Artículo de método

Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

DOI:

10.3791/66078

⸱

13 de octubre de 2023

 ,  ,  , 
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los esferoides celulares se han considerado un modelo potencial en el campo de las aplicaciones biológicas. Este artículo describe los protocolos para la generación escalable de esferoides celulares utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D, que proporciona un método eficiente para la fabricación robusta y rápida de esferoides celulares uniformes.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los esferoides celulares son modelos tridimensionales (3D) prometedores que han adquirido amplias aplicaciones en muchos campos biológicos. Este protocolo presenta un método para fabricar esferoides celulares de alta calidad y alto rendimiento utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D a través de procedimientos maniobrables. El dispositivo de montaje acústico consta de tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT), cada uno dispuesto en el plano X/Y/Z de una cámara cuadrada de polimetacrilato de metilo (PMMA). Esta configuración permite la generación de un patrón de matriz de puntos 3D de nodos acústicos levitados (LAN) cuando se aplican tres señales. Como resultado, las células de la solución de gelatina de metacriloilo (GelMA) pueden ser conducidas a las LAN, formando agregados celulares uniformes en tres dimensiones. A continuación, la solución GelMA se fotocura con UV y se reticula para que sirva como andamio que soporta el crecimiento de los agregados celulares. Finalmente, se obtienen masas de esferoides maduros y se recuperan disolviendo posteriormente los andamios GelMA en condiciones suaves. El nuevo dispositivo de ensamblaje de células acústicas 3D propuesto permitirá la fabricación a escala de esferoides celulares, e incluso organoides, ofreciendo una tecnología de gran potencial en el campo biológico.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos de cultivo in vitro en 3D, que proporcionan características estructurales y morfológicas más similares a las de in vivo en comparación con los modelos de cultivo 2D convencionales, han sido reconocidos como sistemas prometedores en diversas aplicaciones biomédicas, como la ingeniería de tejidos, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos 1,2,3. Como un tipo de modelo de cultivo 3D, los esferoides celulares suelen referirse a la agregación celular, creando estructuras esferoidales 3D caracterizadas por interacciones mejoradas célula-célula y célula-matriz 4,5,6. Por lo tanto, la fabricación de esferoides celulares se ha convertido en una poderosa herramienta para permitir diversos estudios biológicos.

Para obtener esferoides se han desarrollado diversas técnicas, como la gota colgante7, las placas no adhesivas8 o los dispositivos de micropocillos9. En principio, estos métodos suelen facilitar el ensamblaje celular mediante la utilización de fuerzas físicas como la fuerza gravitacional, al tiempo que minimizan las interacciones entre las células y el sustrato. Sin embargo, a menudo implican procesos que requieren mucha mano de obra, tienen baja productividad y plantean desafíos para controlar el tamaño del esferoide10,11. Es importante destacar que la producción de esferoides con el tamaño y la uniformidad deseados en cantidad suficiente es de suma importancia para satisfacer aplicaciones biológicas específicas. A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, las ondas acústicas, como un tipo de técnica impulsada por fuerzas externas 12,13,14, han mostrado potencial para la fabricación masiva de esferoides celulares con alta calidad y rendimiento, basados en el principio de mejorar la agregación celular a través de fuerzas externas 15,16,17,18 . A diferencia de las fuerzas electromagnéticas o magnéticas, las técnicas de manipulación celular basadas en la acústica no son invasivas y no contienen marcadores, lo que permite la formación de esferoides con una excelente biocompatibilidad19,20.

Comúnmente, se han desarrollado dispositivos basados en ondas acústicas de superficie estacionaria (SAW) y ondas acústicas masivas (BAW) para generar esferoides, utilizando los nodos acústicos (AN) producidos por los campos acústicos permanentes correspondientes 21,22,23. En particular, los dispositivos de ensamblaje acústico basados en BAW, con las ventajas de una fabricación conveniente, fácil operación y excelente escalabilidad, han ganado atención para la fabricación de esferoides celulares24,25. Recientemente hemos desarrollado un dispositivo de ensamblaje acústico fácil basado en BAWs con la capacidad de generar esferoides con alto rendimiento26. El dispositivo propuesto consiste en una cámara cuadrada de polimetacrilato de metilo (PMMA) con tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT) dispuestos respectivamente en el plano X/Y/Z. Esta disposición permite la creación de un patrón de matriz de puntos 3D de nodos acústicos levitados (LAN) para el ensamblaje de celdas de conducción. En comparación con los dispositivos basados en BAW o SAW informados anteriormente, que solo pueden crear una matriz 1D o 2D de ANs 27,28,29, el dispositivo actual permite una matriz de puntos 3D de LAN para la rápida formación de agregados celulares dentro de la solución de gelatina de metacriloilo (GelMA). Posteriormente, los agregados celulares maduraron en esferoides con alta viabilidad dentro de los andamios fotocurados GelMA después de tres días de cultivo. Por último, se obtuvo fácilmente un gran número de esferoides de tamaño uniforme a partir de los andamios GelMA para aplicaciones posteriores.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricación del dispositivo de montaje acústico 3D

  1. Comience preparando cuatro láminas de PMMA de 1 mm de espesor mediante corte láser30, y luego proceda a pegarlas para formar una cámara cuadrada con un ancho interior de 21 mm y una altura de 10 mm.
  2. A continuación, coloque otra lámina de PMMA de 1 mm de grosor en el fondo de la cámara para que sirva de soporte para la biotinta.
  3. Fije cuidadosamente tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT) (cada uno de 20 mm de largo, 10 mm de ancho, 0,7 mm de espesor y con una frecuencia de resonancia primaria de 3 MHz, consulte la Tabla de materiales) en el exterior de las tres paredes ortogonales de la cámara, respectivamente. Asegúrese de que el transductor PZT inferior esté centrado debajo de la cámara.
  4. Suelde los cables a las dos áreas conductoras de cada transductor PZT.
  5. Finalmente, asegure el dispositivo en una base hueca para evitar que el PZT inferior entre en contacto con otras encimeras.

2. Configuración del sistema de montaje acústico

  1. Comience montando el dispositivo acústico en una platina de microscopio, lo que permite observar desde arriba el interior de la cámara.
  2. Coloque un microscopio digital en el lado del dispositivo que esté libre de transductores PZT, lo que permite la observación lateral del interior de la cámara.
  3. Conecte de forma independiente los cables de los tres transductores PZT en serie a tres amplificadores de potencia y tres canales de salida de los generadores de funciones (consulte la tabla de materiales).
  4. Programe los ajustes en los generadores de funciones para cada transductor PZT, especificando parámetros como la forma de onda sinusoidal, la frecuencia y la amplitud.
  5. Para garantizar la esterilización, llene la cámara del dispositivo acústico con alcohol al 75% durante 5 minutos, seguido de una limpieza a fondo con una solución estéril de PBS. Posteriormente, irradiar la cámara con luz UV en un banco limpio durante un mínimo de 1 h.

3. Procedimiento de cultivo y recolección celular

  1. Comience cultivando células C3A, una línea celular de carcinoma hepatocelular humano, en un matraz de cultivo celular T25 utilizando el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10 % de suero fetal bovino y un 1 % de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de materiales).
  2. Cuando las células C3A alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, realice el paso celular de la siguiente manera: en primer lugar, lave el fondo del matraz de cultivo dos veces con PBS. A continuación, añadir 2 mL de tripsina-EDTA al 0,05% al matraz de cultivo celular e incubar a 37 °C para facilitar el desprendimiento celular. Detenga el proceso de tripsinización añadiendo 2 mL de medio de cultivo completo.
  3. Transfiera la solución celular a un tubo de 15 ml y centrifugue a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para obtener un gránulo celular.

4. Preparación de la biotinta

  1. Prepare una solución de GelMA al 6% (p/v) que contenga un 0,5% (p/v) de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) disolviendo 0,3 g de GelMA y 0,025 g de LAP (ver Tabla de materiales) en 5 ml de solución tampón de fosfato (PBS). Deje reposar la mezcla en un baño de agua a 47 °C durante 1 h.
  2. Antes de mezclar con las células, pase la solución de GelMA a través de un filtro de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) para su esterilización.
  3. Vuelva a suspender el gránulo celular mencionado anteriormente (paso 3.3) en medio de cultivo celular. Tiñir un pequeño volumen de células con una solución de azul de tripano al 0,4 % y luego usar un hemocitómetro limpio para el recuento de células.
  4. Mezclar una cantidad adecuada de células C3A, calculada en base a la densidad celular obtenida anteriormente, con la solución esterilizada de GelMA para preparar la biotinta con una densidad celular de 2 × 106 células/mL.
  5. Para la visualización de los esferoides celulares ensamblados, tiña previamente las células C3A incubándolas con un seguidor celular de 2 μM (colorante DiO, ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 20 min. Posteriormente, lavar las células marcadas con medio de cultivo celular fresco tres veces antes de su uso.

5. Montaje de los esferoides celulares utilizando el dispositivo acústico

  1. Pipetear más de 1 ml de biotinta en la cámara esterilizada. Asegúrese de que la distancia cara a cara entre la superficie del líquido y el fondo de la cámara sea un múltiplo entero de la mitad de la longitud de onda acústica.
    NOTA: Se puede controlar esta distancia ajustando el volumen de biotinta añadida. La longitud de onda acústica (λ) se puede estimar utilizando la fórmula λ = c/f, donde c representa la velocidad del sonido en el medio y f es la frecuencia del transductor PZT.
  2. Encienda el generador de funciones y el amplificador de potencia para iniciar el accionamiento de cada transductor PZT.
    NOTA: Se recomienda accionar individualmente cada transductor PZT primero para lograr el patrón celular óptimo de línea paralela. Esto se puede lograr realizando un barrido de frecuencia con un tamaño de paso de 0,001 MHz cerca de la frecuencia de resonancia primaria para cada transductor PZT. Después, aplique simultáneamente estas señales óptimas a los tres transductores PZT para obtener el patrón celular de puntos 3D esperado. Antes de aplicar cada señal de entrada, asegúrese de que las células se dispersen uniformemente en la biotinta agitando suavemente.
  3. Reticulación de la biotinta utilizando luz azul (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) para crear un andamio de hidrogel 3D que encapsula los agregados celulares ensamblados acústicamente. Luego, apague el generador de funciones y el amplificador de potencia.
  4. Transfiera con cuidado el andamio de hidrogel 3D de la cámara a una placa de Petri y córtelo en trozos pequeños (por ejemplo, 2 mm × 2 mm × 2 mm) con una navaja limpia.
  5. Agregue medio de cultivo celular para el cultivo.
    NOTA: Recuerde cambiar el medio de cultivo todos los días.

6. Recuperación de esferoides celulares

  1. Comience observando la formación de esferoides en diferentes capas de los andamios utilizando un microscopio invertido.
  2. Después de 3 días de cultivo, retire el medio de cultivo y lave bien los andamios de hidrogel dos veces con PBS.
  3. Incubar los andamios con más de 2 ml de tampón de lisis GelMA en una dilución de 1:200 con medio de cultivo celular durante 30 min en una incubadora celular. Este paso tiene como objetivo disolver los andamios de hidrogel.
  4. Transfiera la solución del paso anterior a un tubo y luego centrifugue a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener el gránulo de esferoide celular.
  5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio de cultivo fresco para aplicaciones posteriores.

7. Análisis de viabilidad de esferoides

  1. Evaluar la viabilidad de los esferoides celulares dentro de los andamios de hidrogel o en los esferoides recuperados utilizando un kit de tinción vivo/muerto (ver Tabla de materiales).
  2. Incubar las muestras en diferentes puntos de tiempo de cultivo con 1 ml de solución de PBS que contenga 1 μl de Calceína-AM y 2 μl de yoduro de propidio (PI) durante 15 min a 37 °C.
  3. Para las muestras dentro de los andamios de hidrogel, lávelas directamente con PBS dos veces. En el caso de los esferoides recuperados, centrifugar a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un gránulo de esferoide y lavarlo dos veces antes de la observación.
  4. Observe las muestras con un microscopio de fluorescencia y capture las imágenes de fluorescencia.
  5. Calcule la relación entre el área teñida con Calceína-AM y el área total teñida con Calceína-AM y PI utilizando ImageJ para determinar la viabilidad del esferoide.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio se diseñó un dispositivo de ensamblaje acústico en 3D para la fabricación masiva de esferoides celulares. El dispositivo acústico consistía en una cámara cuadrada con dos transductores PZT conectados al plano X y al plano Y en la superficie exterior de la cámara y un transductor PZT en la parte inferior de la cámara (Figura 1A, B). Se conectaron tres canales de salida de dos generadores de funciones a tres amplificadores de potencia para generar tres señales ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fabricación eficiente y estable de esferoides celulares con alto rendimiento utilizando tecnologías como el dispositivo de ensamblaje acústico 3D es muy prometedora para el avance de la ingeniería biomédica y el cribado de fármacos 1,2,3. Este enfoque simplifica la producción masiva de esferoides celulares a través de procedimientos sencillos.

Sin embargo, hay factores críticos a tener en cuenta a ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFA1104600) y la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (LQ23H160011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.22-μ FiltroMerckSLGSM33SSSe utiliza para la esterilización de soluciones GelMA
Placa de cultivo celular de 35 mmCorning430165 Se utiliza para el cultivo de células
Microscopio confocalNikonA1RHD25Observación de células fluorescentes
Colorante DiOBeyotimeC1038Colorante utilizado para teñir células
DMEMGibco12430054Medios de cultivo celular
FBSGibco10099141CSuplemento de medios de cultivo celular
Generador de funcionesRigolDG5352Para la generación de señales de RF
GelMARegenovoningunoSe utiliza para preparar biotinta
Tampón de lisis GelMAEFLEFL-GM-LS-001Se utiliza para disolver andamios GelMA
Microscopio invertidoNikonTi-U Observación decélulas
LAPSigma-Aldrich900889Utilizado como fotoiniciador
Kit Vivo-MuertoBeyotimeC2015MAnálisis de viabilidad celular
PBSGibco10010002Utilizado como tampón
Penicilina-estreptomicinaGibco15070063Prevenir la contaminación de los cultivos celulares
Amplificador de potenciaMinicircuitoLCY-22+Aumentar el amplitud de voltaje de los
transductores PZTYantai Xingzhiwen Trading Co., Ltd.PZT-41Unidades funcionales para el dispositivo de montaje acústico
Matraz de cultivo celular T25Corning 430639Utilizado para el cultivo de células
Azul de tripán Gibco15250061Recuento de células
Tripsina-EDTA Gibco25200056Enzima de disociación celular
de señal de RF

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200(2021).
  4. Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002(2021).
  5. Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
  6. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444(2021).
  7. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720(2011).
  8. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  9. Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
  10. Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284(2021).
  11. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608(2020).
  12. Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
  13. Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649(2018).
  14. Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501(2020).
  15. Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
  16. Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015(2019).
  17. Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006(2018).
  18. Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
  19. Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
  20. Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
  21. Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130(2018).
  22. Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110(2021).
  23. Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147(2021).
  24. Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43(2022).
  25. Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181(2020).
  26. Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733(2023).
  27. Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355(2021).
  28. Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
  29. Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013(2020).
  30. Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011(2011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Cultivo celular 3DFabricaci n de esferoidesAndamio de GelMATransductores PZTPreparaci n de biotintaMicroscop a de fluorescenciaAgregados celularesEsferoides de alto rendimiento

Artículos relacionados