción en el tubo de PCR y centrifugar instantáneamente durante 10 s, con un límite fijo de 2.500 x g.
    3. Coloque cada tubo de reacción en el termociclador y ejecute el programa como se detalla en la Tabla 4.
  4. Ligadura de adaptador
    1. Coloque el adaptador que conecta los reactivos en hielo para que se disuelvan. Prepare el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y luego mezcle cada componente de acuerdo con la Tabla 5 y márquelo como mezcla adaptadora X.
      NOTA: Los reactivos de conexión del adaptador incluyen adaptadores P1 y adaptadores específicos X, numerados del 1 al 48. Estos están diseñados para etiquetar de forma única varias muestras. Al agregar un adaptador específico, solo abra un tubo a la vez para evitar la contaminación cruzada del adaptador específico. La mezcla de adaptador específica diluida se puede almacenar a -20 ± 5 °C en modo de espera. En los flujos de trabajo de secuenciación, las muestras no se procesan individualmente, sino que varias muestras, cada una etiquetada con un adaptador específico, se combinan en una biblioteca unificada para la secuenciación. Este método permite la diferenciación posterior de muestras en función de sus secuencias de adaptador específicas.
    2. Extraiga el producto de imprimación digerido (22 μL) del termociclador. Agregue los reactivos en el tubo a su vez de acuerdo con la Tabla 6, vórtice y mezcle durante 5 s. Centrifugar a baja velocidad durante 10 s, con un diámetro fijo de 2.500 x g, para que no quede una caída evidente en la pared y la tapa del tubo.
    3. Coloque el tubo de reacción en el termociclador. Para las muestras de ADN, ejecute el programa de amplificación como se detalla en la Tabla 7. En el caso de los productos de ADNc, ejecute el programa de amplificación como se detalla en la Tabla 8.
  5. Purificación del producto de ligadura y amplificación
    1. Saque las perlas magnéticas de purificación de ADN del refrigerador a 2-8 °C con anticipación, vérticelas uniformemente y centrigírelas instantáneamente durante 10 s, con un tamaño fijo de 2.500 x g. Equilibre las perlas magnéticas en RT durante 30 min.
    2. Prepare un tubo de microcentrífuga de baja adsorción de 1,5 mL y transfiera el producto de la reacción de ligadura al tubo correspondiente.
    3. Añadir 45 μL de perlas magnéticas purificadas con ADN en cada tubo, vórtice y mezclar bien, centrifugar instantáneamente durante 10 s e incubar a RT durante 5 min.
    4. Coloque el tubo en una rejilla magnética durante 3 minutos. Deseche el sobrenadante y evite pipetear las perlas.
    5. Transfiera 300 μL de etanol al 75% recién preparado al tubo de microcentrífuga y gire suavemente los tubos 4 veces a 180°. Una vez que la solución esté clara, deseche rápidamente el sobrenadante. Evita pipetear las cuentas. Repita el procedimiento de lavado 1 vez más.
    6. Retire los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de la gradilla magnética y centrifuga brevemente (10 s, con un tamaño fijo de 2.500 x g). Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y pipetee el líquido restante. Asegúrese de que no haya líquido residual en la pared del tubo.
    7. Abra la tapa de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y seque las perlas a RT durante 5 minutos. Preste atención a la condición seca-húmeda de las cuentas. Después de que las perlas magnéticas se sequen, verifique que no haya manchas de agua en la superficie. Prolongue el tiempo de secado adecuadamente si las perlas magnéticas están demasiado húmedas. Cierre la tapa inmediatamente si surgen grietas en las cuentas y continúe con el siguiente paso para amplificar y purificar la biblioteca.
  6. Ampliación y purificación de la biblioteca
    1. Coloque los reactivos relacionados con la PCR en hielo para su disolución con anticipación, vérticelos y centrifuérrelos durante 10 s. Retire el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de la rejilla magnética, pipetee los regentes de PCR en el tubo de acuerdo con la Tabla 9 y cierre la tapa y el vórtice durante 5 segundos. Centrifugar brevemente (10 s) para que no caiga líquido de forma evidente en la pared y la tapa del tubo.
    2. Transfiera el producto anterior a un nuevo tubo de PCR. Incubar la muestra en un termociclador. Para las muestras de ADN, ejecute el programa de amplificación como se detalla en la Tabla 10. Para los productos de ADNc, ejecute el programa de amplificación como se detalla en la Tabla 11.
    3. Prepare un nuevo tubo de microcentrífuga de baja adsorción de 1,5 mL. Centrifugar el tubo de PCR durante 10 s después de la incubación. Transfiera el producto del tubo de PCR al tubo EP.
    4. Agregue 25 μL de perlas magnéticas purificadas de ADN en cada tubo. Vórtice y mezcle bien, centrifugue a baja velocidad e incube a RT durante 5 min.
    5. Coloque los tubos en una rejilla magnética durante 3 minutos y espere hasta que la solución se aclare. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga. Evita pipetear las cuentas.
    6. Agregue 60 μL de perlas magnéticas purificadas con ADN en cada tubo. Vórtice y mezcle bien, centrifugue a baja velocidad e incube a RT durante 5 min.
    7. Coloque los tubos en una rejilla magnética durante 3 minutos y espere hasta que la solución se aclare. Deseche el sobrenadante. Evita pipetear las cuentas.
    8. Transfiera 300 μL del etanol al 75% recién preparado a los tubos y gírelos suavemente 4 veces a 180°. Una vez que la solución esté clara, pipetee rápidamente y deseche el sobrenadante. Evita pipetear las cuentas. Repita el procedimiento de lavado 1 vez.
    9. Retire los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de la rejilla magnética y centrifugue brevemente (10 s). Vuelva a insertar los tubos en la gradilla magnética y pipetee el líquido restante. Asegúrese de que no haya líquido residual en la pared del tubo.
    10. Abra las tapas de los tubos de 1,5 ml y seque las perlas a RT durante 5 minutos. Preste atención a la condición seca-húmeda de las cuentas. Después de que se secan las perlas magnéticas, no hay manchas de agua en la superficie. Prolongue el tiempo de secado adecuadamente si las perlas magnéticas están demasiado húmedas. Cierre la tapa inmediatamente si surgen grietas en las cuentas.
    11. Pipetear 50 μL de eluyente en los tubos, vórtice y mezclar bien. Centrifugar brevemente (5 s, con un diámetro fijo de 2.500 x g) y colocar los tubos a RT durante 5 min.
    12. Coloque los tubos en una rejilla magnética durante 3 minutos y espere hasta que la solución se aclare. Retire con cuidado el líquido en un tubo nuevo y marque el nombre de la biblioteca.
    13. Guarde la biblioteca en un refrigerador a 2-8 °C temporalmente y espere la determinación cuantitativa o almacene la biblioteca en un refrigerador a -20 ± 5 °C para almacenamiento a largo plazo.

4. Cuantificación de la biblioteca construida

  1. Utilice el cuantificador de ácido nucleico para cuantificar la biblioteca. Si la concentración de la biblioteca es ≥ 0,2 ng/μL, está calificada. De lo contrario, vuelva a compilar la biblioteca.
  2. Mezcle el mismo volumen de ADN (o ARN) y cuantifique la solución. De acuerdo con el resultado cuantitativo, diluya la solución mezclada a 100 pmol/L utilizando la siguiente fórmula.
    figure-protocol-1
    NOTA: Una alternativa es diluir la biblioteca a 100 pmol/L de acuerdo con la fórmula, y luego cuantificar mediante PCR cuantitativa fluorescente. Mezcle las bibliotecas de ADN (o ARN) de manera equitativa de acuerdo con los resultados cuantitativos del instrumento de PCR.
  3. Mezcle 100 pmol/L de biblioteca de ADN y biblioteca de ARN en una proporción de 4:1. Utilice la solución mixta de la biblioteca de ADN y ARN para la secuenciación por computadora.

5. Secuenciación

  1. Realice la secuenciación consultando el manual del kit universal de reacción de secuenciación24,25 (método de secuenciación de semiconductores).

6. Control de calidad de las muestras

  1. Control de calidad positivo del ADN del cáncer gástrico: Tome el control positivo del ADN del cáncer gástrico y realice la prueba de acuerdo con las instrucciones del kit. El control se proporciona con el kit. El resultado muestra que se detectan mutantes de los genes MTHFR, DHFR, MTR, GGH y SLC19A1 .
  2. Control de calidad negativo del ADN del cáncer gástrico: Tome el control negativo del ADN del cáncer gástrico y realice la prueba de acuerdo con las instrucciones del kit. El control se proporciona con el kit. El resultado muestra que se detectan los tipos salvajes de los genes MTHFR, DHFR, MTR, GGH y SLC19A1 .
    NOTA: Asegúrese de que se cumplan los criterios en ambos casos, de lo contrario, es necesario volver a detectarlo.

7. Análisis de datos

  1. Ejecute el complemento correspondiente (el software Variant Caller, Coverage Analysis y Ion Reporter) en el software Torrent Suite para obtener los resultados del análisis de las muestras. Juzgue los resultados de la detección de muestras de acuerdo con los resultados del análisis del complemento.

Resultados

La determinación de los resultados de la prueba se basa en el valor de juicio positivo, que también se reconoce como el intervalo de referencia. Utilice el método de secuenciación de semiconductores para detectar las muestras clínicas recolectadas. Cuando el valor de la frecuencia de mutación de los genes MTHFR, DHFR, MTR, GGH y SLC19A1 es ≥ 5%, el resultado de la detección es el mutante del gen correspondiente. Cuando el valor de la frecuencia de mutación es < 5 %, el resultado de la detección es el tipo salvaje del gen correspondiente26.

Los siguientes criterios se pueden utilizar para determinar si los resultados de la detección son creíbles. En primer lugar, si la cobertura media de los resultados de la secuenciación del ADN es de ≥ 500, y las lecturas mapeadas de los resultados de la secuenciación del ARN son ≥ 20000, los resultados de la prueba son creíbles27. De lo contrario, se recomienda volver a realizar la prueba. En segundo lugar, la cobertura promedio del control de calidad positivo para el ADN del cáncer gástrico es de ≥ 500, y el resultado de la prueba debe cumplir con las mutaciones rs1801131 y rs1801133 del gen MTHFR , las mutaciones rs1650697 y rs442767 del gen DHFR , la mutación rs1805087 del gen MTR , la mutación rs11545078 del gen GGH y la mutación rs1051298 de SLC19A1 gen como positivo. De lo contrario, se recomienda volver a realizar la prueba. En tercer lugar, la cobertura promedio del control de calidad negativo del ADN del cáncer gástrico es de ≥ 500, y los resultados de la detección deben mostrar que todos los sitios dentro del rango de detección de este kit son de tipo salvaje. De lo contrario, se recomienda volver a realizar la prueba. Por último, la concentración de la biblioteca es inferior a 0,2 ng/μL, lo que puede deberse a la degradación del ADN o ARN de la muestra, o a la falta de seguimiento estricto del proceso experimental o al uso de reactivos caducados durante el experimento. Las condiciones anteriores pueden hacer que la calidad de la secuenciación disminuya o falle. Se recomienda reconstruir la biblioteca.

Con este kit se siguen una serie de pasos para construir una biblioteca de secuenciación a partir de muestras clínicas. A continuación, la biblioteca se secuencia en una plataforma de secuenciación de semiconductores iónicos, y se utiliza ANNOVAR para anotar los resultados. Después de la secuenciación, se utiliza un documento para resumir los tipos de mutantes de cada muestra. La ausencia de un tipo mutante indicó que la muestra no sufrió esa mutación específica. La Tabla Suplementaria3 proporciona un ejemplo típico de esto. En la tabla 12 se incluye información básica sobre los SNP detectados aquí. El análisis de cada SNP mediante anotaciones basadas en filtros en varias bases de datos, como el Proyecto 1000 Genomas (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Cuadro 13) y el Consorcio de Agregación del Exoma (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabla 14), puede revelar que diferentes SNPs están significativamente presentes en diferentes poblaciones.

figure-results-1
Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo. Diagrama de flujo de detección multigénica de cáncer gástrico mediante el método de secuenciación de semiconductores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

CromosomaUbicaciónIntervalo de diseño de la imprimaciónImprimación izquierdaImprimación correcta
CHR111854475CHR1:11854175-11854775ACAGGATGGG
GAAGTCACAG		AAACCGGAAT
GGTCACAAAG
11856377CHR1:11856077-11856677CTTCAGGTCA
GCCTCAAAGC		TCCCTGTGGT
CTCTTCATCC
CHR579950780CHR5:79950480-79951080CGCCGCACAT
AGTAGGTTCT		CTTCCTCCTC
CAGCCCTATC
79951495CHR5:79951195-79951795CTTGGGTCAC
CTGCACAGTA		ATTTTGAAGC
ACCCAAGCTG
CHR1237048499CHR1:237048199-237048799GTCAAAGGCC
AGTCCCTTCT		CTCCCTTCAC
CAACTGTGCT
CHR863938763CHR8:63938463-63939063CAGTGAAGTT
CAGCGGCAT		TATTTTCCTGT
GTGGGGCAC
CHR2146934825CHR21:46934525-46935125CCAACCTGAG
ATGGCTTTTC		TCCTTGGTGC
TCTTGCTTTT

Tabla 1: Primers utilizados para los siete SNPs seleccionados en cinco genes. Esta hoja muestra la información sobre la ubicación de los cebadores de los SNPs asociados con la resistencia a 5-FU en el cáncer gástrico.

TemperaturaHoraNo. de ciclos
99 °C2 minutos1 ciclo
99 °C15 s22 ciclos
60 °C4 minutos
10 °CSostener1 ciclo

Tabla 2: Programa de ciclo térmico para la amplificación del ADN. Se muestran las condiciones de reacción térmica, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

PasoTemperaturaHoraNo. de ciclos
Activar enzimas99 °C2 minutos1 ciclo
Desnaturalizar99 °C15 s30 ciclos
Recocido y extendido60 °C4 minutos
Preservar10 °CSostener1 ciclo

Tabla 3: Programa de ciclo térmico para la amplificación de ADNc. Se muestran las condiciones de reacción térmica, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

TemperaturaHoraNo. de ciclos
50 °C10 minutos1 ciclo
55 °C10 minutos1 ciclo
60 °C20 minutos1 ciclo
10 °CSostener1 ciclo

Tabla 4: Programa del ciclo térmico para la digestión de la secuencia de cebadores. Se muestran las condiciones de las reacciones térmicas, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

ComponenteVolumen
Adaptador P11,5 μL
Adaptador específico X1,5 μL
Agua libre de nucleasas3 μL
Volumen total del sistema de reacción6 μL
X: Indica el número de adaptador específico

Tabla 5: Secuencia de adición de reactivos para la preparación de la mezcla adaptadora. Agregue reactivos en el tubo en el orden que se indica aquí.

ComponenteVolumen
Búfer de conexión4 μL
Mezcla de adaptador X2 μL
ADN ligasa2 μL
Volumen total del sistema de reacción30 μL

Tabla 6: Secuencia de adición de reactivos en la producción de cebadores digeridos. Agregue reactivos en el tubo en el orden que se indica aquí.

TemperaturaHoraNo. de ciclos
22 °C30 minutos1 ciclo
72 °C10 minutos1 ciclo
10 °CSostener1 ciclo

Tabla 7: Programa de ciclo térmico para conectar el adaptador al ADN. Se muestran las condiciones de las reacciones térmicas, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

TemperaturaHoraNo. de ciclos
22 °C30 minutos1 ciclo
68 °C5 minutos1 ciclo
72 °C5 minutos1 ciclo
10 °CSostener1 ciclo

Tabla 8: Programa de ciclo térmico para conectar el adaptador al ADNc. Se muestran las condiciones de las reacciones térmicas, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

ComponenteVolumen
Solución de reacción de amplificación de bibliotecas50 μL
Mezcla de imprimación de biblioteca2 μL
Volumen total del sistema de reacción52 μL

Tabla 9: Secuencia de adición de reactivos de amplificación. Agregue reactivos en el tubo en el orden que se indica aquí.

TemperaturaHoraNo. de ciclos
98 °C2 minutos1 ciclo
98 °C15 s5 ciclos
60 °C1 minuto
10 °CSostener1 ciclo

Tabla 10: Programa de ciclo térmico para la amplificación de la biblioteca de ADN. Se muestran las condiciones de las reacciones térmicas, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

TemperaturaHoraNo. de ciclos
98 °C2 minutos1 ciclo
98 °C15 s5 ciclos
64 °C1 minuto
10 °CSostener1 ciclo

Tabla 11: Programa de ciclo térmico para la amplificación de la biblioteca de ADNc. Se muestran las condiciones de las reacciones térmicas, como la temperatura, el tiempo y los ciclos.

RS1801131RS1801133RS1650697RS442767RS1805087RS11545078RS1051298
RefTGUnGUnGG
AltGUnGTGUnUn
Func.ref
GeneWithVer		ExónicoExónicoUTR5río arribaExónicoExónicoUTR3
Gene.ref
GeneWithVer		MTHFRMTHFRDHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
GeneDetail
.refGeneWithVer		..NG_023304.1:
g.5020T>G		...NM_001205206.1:
c.*64C>T;
NM_001205207.1:
c.*746C>T;
NM_194255.2:c.
*746C>T
ExonicFunc
.refGeneWithVer		no sinónimos;
SNV		no sinónimos;
SNV		..no sinónimos;
SNV		no sinónimos;
SNV		.
AAChange.ref
GeneWithVer		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n8:c.A1409C:p.
E470A; MTHFR:
NM_005957.4:
exon8:c.A1286
C:p.E429A		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n5:c.C788T:p.
A263V; MTHFR:N
M_005957.4:e
xon5: c.C665T:
p.A222V		..MTR:NM_0012
91939.1: exón2
5: c.A2603G: p.
D868G; MTR:N
M_001291940.
1: exón25: c.A1
535G: p.D512G;
MTR:NM_0002
54.2:exón26:c.
A2756G:p.D91
9G		GGH:NM_003878
.2: exon5: c.C452T:
p.T151I		Jin
cytoBand1p36.221p36.225T14.15T14.11T438T12.321q22.3

Tabla 12: Información relevante de los SNPs. Anotación de las muestras mediante ANNOVAR.

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
RS1801131RS1801133RS1650697RS442767RS1805087RS11545078RS1051298
1000g2015aug_all0.2494010.2454070.768570.2901360.2182510.0854630.524361
1000g2015aug_afr0.15130.090.93490.03180.28440.0560.5772
1000g2015aug_amr0.15130.47410.7550.39910.17720.04030.4323
1000g2015aug_eas0.21920.29560.66070.58530.10520.08730.5635
1000g2015aug_eur0.31310.36480.75550.31910.1730.09240.4493
1000g2015aug_sas0.41720.11860.67790.2280.32110.14830.5552

Tabla 13: Anotación basada en filtros de SNPs en el Proyecto 1000 Genomas.

MTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1
RS1801131RS1801133RS1650697RS442767RS1805087RS11545078RS1051298
ExAC_ALL0.2950.3037..0.20910.0936.
ExAC_AFR0.15880.1124..0.26660.0545.
ExAC_AMR0.15550.5141..0.18640.0361.
ExAC_EAS0.21480.3052..0.11320.0824.
ExAC_FIN0.31280.2227..0.18920.0581.
ExAC_NFE0.31910.345..0.19190.0969.
ExAC_OTH0.3040.3062..0.21080.0973.
ExAC_SAS0.41530.1409..0.3160.165.

Tabla 14: Anotación basada en filtros de SNPs en el Consorcio de Agregación de Exomas.

Tabla complementaria 1: Secuencia de adición de reactivos para la amplificación del ADN. Agregue reactivos en el tubo en el orden que se indica aquí. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Secuencia de adición de reactivos para la amplificación de ADNc. Agregue reactivos en el tubo en el orden que se indica aquí. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Ejemplo de resultados de secuenciación de muestras clínicas. Solo se registrarán en los documentos las mutaciones presentes en los especímenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los expertos clínicos coinciden unánimemente en que los pacientes, incluso con el mismo tipo y estadio de cáncer gástrico, pueden tener respuestas marcadamente diferentes a un enfoque de tratamiento idéntico. Años de investigación han revelado a los científicos que las variaciones individuales se atribuyen principalmente a la naturaleza del cáncer gástrico como una población celular heterogénea, polimórfica y diversamente diferenciada, lo que lleva a disparidades individuales significativas en las respuestas al tratamiento28. En consecuencia, la adquisición de muestras de cáncer gástrico mediante endoscopia o cirugía gastrointestinal alta y muestras de sangre, junto con la secuenciación de alto rendimiento para el análisis genético, permite un tratamiento personalizado del cáncer gástrico. Esta estrategia está diseñada para mejorar la eficacia del tratamiento clínico y reducir el riesgo de efectos secundarios tóxicos graves. Los avances en la tecnología de secuenciación de semiconductores iónicos han convertido el tratamiento personalizado en una realidad práctica29.

Estas son algunas limitaciones de este método de prueba. El kit utilizado aquí es principalmente para el diagnóstico in vitro , por lo que se limita a detectar la mutación de rs1801131 y rs1801133 del gen MTHFR , rs1650697 y rs442767 del gen DHFR , rs1805087 del gen MTR , rs11545078 del gen GGH y rs1051298 del SLC19A1. No se pueden detectar mutaciones en otras secciones. Debido a la heterogeneidad significativa en el tejido tumoral, las diferentes ubicaciones de muestreo pueden afectar los resultados de la detección. En el caso de las muestras de tejido incluidas en parafina almacenadas durante más tiempo, el ADN y el ARN pueden degradarse hasta cierto punto, lo que afecta a los resultados de la prueba. La recolección, el transporte y el procesamiento de muestras irrazonables, así como el funcionamiento experimental y el entorno experimental inadecuados, pueden dar lugar a resultados falsos negativos o falsos positivos. No se puede garantizar el resultado de la detección si la concentración de ácido nucleico es inferior a 2 ng/μL. Los resultados de las pruebas del kit son solo para referencia clínica. La selección del tratamiento personalizado para los pacientes debe considerarse en combinación con sus síntomas/signos, antecedentes médicos, otras pruebas de laboratorio y reacciones al tratamiento. Los resultados negativos no pueden excluir por completo la existencia de una mutación del gen diana. Los resultados negativos también pueden deberse a un número insuficiente de células tumorales en la muestra, a una degradación excesiva del ácido nucleico o a una concentración de genes diana en el sistema de reacción de amplificación por debajo del límite de detección.

Algunos índices de rendimiento del kit utilizado son los descritos. Sensibilidad analítica: Para muestras de ADN, la cantidad mínima detectable del ácido nucleico total en este kit es de 10 ng, y se puede detectar una tasa de mutación del 5%. Para muestras de ARN, la cantidad mínima detectable del ácido nucleico total en este kit es de 10 ng. Tasa de coincidencia positiva y negativa: La tasa de coincidencia positiva y negativa alcanza el 100%. Límite de detección (LOD): Se pueden utilizar un total de 14 referencias LOD, numeradas L1-L14. L1-L11 son referencias LOD de los genes MTHFR, DHFR, MTR, GGH y SLC19A1 , y sus resultados de detección deben ser que los tipos de mutación de los sitios de genes correspondientes son positivos y las tasas de coincidencia son del 100%. Repetibilidad: Se pueden utilizar un total de cinco materiales de referencia repetitivos, numerados R1-R5. R1 es un material de referencia repetitivo positivo fuerte (mutación rs67376798 del gen DPYD ). R2, que contiene esta mutación en menor número, es un material de referencia repetitivo positivo débil (mutación rs67376798 del gen DPYD ), R3 es un material de referencia repetitivo negativo (6 sitios de los genes DPYD, MTHFR y ABCB1 se detectan como tipo salvaje). Cada muestra de referencia debe ser analizada 10 veces, asegurando que los resultados de estas evaluaciones repetidas se correspondan con sus clasificaciones predefinidas. Volumen de datos: El volumen de datos efectivo de las muestras de ADN y ARN debe controlarse por encima de 0,05 M. La profundidad de secuenciación de las muestras de ADN se controlará por encima de 500, y las lecturas mapeadas de las muestras de ARN se controlarán por encima de 20000. Prueba de interferencia: Este kit no se ve afectado por sustancias de interferencia endógenas (triglicéridos y albúmina) y sustancias de interferencia exógenas (formalina y alcohol deshidratado).

Se deben observar algunas precauciones durante el experimento. El kit utilizado aquí solo se puede utilizar para pruebas in vitro. Lea atentamente este manual antes del experimento y utilícelo dentro del período de validez. Los componentes del kit en diferentes lotes no se pueden utilizar indistintamente. Se recomienda utilizar consumibles desechables para este kit para evitar la contaminación. Durante el uso de este kit, se recomienda utilizar un cabezal de succión con un elemento filtrante. Con el fin de evitar cualquier peligro biológico potencial en la muestra, la muestra de ensayo debe considerarse como sustancias infecciosas para evitar el contacto con la piel y las membranas mucosas. Se recomienda manipular las muestras en una cabina de bioseguridad que pueda evitar la salida de aerosoles. Los tubos de ensayo y las ventosas utilizadas en la operación deben esterilizarse antes de desecharlos. La operación y eliminación de muestras debe cumplir con los requisitos de las leyes y regulaciones pertinentes: Directrices generales para la bioseguridad de los laboratorios biomédicos microbianos y Reglamento de gestión de desechos médicos del Ministerio de Salud30,31. El personal experimental debe recibir capacitación profesional, operar en estricta conformidad con las instrucciones y separar estrictamente las áreas de acuerdo con el proceso experimental. En cada etapa de la operación experimental se utilizarán instrumentos y equipos especiales, y los artículos de cada etapa de cada área no se utilizarán indistintamente. El personal experimental debe separar estrictamente las áreas de acuerdo con el proceso experimental. En cada etapa de la operación experimental se utilizarán instrumentos y equipos especiales. Tome las medidas de protección necesarias, como guantes, ropa de trabajo, etcétera. La eliminación de residuos se ajustará a la normativa nacional pertinente.

Aunque este artículo se centra en los siete SNPs dentro de cinco genes relacionados con el cáncer gástrico, la secuenciación en aplicaciones prácticas no se limita solo a estos cinco genes. En este trabajo se establece definitivamente una correlación significativa entre los siete SNPs y la sensibilidad a la quimioterapia con 5-FU en el cáncer gástrico.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio está respaldado por Explorando el mecanismo y el papel de la vía ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL en la resistencia de las células de cáncer gástrico a la ferroptosis inducida por apatinib (número de artículo: 82172814), respaldado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China; Investigación del papel y el mecanismo del factor de transcripción 1 del dedo de zinc en la modulación de la resistencia de las células cancerosas gástricas a la ferroptosis inducida por apatinib a través de la vía del éter fosfolípido poliinsaturado (número de artículo: 2022A1515010267), con el apoyo del Comité Provincial de Guangdong para la Financiación de la Investigación Básica y Aplicada; y los proyectos de investigación y aplicación de reactivos para el diagnóstico de la quimiosensibilidad del 5-FU para el cáncer gástrico (Nº artículo: 201903010072), en Guangzhou.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,5 mL DNA LoBind TubesEppendorf30108051
tubos de 50 mLGreiner Bio-One227261
Amplificación de cáncer gástricoThermo FisherLos cebadores son silificados por Thermo Fshier de acuerdo con la secuencia en Table 1.
DesparafinaciónQiagen19093
Perlas magnéticas de purificación de ADNBechkmanA63881
Alcohol etílicoGuangzhou Chemical Reagent
Factory Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher4480441
Vida acuática libre de nucleasas TecnologíasAM9932
Tubos de PCRAxygenPCR-02D-C
Tubos de PCRAxygenPCR-02D-C
Puntas de pipeta científicos de calidadhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Minicolumnas de ARN PureLinkThermo FisherA29839
RecoverAll Kit de aislamiento total de ácidos nucleicosThermo FisherAM1975
Mini centrífuga de mesaSCILOGESS1010E
TermocicladorTechnologies4375786
Analizador de ácidos nucleicos ultramicroBEIJING ORIENTAL SCIENCE & DESARROLLO DE TECNOLOGÍA LTD.BD-1000
Productos Life

Referencias

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