Muestreo de sangre de la vena subclavia en ratas conscientes

Las ratas son uno de los animales de experimentación más comunes, y hay muchas formas de obtener muestras de sangre. En el caso de los experimentos que impliquen una sola extracción de sangre en la fase final, se puede obtener una cantidad suficiente de sangre mediante punción cardíaca o extracción de sangre de la aorta abdominal¹. Sin embargo, algunos estudios requieren la recolección repetida de sangre de ratas para análisis de sangre o bioquímicos de rutina, especialmente en estudios de farmacocinética y toxicología, donde se requiere la recolección repetida de sangre para determinar la absorción, distribución y metabolismo de los medicamentos².

En la actualidad, aunque la extracción de sangre en las venas de la cola es el método más común para la toma de muestras de sangre de ratas, a pesar de no requerir anestesia, este método puede ser un desafío para las recolecciones repetidas, y el volumen de sangre recolectado es relativamente pequeño ^3,4. Además, aunque se puede recolectar sangre de las venas safena y del pene, la cantidad de sangre obtenida es limitada y se requiere anestesia ^1,5. Además, las muestras de sangre recogidas del plexo venoso submandibular, así como de las venas sublingual, yugular y subclavia, proporcionan muestras de mayor calidad, pero suelen requerir anestesia o la asistencia de varios individuos 1,6,7,8,9. Por último, la extracción de sangre de los senos paranasales retroorbitarios no solo requiere anestesia, sino que también puede causar lesiones y estrés a las ratas⁹.

La calidad de las muestras de sangre que normalmente se obtienen de las venas principales es generalmente del más^{alto nivel.} En la actualidad, algunos estudios han encontrado que la microtoma continua a través de la vena yugular es un método muy adecuado para la investigación toxicológica en ratas, aunque este método suele requerir el cateterismo de la vena yugular 10,11,12. Por lo tanto, vale la pena explorar cómo obtener muestras de sangre de alta calidad de acuerdo con el principio de las 3R de la investigación con animales sin intervención quirúrgica. El objetivo de este estudio fue presentar un método para extraer sangre de la vena subclavia de manera eficiente en ratas. Esta técnica permite la rápida recogida de muestras satisfactorias a través de un procedimiento de una sola persona sin necesidad de anestesia.

Este estudio se adhirió a las directrices trazadas en la 8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio¹³. La investigación recibió la aprobación del Comité de Ética del Segundo Hospital de la Universidad de Lanzhou y se documentó el cumplimiento de las directrices ARRIVE 2.0¹⁴. Doce ratas Wistar sanas (seis machos con un peso de 290-330 g y seis hembras con un peso de 250-280 g) de entre 12 y 16 semanas de edad se alojaron en el Laboratorio de Animales GLP de la Universidad de Lanzhou durante 3 días antes del experimento real. Las jaulas para ratas utilizadas eran del tipo R5, de 545 mm x 395 mm x 200 mm, y estaban equipadas con material de cama esterilizado en autoclave. A todas las ratas se les proporcionó acceso sin restricciones tanto a comida como a agua. El laboratorio mantuvo una humedad promedio de 25%, una temperatura promedio de 24 °C y un ciclo de luz que alternaba entre el día y la noche (7:00 AM/7:00 PM). Al final del estudio, todos los animales fueron sacrificados humanamente con una sobredosis de isoflurano. Para obtener información completa sobre los materiales e instrumentos empleados en este estudio, consulte la Tabla de materiales.

1. Cálculo del tamaño de la muestra y selección de animales

1. Elija el método de la ecuación de recursos¹⁵ para estimar el tamaño de la muestra animal utilizando la ecuación (1).
   E = Número total de animales − Número total de grupos (1)
   Donde E es el grado de libertad de análisis de varianza (ANOVA) y oscila entre 10 y 20.
   NOTA: En este estudio, 12 animales fueron divididos en dos grupos A y B (tres machos y tres hembras por grupo).
2. Defina el resultado primario de este estudio como la tasa de éxito y el consumo de tiempo de la toma repetida de muestras de sangre por parte de un solo individuo.
3. Defina las medidas de resultado secundarias como los cambios en el peso corporal de la rata, la ingesta de alimentos y agua, así como la incidencia de eventos adversos (como fracturas de clavícula, hematomas subcutáneos, neumotórax y mortalidad).
4. Defina el muestreo de sangre exitoso como el cumplimiento de los siguientes criterios: i) menos de tres punciones para una sola extracción de sangre; ii) un tiempo total (desde la inmovilización de las ratas hasta la finalización de la extracción de sangre) que no exceda de 5 min; y iii) lograr el volumen sanguíneo deseado mientras se obtiene plasma claro. Considere cualquier desviación de estos criterios como un error de muestreo.

2. Sujeción de animales y extracción de sangre

NOTA: Las muestras de sangre de ratas de los grupos A y B fueron recolectadas por dos investigadores experimentados, quienes habían extraído al menos 100 muestras de sangre. Se recogieron muestras de sangre de ambos grupos de ratas un total de 96 veces en el transcurso de 4 días. Este método de extracción de sangre no requiere anestesia ni dispositivos de sujeción adicionales para las ratas. Sin embargo, requiere técnicas de manejo expertas.

1. A las 8:00 a.m. del día anterior a la toma de muestras de sangre (día 1), asigne a cada rata a su jaula individual mientras se pesan su comida y agua. Luego, haga que otro investigador, ciego a las mediciones, registre el peso, el consumo de alimentos y la ingesta de agua de las ratas todos los días a las 8:00 a.m. desde el día 1 en adelante.
2. Para seguir este protocolo, primero se debe extraer sangre a las 10:00 a.m. y luego a las 10:00 p.m. todos los días, recolectando 0.15 mL de sangre alternativamente de las venas subclavias en ambos lados.
   NOTA: La cantidad de sangre a recolectar se determinó por el volumen máximo que la rata de menor peso podía tolerar dentro de una semana.
3. Enjuague una jeringa con heparina sódica (25 U/mL) y desinfecte el lugar de la inyección con alcohol.
4. Acaricia suavemente la piel de la espalda de la rata y pellizca su cuello repetidamente para ayudar a la rata a relajarse (Video 1).
5. Con el pulgar y el índice de la mano no dominante, agarre y levante firmemente la piel del cuello de la rata (Figura 1A y Video 1).
6. Con la coordinación de la mano dominante, use los tres dedos restantes y la palma de la mano no dominante para asegurar la piel de la espalda de la rata e inmovilizar sus extremidades delanteras (Figura 1B, C y Video 2).
   NOTA: Si la rata se resiste o lucha, este procedimiento se puede repetir varias veces para ayudar a la rata a acostumbrarse a la manipulación. Los siguientes pasos son clave para una recolección de sangre exitosa.
7. Usando el dedo índice de la mano no dominante, empuja suavemente hacia abajo la piel de la cabeza de la rata mientras los otros dedos, junto con la palma, ayudan a rotar hacia afuera la articulación del hombro. Durante este proceso, use la mano dominante para extender completamente la articulación del hombro de la rata (Figura 1D-F y Video 2).
8. Sujete a la rata firmemente con la mano no dominante para alinear la cabeza y el cuerpo de la rata en línea recta (Figura 1G, H). Luego, use la mano dominante para ubicar la posición de la clavícula y confirmar el sitio de punción (Figura 1I, Video 2 y Video 3).
   NOTA: No es necesario afeitar a la rata. En la Figura 1, el afeitado se realizó solo para mostrar la clavícula y la posición de punción en mayor medida. Al sujetar a las ratas, especialmente a las ratas >350 g, permitir que la rata descanse las patas sobre una superficie sólida ayudará a soportar su peso corporal. Además, el inmovilizador debe controlar la frecuencia respiratoria de cada rata mientras recolecta sangre para asegurarse de que la sujeción no esté demasiado apretada, lo que puede causar dificultad respiratoria.
9. Sosteniendo la jeringa paralela al cuerpo de la rata en la mano dominante, con la punta de la aguja hacia arriba y la escama de la jeringa hacia el experimentador, mantenga un ángulo de aproximadamente 15° con la línea media del cuerpo de la rata. Inserte la aguja 0,5 cm por debajo de la muesca de la clavícula (en la unión del tercio proximal de la clavícula y el esternón), asegurándose de que la aguja permanezca paralela al cuerpo de la rata (Figura 1J y Video 3).
   NOTA: Se debe prestar especial atención al ángulo y la profundidad de la inserción de la aguja para evitar perforar el vaso sanguíneo o causar daños inadvertidos a los vasos adyacentes.
10. Retire suavemente la jeringa ligeramente para crear una presión negativa, a menudo acompañada de una sensación palpable de avance al entrar en el vaso sanguíneo (particularmente pronunciada durante la extracción inicial de sangre). Mantenga esta posición y recoja 0,1-1,0 ml de sangre a una velocidad constante según sea necesario (siguiendo las pautas de la IACUC de aproximadamente 4-5,3 ml/kg de sangre por semana¹) (Figura 1K y video 3).
11. Si no hay sangre en el momento de la punción, intente ajustar suavemente el ángulo y la profundidad de la aguja o gire suavemente la jeringa (Video 3). Si tres intentos consecutivos en el mismo lado no tienen éxito, detenga todo el sangrado y luego cambie al lado opuesto para la punción.
    NOTA: Es aconsejable realizar una punción rápida a través de la piel para evitar que la rata luche debido a la incomodidad.
12. Aplique un hisopo de algodón para la hemostasia y devuelva a la rata a su jaula (Video 4).
13. Procesar las muestras de sangre de acuerdo con los requisitos experimentales.

3. Procesamiento de muestras de sangre

1. Deseche la aguja de la jeringa en un recipiente para objetos punzocortantes. Transferir la sangre recolectada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente enjuagado con heparina. Coloque el tubo en una centrífuga, ajustándolo a 4 °C y 1.200 x g, y centrifugue durante 10 minutos para separar el plasma. Transfiera el suero con una pipeta Pasteur de 1,0 ml a un tubo de microcentrífuga limpio y guárdelo a -80 °C.
   NOTA: Para evitar la hemólisis debida a la presión, retire la punta de la aguja cuando sea necesario. Durante la aspiración de plasma, evite extraer células sanguíneas del fondo del tubo. Ocasionalmente, la superficie de la jeringa puede acumular pelo de rata; Tenga cuidado de no permitir que entre pelo en el tubo, ya que puede provocar coágulos.

4. Análisis estadístico

1. Presente todos los datos como media ± desviación estándar y pruebe la homogeneidad de la varianza.
2. Utilice la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de éxito entre los grupos.
3. Utilice una prueba t independiente de dos muestras para comparar las medias generales entre los dos grupos.
4. Utilice el análisis de varianza (ANOVA) para mediciones continuas como el tiempo de muestreo de sangre, el peso corporal, la ingesta de alimentos y el consumo de agua. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.

Las muestras de plasma de alta calidad exhiben un tono, claridad y transparencia de color amarillo pálido, desprovistos de cualquier tinte rojo o coagulación, como se muestra en la Figura 2A. La Figura 2B muestra hemólisis (lado izquierdo) o coagulación (lado derecho) como resultado de procedimientos inadecuados, respectivamente. En el transcurso de 96 sesiones de extracción de sangre en 4 días, los tiempos promedio de extracción de sangre para los grupos A y B fueron de 119,87 ± 33,62 s y 123,28 ± 30,96 s, respectivamente. No hubo diferencias significativas en los tiempos de extracción de sangre entre los dos grupos sobre una base diaria (t = 0,66, p = 0,54, Tabla 1). Los tiempos de extracción de sangre individuales más cortos fueron de 78 s y 89 s, respectivamente.

El promedio de intentos requeridos para una sola extracción de sangre exitosa fue de 1,21 y 1,17 para los grupos A y B, respectivamente. No hubo diferencia significativa en el número de intentos entre los dos grupos (t = 0,58, P = 0,60, Tabla 2). Las tasas de éxito global fueron del 93,8% (45/48) y del 95,8% (46/48) para los grupos A y B, respectivamente, sin diferencias significativas en las tasas de éxito global entre los dos grupos (P > 0,05, Tabla 1). No hubo diferencias significativas en el momento de la extracción de sangre en el grupo B en cada momento. En el grupo A, el tiempo de extracción de sangre en el segundo día fue menor que el del cuarto día (105,75 ± 14,22 s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, p < 0,01; Tabla 1) . Además, un mayor número de intentos y tiempos de punción más largos a menudo indican tasas de fracaso más altas (Figura 3A-C). Al tercer día, el grupo B encontró una falla atribuida a la hemólisis. En el cuarto día, el Grupo A encontró tres fallas: una por hemólisis y las otras dos por la imposibilidad de obtener muestras de sangre. El grupo B también experimentó un fracaso debido a la imposibilidad de obtener una muestra de sangre.

En el transcurso de 4 días consecutivos de observación, ambos grupos de ratas mostraron un aumento de peso constante. La ingesta de agua y alimentos se mantuvo relativamente constante entre las ratas del mismo sexo. A lo largo de todo el proceso de extracción de sangre, no se observaron casos de mortalidad en ratas, ni se observaron complicaciones significativas, como fracturas de clavícula, neumotórax o hematomas en el sitio de punción (Figura 3D-F y Tabla 3).

Figura 1: Métodos de fijación y extracción de sangre de la vena subclavia en ratas. (A-H) Manipulación de la fijación; (I) ubicación de la clavícula y el sitio de extracción de sangre; (J-L) el proceso de extracción de sangre y hemostasia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Muestras de sangre recogidas con éxito y sin éxito. (A) Muestras de sangre típicas y plasma aislado; (B) muestras de sangre hemolizadas (izquierda) y coaguladas (derecha) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación de la eficacia y seguridad de la extracción de sangre. (A) Tiempo promedio de recolección de sangre por día; (B) número promedio de pinchazos por día; (C) las tasas de éxito y fracaso de la recolección de sangre en ambos grupos; (D-F) cambios en el peso corporal, la ingesta de alimentos y la ingesta de agua durante la extracción de sangre en ambos grupos de ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Anatomía de los vasos del cuello de rata. (A) Estructuras anatómicas superficiales; (B) estructuras anatómicas profundas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tiempos de extracción de sangre y tasas de éxito de los dos grupos de ratas. *El tiempo de extracción de sangre del segundo día fue menor que el del cuarto día en el grupo A (t = 12,39 P < 0,01).

Tabla 2: Número medio de punciones para la extracción de sangre en ratas.

Tabla 3: Cambios en el peso corporal diario, la ingesta de alimentos y la ingesta de agua de ratas.

Vídeo 1: Calmar y manipular ratas. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Procedimientos de sujeción para ratas. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: El procedimiento de extracción de sangre para ratas. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 4: Compresión hemostática en el lugar de la punción. Haga clic aquí para descargar este video.

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