Evaluación microbiológica rápida in situ para enfermedades infecciosas pulmonares

Resumen

El protocolo aquí demuestra un flujo de trabajo rápido y estandarizado de evaluación microbiológica rápida in situ (M-ROSE), que incluye tres pasos: fabricación de portaobjetos, tinción e interpretación. Este protocolo ayudará a los médicos a tomar decisiones clínicas rápidas.

Resumen

El inicio temprano de la terapia antiinfecciosa empírica es crucial en los pacientes que presentan una infección pulmonar inexplicable. Aunque la adquisición de imágenes es relativamente sencilla en la práctica clínica, su falta de especificidad a menudo requiere pruebas adicionales que requieren mucho tiempo, como el cultivo de esputo, el cultivo de líquido de lavado broncoalveolar o la secuenciación genética para identificar con precisión la etiología subyacente de la enfermedad. Además, la eficacia limitada del tratamiento antiinfeccioso empírico puede contribuir al mal uso de los antibióticos. Los avances recientes en la interpretación de los antecedentes microbianos en los portaobjetos de evaluación rápida in situ (ROSE) han permitido a los médicos obtener rápidamente muestras a través de la broncoscopia (p. ej., lavado alveolar, cepillado de mucosas, pinzamiento de tejido), lo que facilita la tinción y la interpretación a pie de cama que proporciona información esencial de antecedentes microbianos. En consecuencia, esto establece una base para el desarrollo de tratamientos antiinfecciosos específicos y planes de terapia farmacológica individualizados. Con una mejor comprensión de qué patógenos están causando infecciones en tiempo real, los médicos pueden evitar antibióticos innecesarios de amplio espectro que contribuyen a la resistencia a los antibióticos. El establecimiento de un flujo de trabajo rápido y estandarizado de M-ROSE dentro de los departamentos de medicina respiratoria o las unidades de cuidados intensivos ayudará en gran medida a los médicos a formular estrategias de tratamiento precisas para los pacientes, lo que tiene implicaciones clínicas significativas.

Introducción

La técnica de evaluación rápida in situ (ROSE) es un método altamente eficiente empleado en el campo de los procedimientos de enfermedad pulmonar. Permite la toma de muestras en tiempo real y la intervención diagnóstica, facilitando el análisis citológico inmediato¹. Este enfoque innovador consiste en imprimir una parte de la muestra de tejido en un portaobjetos mientras se preserva su integridad. Una de las principales ventajas de ROSE radica en su capacidad para facilitar la interpretación rápida de la información clínica mediante técnicas de microscopía especializadas. Esto abarca el análisis de la morfología celular, la clasificación, la cuantificación, la determinación de las proporciones de constituyentes, la evaluación de la disposición, el análisis de correlación, la evaluación de los antecedentes y la identificación de objetos extraños. Al integrar todos estos datos con la información clínica del paciente, ROSE desempeña un papel fundamental en la evaluación de la adecuación del muestreo y en la orientación de los procedimientos y técnicas de intervención en tiempo real².

Como subsidiaria de la tecnología ROSE, la tecnología M-ROSE se centra principalmente en la adquisición de los antecedentes microbiológicos de las lesiones objetivo en lugar de discernir entre células benignas y malignas ^3,4. Por un lado, M-ROSE permite la identificación microscópica de patógenos como Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis y Candida⁵. Por otro lado, tiene implicaciones orientadoras significativas en la evaluación de la calidad de las muestras respiratorias, distinguiendo las enfermedades infecciosas de las no infecciosas, discriminando la infección de la contaminación, así como evaluando la gravedad y el pronóstico de la infección ^6,7. Por ejemplo, dentro de un espécimen respiratorio, la coexistencia de bacterias que exhiben una morfología idéntica junto con células inflamatorias infiltrantes indica una infección; Por el contrario, la presencia de múltiples bacterias morfológicamente diversas acompañadas de células epiteliales sugiere contaminación. La capacidad de analizar exhaustivamente la información clínica y predecir los resultados hace de M-ROSE una herramienta inestimable en los procedimientos de enfermedades pulmonares.

En conclusión, ROSE sirve como un portador citológico crucial que mejora significativamente la eficiencia y la precisión del diagnóstico de enfermedades pulmonares. Sus capacidades multifacéticas contribuyen a mejorar los resultados de los pacientes al garantizar una intervención oportuna y facilitar un diagnóstico preciso a través de técnicas de intervención diagnóstica y muestreo en tiempo real. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estos avances se basan en la obtención de muestras calificadas. En este artículo, presentamos un protocolo estandarizado M-ROSE que abarca la preparación de portaobjetos, técnicas de tinción y pautas de interpretación. Este protocolo sirve como una referencia invaluable para que los médicos establezcan planes precisos de evaluación y tratamiento, al tiempo que facilita la toma de decisiones con respecto al manejo posterior de las muestras objetivo.

Protocolo

El ensayo clínico ha sido aprobado por el Comité de Aprobación del Hospital de Medicina Tradicional China de Chongqing (No. 2022-ky-31). El caso típico involucró a un paciente diagnosticado con neumonía por Pneumocystis, y se obtuvo el consentimiento informado del paciente.

1. Requisitos de equipo y material para ROSE

1. Equipo: Consulte el archivo de la Tabla de Materiales para conocer el equipo utilizado en este protocolo.
   NOTA: Es imperativo utilizar un microscopio citológico dedicado y un sistema de imágenes gráficas (Figura 1A).
2. Preparación del material (ver Tabla de Materiales).
   1. Prepare portaobjetos estériles de cultivo celular (con una fuerte adhesión celular), papel absorbente, guantes de látex sin polvo, agujas de jeringa desechables de 2,5-5 ml y coloque el juego completo de soluciones de tinción Diff Quik (DQ) en frascos de vidrio con tapas selladas para facilitar su manejo (Figura 1).

2. Flujo de trabajo de M-ROSE

1. Preparación de portaobjetos citológicos
   NOTA: Hay muchas maneras de preparar portaobjetos, y los siguientes son varios métodos de preparación comúnmente utilizados.
   1. Correderas de rollo
      NOTA: Asegúrese de que la pérdida mínima de la muestra de tejido durante este proceso sea mínima.
      1. Extraiga las partículas de tejido utilizando una aguja de jeringa desechable con una capacidad de 2,5-5 mL (Figura 2A).
      2. Extienda un área circular, de aproximadamente 1 cm de diámetro y grosor moderado, desde la sección interna hasta la externa de un tercio del extremo teñido (el extremo exhibe una fuerte adhesión celular) en el portaobjetos de citología estéril.
   2. Deslizadores de pincel
      NOTA: Este método es aplicable a muestras obtenidas utilizando cepillos celulares convencionales, cepillos celulares anticontaminación o cepillos celulares ultrafinos, así como especímenes semilíquidos como esputo y fluidos corporales viscosos.
      1. Extienda el cabezal del cepillo y aplíquelo en el tercio distal del portaobjetos de vidrio citológico estéril (el portaobjetos tiene fuertes propiedades de adhesión celular) para obtener un área rectangular de aproximadamente 2 cm x 1 cm con un grosor moderado.
   3. Portaobjetos de pulverización
      1. Coloque la aguja de punción en un tercio del extremo teñido de un portaobjetos de citología estéril con una sólida adhesión celular.
      2. Aplique presión de aire en la punta de la aguja perforadora e insértela desde el lado interno hacia afuera, formando un área circular con un grosor medio de aproximadamente 1 cm de diámetro.
2. Tinción de portaobjetos citológicos
   NOTA: La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la tinción rápida del portaobjetos citológico de ROSA con el colorante⁵ de Diff. El tinte Diff se puede reutilizar pero no se puede repetir muchas veces. Si hay sedimentos, deben filtrarse después de su uso. El teñido demasiado profundo puede ser decolorado adecuadamente por metanol o alcohol, preferiblemente ya no teñido. Si el teñido es demasiado profundo o demasiado superficial, se debe ajustar el tiempo de teñido o la concentración del líquido de trabajo; el valor de pH tiene cierta influencia en el teñido, y el portaobjetos debe estar limpio y libre de contaminación ácida y alcalina. Tanto la solución Diff A como la solución Diff B son volátiles y deben sellarse y almacenarse después de su uso.
   1. Sumerja el portaobjetos en una solución de Diff A durante 10-30 s (Figura 2B), luego enjuáguelo en el baño de tinte PBS para eliminar el exceso de solución de Diff A y sacuda suavemente cualquier tampón restante (Figura 2C).
   2. A continuación, sumerja el portaobjetos en la solución Diff B durante 20-40 s (Figura 2E).
   3. Finalmente, limpie el portaobjetos en el tanque de teñido con agua (Figura 2F), seque y limpie el líquido residual del portaobjetos con papel absorbente (Figura 2D) y termine de teñir.
      NOTA: M-Rose permite la visualización directa de microorganismos patógenos y facilita la evaluación de la calidad de las muestras respiratorias, lo que permite discriminar entre infección y no infección, así como infección y contaminación, lo que tiene una importancia orientadora para la evaluación de la gravedad y el pronóstico de la infección. La sección de discusión cubrirá este aspecto, ya que no implica ningún procedimiento experimental.

Resultados

En un caso típico, un hombre de 63 años acudió al hospital con tos, fiebre y dolor torácico. El paciente fue diagnosticado previamente de síndrome nefrótico, caracterizado por proteinuria y edema, y recibió tratamiento con prednisona y tacrolimus durante mucho tiempo. Los hallazgos iniciales de laboratorio demostraron un recuento de glóbulos blancos de 10,49 x 10⁹/L, recuentos de neutrófilos de 8,87 x 10⁹/L, proteínas C reactivas en sangre total y concentraciones de (1-3)-β-D-glucano de 155,81 mg/L y 249,7 pg/mL. La tomografía computarizada (TC) de tórax mostró opacificación en vidrio esmerilado con localización difusa, bilateral y central (Figura 3A). El tratamiento antiinfeccioso inicial con cefoperazona tazobactam fue ineficaz y sus síntomas se agravaron con cansancio cardíaco, dificultad para respirar y disnea después del ejercicio; La TC repetida no mostró una mejoría significativa (Figura 3B). Luego, el paciente fue trasladado a la unidad de cuidados intensivos (UCI) para ventilación mecánica y se le realizó una broncoscopia. Se accedió al muestreo focalizado bajo la guía de la navegación virtual, y se recogieron tres muestras de biopsia de fórceps (Figura 4). Se dispuso de ROSE para la evaluación microscópica inmediata del tejido y se confirmó el diagnóstico de Pneumocystis jiroveci (Figura 5A). El paciente recibió inmediatamente tratamiento antifúngico con sulfametoxazol (1,92 g, q6h); la tinción posterior (Figura 5B-E) confirmó este diagnóstico. Sin embargo, la TC repetida aún no mostró una mejoría significativa (Figura 3C). El paciente recibió carbofungina (el primer día de 70 mg y seguido de 50 mg diarios), metilprednisolona (80 mg diarios) e inmunoglobulina (10 g diarios) para la infección fúngica. Los síntomas se aliviaron rápidamente y el paciente continuó con el tratamiento de seguimiento.

Figura 1: Equipos y materiales. (A) Microscopio citológico y sistema de imagen gráfica. (B) Solución de tinción Diff Quik (DQ) A. (C) Solución de tinción Diff Quik (DQ) B. (D) Guantes de látex sin polvo. (E) Portaobjetos estériles de cultivo celular. (F) Agujas de jeringa desechables de 2,5-5 mL. (G) Papel absorbente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo de M-ROSE. (A) Impresión de la diapositiva. (B) Sumerja el portaobjetos en una solución Diff A durante 10-30 s. (C) Enjuague el portaobjetos en el baño de tinte PBS para eliminar el exceso de solución de Diff A. (D) Seque y limpie el líquido residual del portaobjetos con papel absorbente. (E) Sumerja el portaobjetos en la solución Diff B durante 20-40 s. (F) Limpie el portaobjetos en el tanque de teñido con agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de tomografía computarizada de tórax. (A) Al ingreso. B) El día del traslado a la UCI. (C) Después del tratamiento con sulfametoxazol , haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Localización del segmento basal posterior del lóbulo inferior del pulmón derecho por VBN. (A) Bronquio principal derecho. (B) Bronquio medio derecho. (C) Segmento basal posterior del bronquio del lóbulo inferior del pulmón derecho. d) Mapa 3D de VBN. (E) Mapa coronal de la TC de tórax. (F) Mapa axial de la TC de tórax. (G) Mapa sagital de la TC de tórax Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes que documentan la aparición de pneumocystis en varios métodos de tinción. (A) ROSA 100 x 10; Flecha blanca: quistes que contienen ascosporas. (B) Hematoxilina y eosina (H-E), 60 x 10. (C) Azul alcián, 60 x 10. (D) GIEMSA, 40 x 10. (E) Plata hexamina, 20 x 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La neumología intervencionista es una rama valiosa de las enfermedades respiratorias modernas; En particular, ha sido ampliamente utilizado en el diagnóstico de enfermedades pulmonares ^8,9. En los últimos años, la neumología intervencionista diagnóstica ha prosperado debido al aumento de la prevalencia de tumores malignos pulmonares, a las infecciones por patógenos más resistentes a los fármacos en el tracto respiratorio inferior y a las exigentes solicitudes de diagnóstico de enfermedades respiratorias desconcertantes y críticas 10,11,12. La eficacia del diagnóstico intervencionista depende de factores como el tamaño y la localización anatómica de las áreas focales, las tasas de complicaciones y el número de sitios de biopsia, así como de las enfermedades subyacentes, lo que promueve el uso clínico de numerosas tecnologías e instalaciones avanzadas¹³. ROSE ha recibido una atención notable y surgió rápidamente como una "técnica de acompañamiento en tiempo real" para el diagnóstico en neumología intervencionista.

ROSE está diseñado para una evaluación rápida, un diagnóstico preliminar y una priorización de la satisfacción de la muestra durante procedimientos como la punción, la biopsia y el cepillado. Proporciona retroalimentación para guiar los avances tecnológicos posteriores 14,15,16,17. M-ROSE, una rama de ROSE, se centra principalmente en la evaluación del fondo microbiano más que en la evaluación de la malignidad de las células^{tisulares 5}. El método M-ROSE es una técnica de evaluación rápida más que una herramienta diagnóstica, por lo que no se debe exagerar su eficacia diagnóstica. Su aplicación clínica abarca principalmente los siguientes aspectos: identificación visual de ciertos microorganismos patógenos, diferenciación entre infección y contaminación, y discriminación entre infección y no infección⁷.

Después de una tinción rápida, el núcleo celular del tejido exhibió un tono rojo violáceo, mientras que el citoplasma mostró un color púrpura azulado. Las bacterias y los hongos aparecían de color azul, lo que resultaba en un claro contraste entre las células de los tejidos y los patógenos⁷. M-ROSE podría demostrar un cierto nivel de capacidad para identificar bacterias y hongos. En concreto, presenta una alta tasa de positividad para Aspergillus, cryptococcus, Pneumocystis jiroveci y otros hongos ^3,18. Sin embargo, tiene limitaciones a la hora de reconocer patógenos de pequeño volumen y diámetro o agentes patógenos intracelulares. Es crucial subrayar que el diagnóstico de cualquier enfermedad debe basarse en una evaluación integral que abarque la condición fundamental del paciente, las manifestaciones clínicas, los exámenes de imagen y otros factores, en lugar de basarse únicamente en la identificación microscópica de los microorganismos patógenos.

M-ROSE también ofrece ventajas en la identificación de infecciones y contaminación, como la evaluación de la calidad de las muestras de líquido de lavado alveolar. En los departamentos donde las condiciones lo permiten, la evaluación del líquido de lavado a pie de cama se puede realizar mediante centrifugación y tinción. Las muestras calificadas de líquido de lavado alveolar demuestran que la proporción de células escamosas entre todas las células (excluyendo los glóbulos rojos) bajo microscopía de baja potencia es inferior al 1%, las células epiteliales columnares son inferiores al 5% y los glóbulos rojos son inferiores al 10% (excluyendo factores relacionados con traumatismos o hemorragias)¹⁹. El examen microscópico de los antecedentes citológicos nos facilitará la realización de evaluaciones oportunas.

Además, M-ROSE puede ayudar a distinguir entre lesiones infectadas y no infectadas⁵. En las lesiones infectadas, a menudo hay infiltración de neutrófilos, macrófagos y linfocitos por células inflamatorias, con observación ocasional de fagocitosis de neutrófilos. Por el contrario, las lesiones no infectadas suelen carecer de infiltración de células inflamatorias.

El protocolo presentado aquí demuestra el proceso de operación de M-ROSE; A través de la interpretación de los antecedentes microbiológicos, se puede hacer el diagnóstico preliminar o se puede acotar el diagnóstico diferencial. Como sugieren nuestros hallazgos, el diagnóstico de PCP requiere evidencia confirmada de Pneumocystis jiroveci, que no debe basarse en manifestaciones clínicas e imágenes, incluso en pacientes sintomáticos de alto riesgo. La identificación microscópica del asco y las formas tróficas es la evidencia más intuitiva. La eficiencia diagnóstica está determinada en gran medida por el método de tinción de la muestra. Históricamente, las tinciones convencionales como la de Wright-Giemsa, la plata hexaamina y el azul de toluidina están disponibles para la PCP, pero requieren mucho tiempo y tienen una sensibilidad más baja. En este caso, el diagnóstico inmediato de PCP se confirmó el primer día del traslado del paciente a la UCI con el uso de ROSE. Diff-quick ha demostrado su ventaja en la identificación de pneumocystis, caracterizado por una estructura clara, un contraste agudo y una fácil identificación del asco (Figura 5A).

En la aplicación de la medicina étnica, la rosa también tiene un valor significativo. Por ejemplo, en las enfermedades supurativas, los clínicos pueden identificar una amplia gama de células inflamatorias dominadas principalmente por neutrófilos dentro del contexto microbiológico⁵. En consecuencia, se pueden seleccionar medicamentos con propiedades limpiadoras y desintoxicantes como posibles tratamientos para estas afecciones, como la madreselva, el diente de león y la patrinia, entre otros.

Dado que ROSE es un programa adicional que no tiene que ser seleccionado en neumología intervencionista, la realización de ROSE está destinada a aumentar los costos laborales y económicos. Es discutible que ROSE deba usarse de forma regular. En términos de los beneficios de la economía, los costos de tiempo y mano de obra son lo que nos preocupa. La principal necesidad laboral adicional es el evaluador. La evaluación de ROSE puede ser realizada por un citotecnólogo, patólogo o clínico. Los citotecnólogos son el personal más probable para el procedimiento ROSE. Sin embargo, en la práctica clínica, los clínicos sustituyen el rol, pero puede requerir una cierta base de formación¹⁵. Un estudio previo mostró que un programa de capacitación podría ayudar a mejorar la precisión de la evaluación de adecuación realizada por los clínicos y eliminar las variables de confusión²⁰. Además, la M-ROSE, como técnica diagnóstica morfológica, tiene factores subjetivos en su informe de resultados. Los médicos deben realizar una evaluación exhaustiva basada en información clínica adicional.

Recomendamos que los hospitales con instalaciones adecuadas y profesionales capacitados consideren implementar el procedimiento ROSE en sus departamentos respiratorios o UCI, ya que puede facilitar la evaluación temprana de enfermedades respiratorias críticas desafiantes y guiar el tratamiento clínico de manera efectiva.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio citológico	Olympus Corporation	CX43
Soluciones de tinción Diff Quik (DQ)	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Agujas de jeringa desechables de 2,5-5 ml	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Guantes de látex sin polvo	Henan Yadu Industrial Co., Ltd	20182140728
Célula estéril diapositivas de la cultura	Jinan Preret industria y comercio Co., LTD	7101