Uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en Caenorhabditis elegans

Resumen

La enseñanza de las ciencias biológicas puede ser más estimulante para los estudiantes mediante el uso de la experimentación. Este manuscrito presenta dos protocolos diferentes pero complementarios que se pueden utilizar en el aula para alentar a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con las dietas altas en calorías, la inanición y el envejecimiento.

Resumen

Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un nematodo transparente, no parásito y con una biología simple, lo que lo convierte en una gran herramienta para la enseñanza de las ciencias biológicas a través de la tinción de las células o su contenido molecular. El colorante Lugol (solución de yodo-yoduro de potasio) se ha utilizado ampliamente en bioquímica para teñir las reservas de glucógeno. En este contexto, es posible observar diferencias entre los animales alimentados y los hambrientos, además de los efectos de diferentes condiciones, como diferentes dietas y niveles de oxígeno. La erioglaucina es un colorante azul que indica la pérdida de la barrera intestinal. Cuando la barrera intestinal está intacta, el tinte azul se mancha dentro de la luz; Sin embargo, cuando esta integridad se interrumpe, el tinte se filtra en la cavidad corporal. Usando un microscopio estereoscópico o un microscopio, los maestros pueden demostrar alteraciones fisiológicas y bioquímicas, o pueden instigar a los estudiantes a hacer una pregunta científica y formular hipótesis y probar su hipótesis usando estos ensayos. El presente protocolo describe dos técnicas de tinción en C. elegans que pueden ser fácilmente llevadas a cabo por los estudiantes.

Introducción

La enseñanza de las ciencias biológicas en la escuela secundaria es un desafío continuo. Cabe destacar que el acceso y uso de la tecnología ha traído importantes avances en el proceso de enseñanza-aprendizaje, sin embargo, herramientas como los chatbots de inteligencia artificial dificultan la racionalización y la búsqueda de evidencias debido a las respuestas fáciles (y a veces incorrectas) obtenidas¹. Por eso, el uso de un método científico con experimentación práctica en un enfoque basado en la indagación en el aula es una estrategia importante para desarrollar o estimular el pensamiento crítico, la creatividad y las habilidades técnicas en los estudiantes².

En este contexto, el nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans se ha utilizado con éxito en experimentación con fines didácticos³ debido a sus ventajas particulares: no es un parásito y la Escherichia coli utilizada para la alimentación es de nivel de bioseguridad 1, por lo que reduce casi a cero el peligro biológico; tiene un movimiento de locomoción elegante y cuantificable, que es interesante que los estudiantes observen; y es transparente, lo que permite la observación de órganos, pero también la tinción con pigmentos que pueden indicar la presencia de biomoléculas o la ocurrencia de alteraciones fisiológicas⁴. Por lo tanto, es posible plantear hipótesis y probar en el aula postulados simples relacionados con la bioquímica y los cambios fisiológicos como el envejecimiento.

El glucógeno es un carbohidrato de almacenamiento, formado por una cadena larga y ramificada de moléculas de glucosa formadas por residuos de glucosilo con enlaces lineales glicosídicos (1→4)-α y enlaces glucosídicos (1→6)-α en los puntos de ramificación y es particularmente importante para la contracción muscular, la diferenciación celular y el mantenimiento de la glucemia⁵. El glucógeno se sintetiza después de la alimentación debido a la activación insulínica de la enzima glucógeno-sintasa. Durante el ejercicio o el ayuno, la epinefrina o el glucagón, respectivamente, activan la glucógeno fosforilasa y, por lo tanto, descomponen el polisacárido para proporcionar glucosa-6-fosfato a las células musculares o liberar glucosa libre para evitar la hipoglucemia ^6,7. Las alteraciones en los niveles de glucógeno afectan la diferenciación celular, la señalización, la regulación redox y la madre en diversas condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, incluido el cáncer⁸. En C. elegans, el glucógeno se encuentra principalmente en el músculo esofágico, la hipodermis, el intestino, las neuronas y principalmente en los músculos de la pared corporal⁹. El contenido de glucógeno se puede medir utilizando la solución de yodo de Lugol, ya que el yodo se une a las bobinas helicoidales formando un complejo yodo-glucógeno, dando un color azul-negro o marrón-negro visible y agudo, que se ha utilizado con éxito para demostrar el contenido de glucógeno en C. elegans¹⁰. Se ha demostrado que la acumulación de glucógeno causada por la alta alimentación con glucosa puede reducir la vida útil de las lombrices, acelerando así el proceso de envejecimiento^11,12. Además, las alteraciones metabólicas, otras hormonas y la exposición a xenobióticos pueden alterar el metabolismo del glucógeno^13,14. Por lo tanto, la experimentación sobre el contenido de glucógeno en C. elegans es bastante interesante, ya que diversos factores pueden perturbar su metabolismo y pueden estimular una discusión en clase sobre bioquímica básica asociada con temas transversales como el ejercicio, las dietas, las enfermedades y el envejecimiento.

El envejecimiento es un deterioro funcional dependiente del tiempo causado por el daño celular. Este daño puede estar asociado con estrés oxidativo, desgaste de los telómeros, pérdida de proteostasis, inflamación e incluso por acumulación de cuerpos poliglucosanos insolubles¹⁵, solo por nombrar algunos. Una de las características del envejecimiento es la reducción de la integridad intestinal, asociada a varias enfermedades crónicas que ocurren durante la vida de un organismo¹⁶. El mantenimiento de la homeostasis intestinal depende de la integridad del epitelio intestinal, que está respaldado por proteínas de unión que forman una barrera física y conectan las células epiteliales adyacentes. Cuando hay daño en este epitelio, se produce una fuga de contenido luminal en el intersticio¹⁷. Con base en este mecanismo, la prueba del pitufo se ha utilizado para verificar la integridad intestinal en varios modelos animales, ya que este colorante azul sal disódica de erioglaucina no atraviesa la membrana intestinal, permaneciendo en el lumen¹⁸. Cuando los gusanos se infectan con un patógeno, se contaminan con algunos tóxicos o envejecen, alterando la integridad intersticial, el tinte cruza la barrera y se extiende por todo el gusano, que se vuelve todo azul. Este ensayo permite discutir sobre la fisiología del envejecimiento y experimentar sobre los factores que pueden acelerar o retrasar este proceso al exponer a los gusanos a diferentes condiciones. Los protocolos aquí describirán en detalle estos dos métodos basados en colorantes que se pueden hacer fácilmente en clase para instigar y estimular a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con la bioquímica y la fisiología.

La primera parte del protocolo muestra su aplicabilidad para analizar cualitativa y cuantitativamente el contenido de glucógeno en el modelo¹⁰ de C. elegans. El propósito de la segunda parte del protocolo es evaluar la integridad del intestino de C. elegans. Esta técnica permite el seguimiento del envejecimiento de C. elegans mediante la evaluación de la integridad de las membranas intestinales. Además, permite evaluar si una sustancia acelera o retrasa el envejecimiento y si alguna sustancia tiene potencial tóxico sobre la barrera intestinal¹⁹.

La cepa de C. elegans utilizada para el presente estudio fue de tipo silvestre Bristol N2. Sin embargo, el procedimiento puede ser replicado utilizando cepas que exhiban tasas de crecimiento comparables, o el método debe ser ajustado en función de la necesidad de reemplazo de equipos, considerando que tienen la misma o similar función, o dependiendo de la cepa utilizada, ya que ciertas cepas tienen requisitos específicos de mantenimiento y/o sensibilidad; esta información se puede obtener del Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) o del sitio web de WormBase. Estos cambios no deben afectar a la reproducibilidad del método.

Protocolo

NOTA: La bacteria Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) y las cepas de tipo salvaje Bristol N2 pueden obtenerse del CGC de la Universidad de Minnesota, EE.UU. o de una donación de un laboratorio de C. elegans . Para la seguridad de los investigadores, es imperativo el uso de equipos de protección personal. Aunque las concentraciones de reactivos como el hipoclorito y el hidróxido de sodio son bajas, es esencial usar el EPP recomendado, como se destaca en el manuscrito, para minimizar cualquier riesgo potencial asociado con estos productos químicos.

1. Contenido de glucógeno

1. Preparación de placas de prueba
   1. Prepare seis placas de agar NGM^{de 60} mm x 15 mm 20 (10 mL de agar de medios de crecimiento de nematodos, NGM, como se describe en la Tabla Suplementaria 1) por cepa de gusano y déjelas secar durante 1 día a temperatura ambiente. Mantenga las placas cerradas para evitar la contaminación.
   2. Añadir 200 μL de cultivo líquido de E. coli OP50 (con una densidad óptica = 0,600, aproximadamente a una longitud de onda de 600 nm) por placa para inocular un total de cuatro placas NGM de 60 mm x 15 mm por cepa en la campana de flujo. Deje que las placas cerradas se incuben a 37 °C durante 1 día antes de usarlas.
      NOTA: Prepare seis placas (paso 1.1) pero inocule solo 4 con la bacteria E. coli OP50. Reserve las dos placas restantes a 4 °C para su uso posterior cuando coloque los gusanos en condiciones de inanición. Este análisis puede realizarse por duplicado.
   3. El día de la prueba, agregue 200 μL de D-glucosa 0.025 M a dos placas de agar NGM (6 mm x 15 mm) por cepa que se sembraron previamente con la bacteria E. coli OP50. Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente en la campana de flujo.
      NOTA: Las placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 también se pueden secar cerca de lámparas de alcohol como alternativa al uso de una campana de flujo.
2. Sincronización
   1. Aproximadamente 3 días antes de la sincronización, transfiera 3-4 trozos (3 cm x 3 cm) de un agar NGM de mantenimiento con C. elegans Bristol N2 (tipo silvestre) en diferentes etapas (alrededor de 500 gusanos por trozo) a una nueva placa (150 mm x 90 mm) que haya sido previamente sembrada con la bacteria E. coli OP50.
   2. Coloque la nueva placa con lombrices en un ambiente controlado a 20 °C y mantenga la humedad >95% durante 3 días (72 h permiten que la mayoría de las lombrices alcancen la etapa adulta grávida).
      NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la temperatura de crecimiento dependiendo de la(s) cepa(s) de C. elegans que se utilice.
   3. Con una pipeta Pasteur, recoja los gusanos de la placa preparada con H₂O destilado y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 50 mL.
   4. Espere la sedimentación de los gusanos por gravedad (aproximadamente 15 min) y luego retire el sobrenadante. Repite este proceso 3 veces para eliminar las bacterias. Después del último lavado, reduzca el volumen a 5 mL.
   5. Agregue 10 mL de solución blanqueadora (Tabla suplementaria 1) y agite vigorosamente con las manos durante aproximadamente 6 min.
   6. Inmediatamente después de completar la agitación, llene los tubos hasta una capacidad de 50 ml con tampón M9.
   7. Centrifugar a 1400 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante hasta 5 mL y volver a añadir 45 mL de tampón M9. Repite este proceso 4 veces.
   8. Después del último lavado, reduzca el volumen a 15 mL y manténgalo a temperatura (20 °C) y humedad (>95%) controladas durante aproximadamente 14 h.
      NOTA: El proceso de sincronización puede ser reemplazado por la obtención de óvulos por oviposición: Transfiera aproximadamente 20 gusanos adultos preñados a una placa NGM (6 mm x 15 mm) previamente sembrada con 200 μL de E. coli OP50. Deje que los gusanos pongan huevos durante 1 día. Después de eso, retire los gusanos preñados y espere a que los huevos eclosionen.
3. Preparación de lombrices
   1. Con una pipeta automática, añada 10 μL de los gusanos sincronizados (paso 1.2.8) a un portaobjetos de microscopio y cuente el número de gusanos. Calcular cuánto volumen se debe pipetear para obtener 500-1000 gusanos/μL.
   2. Transfiera 500-1000 gusanos sincronizados L1 (paso 1.2.8) a placas de agar NGM (150 mm x 90 mm, Tabla Suplementaria 1) sembradas con la bacteria E. coli OP50 como fuente de alimento, hasta que alcancen la etapa larvaria 4 (L4) a 20 °C.
      NOTA: Los gusanos se pueden transferir mediante una pipeta automática. Si no dispone de una pipeta automática, utilice una pipeta Pasteur de vidrio y los volúmenes se pueden controlar mediante etiquetas de microtubos o pipetas graduadas de vidrio.
   3. Después de 48 h de sincronización²⁰: recoja las larvas L4 de las placas con tampón M9 (Tabla suplementaria 1), con la ayuda de una pipeta Pasteur de plástico en un tubo cónico limpio de 50 mL y lávelas 3 veces con tampón M9 fresco o repita los lavados hasta que todas las bacterias E. coli OP50 restantes se eliminen por completo (a temperatura ambiente).
      NOTA: El paso de lavado es importante porque algunos gusanos experimentarán inanición durante el procedimiento.
4. Ejecución del ensayo
   1. Transfiera 500-1000 gusanos L4 (paso 1.3.1) de cada una de las nuevas placas de agar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparadas (pasos 1.1.2 y 1.1.3). Manténgalos a 20 °C durante 48 h hasta el día de la prueba. Este cronograma dará como resultado tres grupos experimentales de la siguiente manera, por duplicado (Figura 1):
      A- (inanición): los gusanos crecerán en placas de agar NGM regulares sin la bacteria E. coli OP50;
      B- (regular): los gusanos crecerán en placas de agar NGM regulares sembradas con la bacteria E. coli OP50;
      C- (glucosa alta): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 y que contienen 0,025 M de D-glucosa.
   2. El día de la prueba (después de 48 h): recoger los gusanos y darles tres lavados breves en el tampón M9 (pasos 1.2.2 y 1.2.3)
      NOTA: Aquí, prepare placas de agar NGM con la adición de D-glucosa (paso 1.3) y déjelas a un lado hasta que sea el momento de agregar los gusanos.
      1. Tinción de yodo: prepare una solución de yodo Lugol al 5% (v/v) (solución de yodo/yoduro de potasio) utilizando tampón M9 fresco.
         NOTA: La solución de yodo de Lugol se puede obtener de proveedores de reactivos o farmacias locales, por lo tanto, la concentración inicial puede variar. Si es necesario, calcule para obtener una solución al 5% (v/v).
   3. Transfiera aproximadamente 100 μL de gusanos lavados (paso 4.2) de cada grupo al microtubo de 1,5 mL que contiene solución diluida de Lugol (5% v/v). Con una pipeta automática en una proporción 1:5, transfiera 100 μL de gusanos a 400 μL de solución de Lugol, seguido de una agitación suave en un mezclador durante 5 min.
      NOTA: Si no se dispone de un mezclador, es posible agitar los microtubos con las manos cuidadosamente.
   4. Inmediatamente después de estos 5 minutos, centrifugar el microtubo de 1,5 mL (lombrices + solución de Lugol) a 1400 x g durante 3 minutos.
      NOTA: Si este ensayo se realiza en gusanos de la etapa L4 o superior, es posible lograr la sedimentación por gravedad en lugar de usar una centrífuga. Deje los microtubos abiertos en rejillas en la mesa de trabajo durante 10 minutos hasta que todos los gusanos se hayan asentado en el fondo del microtubo.
   5. Retire el sobrenadante y lave las lombrices con 1,0 mL de tampón M9 fresco. Repita el lavado hasta que se elimine todo el yodo restante de la solución (mínimo 3 veces).
   6. Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante, excepto un residuo de aproximadamente 100 μL. Utilícelo para volver a suspender suavemente los gusanos y para el análisis microscópico.
   7. Transfiera aproximadamente 50 μL de la solución de gusano resuspendida a portaobjetos de microscopía y cúbralos con cubreobjetos. Observe las imágenes de campo claro utilizando un microscopio estereoscópico (a 1,5x).
      NOTA: Si no se dispone de un microscopio estereoscópico, se puede utilizar un microscopio normal y las imágenes se pueden capturar con la cámara de un teléfono móvil (a 3,4x) utilizando un adaptador. Para evitar errores de luz/brillo/exposición, es crucial que todos los ajustes de la cámara del teléfono móvil sean coherentes para todas las fotografías.
5. Inspección de datos
   1. Datos cuantitativos: Calcular el contenido de glucógeno en función de la tinción con yodo de los gusanos.
      1. Guarde las imágenes del microscopio estereoscópico que contengan un mínimo de 10 gusanos por grupo como un archivo de .jpeg para su posterior procesamiento. Descargue el software gratuito ImageJ para hacer esto. Los detalles se proporcionan en el Archivo Suplementario 1, Figura Suplementaria 1, Figura Suplementaria 2.
      2. Abra la imagen .jpeg con el software ImageJ (que se puede descargar de forma gratuita en https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Haga clic en Línea segmentada y delinee el gusano (un gusano a la vez). Haga clic en Analizar y, a continuación, seleccione Medir para obtener la cuantificación de la mancha. Los datos se mostrarán como la media en la tabla. La media indica los datos calculados a partir de la densidad de tinción por área de gusano.
   2. Datos cualitativos: Obtener imágenes del microscopio estereoscópico de cada grupo y comparar visualmente la tinción de los gusanos. Cree un sistema de puntuación, si es necesario, para analizar la mancha: 0 incoloro; 1 ligeramente manchado; 2 manchados y 3 muy manchados. Usando el microscopio estereoscópico, cuente manualmente aproximadamente 10 gusanos por grupo (mínimo) con un contador manual.

Figura 1: Esquema del ensayo de contenido general de glucógeno en C. elegans. Un esquema del experimento realizado aquí para llevar a cabo el ensayo de contenido de glucógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Evaluación de la permeabilidad intestinal

1. Preparación de lombrices
   1. Aproximadamente 14 h después de la sincronización (paso 1.2.8), transferir 500-1000 gusanos (paso 1.3.1 y NOTA) en la primera etapa larvaria (L1) a cada nueva placa de agar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparada y mantenerlas a 20 °C hasta el día de la prueba. Este cronograma dará lugar a dos grupos experimentales de la siguiente manera (Figura 2):
      A- (jóvenes): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 hasta la etapa larvaria 4 (L4);
      B- (viejo): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 hasta el^7º día de la edad adulta.
      NOTA: Los gusanos mantenidos hasta el^7º día de edad adulta deben lavarse con tampón M9 todos los días y transferirse a nuevas placas de agar NGM (60 mm x 15 mm) con 200 μL de bacteria E. coli OP50 previamente sembradas para reemplazo de alimentos y eliminación de la progenie. Los gusanos más jóvenes flotan durante la decantación y se pueden separar eliminando el sobrenadante. La proporción de gusanos pitufos aumenta con la edad. Sin embargo, la evaluación de la permeabilidad intestinal se puede realizar en cualquier etapa y edad, dependiendo del propósito del estudio.
2. Ejecución del ensayo
   1. El día de la prueba, recoja los gusanos L4 (2 días después del paso 2.1.1) y los gusanos adultos al^7º día (ahora en su^9º día) con tampón M9 (Tabla suplementaria 1) y transfiéralos a microtubos marcados de 1,5 mL.
   2. Centrifugar a 1400 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante, añadir 1,0 mL de M9 y mezclar suavemente. Repite este proceso 3 veces para eliminar las bacterias. Después del último lavado, reduzca el volumen a 500 μL.
   3. Con una pipeta automática, añada 10 μL del sedimento de lombriz a un portaobjetos de microscopio y cuente el número de lombrices. Calcular el volumen a pipetear para obtener 100 gusanos/μL.
   4. Tinción de pitufos: prepare una solución de sal disódica de erioglaucina al 25% (Tabla suplementaria 1) con agua destilada. Si es necesario, utilice el vórtice para una mejor solubilización.
   5. En los nuevos microtubos previamente identificados, utilizando una pipeta automática, añadir el volumen que contiene 100 gusanos, 100 μL de solución salina disódica de Erioglaucina al 25%, 200 μL de E. coli OP50 y completar con tampón M9 para un volumen final de 500 μL.
      NOTA: Los volúmenes de Erioglaucina disódica, E. coli y número de gusanos son fijos. El volumen del tampón M9 es variable y se puede utilizar para llevar el volumen final a 500 μL.
   6. Incubar durante 3 h con agitación en una batidora, protegida de la luz, a temperatura ambiente.
      NOTA: Si no dispone de una batidora, agite cuidadosamente los microtubos con las manos cada 15 minutos.
   7. Después de 3 h, centrifugar el microtubo de 1,5 mL a 1400 x g durante 3 min. Retire 1,0 mL de sobrenadante y lave las lombrices con 1,0 mL de tampón M9.
   8. Repita los lavados hasta que la solución de sal disódica de erioglaucina restante se elimine de la solución. Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante, excepto un residuo de aproximadamente 250 μL. Utilícelo para resuspender cuidadosamente los gusanos y procesarlos para el análisis microscópico.
   9. Transfiera aproximadamente 50 lombrices de solución de lombriz resuspendida a portaobjetos de microscopía y cúbralos con cubreobjetos. Incubar los portaobjetos de microscopía en el refrigerador a -20 °C durante 10 min para paralizar las lombrices.
      NOTA: Otra alternativa para paralizar los gusanos es añadir 10 μL de solución de clorhidrato de Levamisol (10 mM ; Tabla complementaria 1) y cúbralos con cubreobjetos.
   10. Observe y cuente el número total de gusanos y los gusanos totalmente teñidos utilizando el campo claro en un microscopio estereoscópico (a 1,5x). Las imágenes se pueden obtener de la cámara de un teléfono celular (a 3.4x) acoplada a un adaptador. Para evitar errores de luz/brillo/exposición, es crucial que todos los ajustes de la cámara del teléfono móvil sean coherentes para todas las fotografías.
3. Inspección de datos
   1. Datos cualitativos: Obtener imágenes del microscopio estereoscópico de cada grupo (L4 y^7º día de edad adulta) y comparar visualmente la tinción de los gusanos.
   2. Cuente el número total de gusanos y el número de gusanos pitufos (gusanos azules) utilizando un microscopio estereoscópico.
   3. Expresa los resultados como el porcentaje de gusanos pitufos comparando los gusanos jóvenes (L4, como grupo de control) y los gusanos viejos (^7º día de edad adulta):
      A x X = 100 (%) x B
      X = 100 x B / A
      Donde, A = número total de gusanos
      B= número de gusanos pitufos

Figura 2: Esquema del ensayo de permeabilidad intestinal general en C. elegans. (A) Preparación de C. elegans. (B) Tinción con sal disódica de erioglaucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

El ensayo de contenido de glucógeno proporciona un método sólido y rápido para detectar diversas condiciones de prueba, como estudios comparativos de diferentes cepas que pueden influir en la síntesis o degradación de glucógeno. En este estudio, los gusanos L4 se sometieron a tres condiciones de prueba distintas: grupos en ayunas, alimentación y enriquecidos con glucosa. El ensayo se realizó tres veces, y cada condición se replicó dos veces en cada ensayo; en la Figura 3 se muestra una imagen representativa. Después de cada ensayo, se observaron gusanos teñidos con la solución de yodo de Lugol utilizando un microscopio estereoscópico, y se realizó una comparación cualitativa entre los grupos con respecto a la tinción de los gusanos. En cuanto a la observación visual, los gusanos del grupo de ayuno (inanición) mostraron una mancha menos intensa en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 (regular), así como los alimentados con E. coli OP50 y D-glucosa (glucosa alta). Además, los gusanos alimentados con E. coli OP50 y D-glucosa (glucosa alta) mostraron la tinción más intensa.

Figura 3: Imágenes representativas del ensayo de contenido de glucógeno. Los niveles de glucógeno en C. elegans se evaluaron mediante tinción con yodo. Las imágenes microscópicas muestran gusanos representativos de C. elegans sometidos a (A) inanición, (B) condiciones regulares o (C) de glucosa alta durante 48 h. Los gusanos se tiñeron sumergiéndolos en una solución de yodo/tampón M9 de Lugol (1%) durante 5 min, siguiendo el procedimiento detallado en el paso 1.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados de permeabilidad intestinal muestran la diferencia en la tinción de gusanos jóvenes (L4) con intestino intacto y gusanos viejos (^7º día de edad adulta) con membranas intestinales dañadas por el envejecimiento (Figura 4). El intestino de C. elegans es un tejido de importancia central para la salud, ya que desempeña un papel fundamental en la digestión y el metabolismo y sirve como centro de señalización para la respuesta al estrés^{y la regulación} del envejecimiento. En los gusanos jóvenes, el intestino de C. elegans está constituido por una fuerte barrera que evita la fuga de contenido intestinal. Sin embargo, a medida que estos gusanos envejecen, la función de barrera intestinal disminuye y se vuelve más sensible a la alteración debido a la degradación progresiva de las células y las microvellosidades y la acumulación de bacterias en el intestino envejecido^21,22. Cuando los C. elegans jóvenes ingieren el colorante sal disódica de erioglaucina, el intestino del nematodo se tiñe (Figura 4A). Por otro lado, es posible observar que los gusanos envejecidos presentaron una extravasación del tinte, permeando todo el cuerpo del gusano, lo que indica daño a la membrana intestinal (Figura 4B).

Figura 4: Imagen representativa de C. elegans teñida con sal disódica de erioglaucina. La imagen microscópica muestra C. elegans con intestino intacto (estadio L4) y gusanos con intestino roto (^7º día de edad adulta). Los gusanos se tiñeron por inmersión en una solución salina disódica de erioglaucina al 25% durante 3 h, siguiendo el paso 2.2.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Captura de pantalla de ImageJ para seleccionar el contorno de C. elegans . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Captura de pantalla de ImageJ para calcular la media. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Recetas de medios, tampones y cultivos. Composición de los diferentes medios, tampones y cultivos utilizados en el protocolo actual. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 1: Descripción detallada del software ImageJ para cuantificar el contenido de glucógeno en gusanos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En resumen, este protocolo proporciona una evaluación cualitativa del contenido de glucógeno en gusanos C. elegans individuales mediante la tinción de Lugol: un ensayo sencillo, robusto y rápido. La tinción de Lugol es un enfoque no invasivo y sin marcadores que facilita la adquisición de datos moleculares a resoluciones subcelulares, lo que permite el seguimiento de las fluctuaciones del contenido de glucógeno dentro de gusanos individuales¹⁰. Además, el ensayo ofrece la ventaja de la rentabilidad debido a sus mínimos requisitos de equipo. Solo se necesita un microscopio o un microscopio estereoscópico para capturar las imágenes, que se pueden obtener fácilmente con la cámara de un teléfono celular siempre que se mantengan los mismos ajustes de luz / brillo / exposición para todas las imágenes. Además, ciertos ajustes de procedimiento pueden mejorar la eficacia de este protocolo. Los equipos de laboratorio más complejos, como una campana de flujo y una centrífuga, pueden sustituirse por lámparas de alcohol y sedimentación por gravedad. Estas alternativas hacen que el método sea aún más económico y accesible para una amplia gama de investigadores. Además de los investigadores, los educadores también pueden emplear este ensayo con fines educativos en las escuelas para ilustrar los cambios asociados con el almacenamiento de glucógeno y su biosíntesis.

Aunque los ensayos enzimáticos convencionales pueden cuantificar los niveles de glucógeno, la tinción de Lugol se muestra prometedora como un método sensible, preciso, rentable y de alto rendimiento para evaluar las reservas de glucógeno en C. elegans. En nuestro estudio, los datos revelaron diferencias notables en la tinción entre las tres condiciones, lo que sugiere una posible correlación entre las condiciones de alimentación y la intensidad de la tinción. En otras palabras, indica variaciones en el contenido de glucógeno entre los diferentes grupos de alimentación, ya que la intensidad de la tinción es directamente proporcional al contenido de glucógeno. Con estas observaciones y evidencias iniciales, los estudiantes pueden indagar e investigar si varios factores, como diferentes alimentos, bebidas o reactivos químicos, también pueden influir en el contenido de glucógeno en los nematodos.

Un inconveniente de este enfoque surge de su dependencia de los procedimientos manuales y la interpretación subjetiva. La naturaleza subjetiva de la evaluación de la tinción, en la que las puntuaciones se asignan en función de la observación visual, puede dar lugar a variabilidad entre los diferentes analistas, lo que puede introducir fluctuaciones en la interpretación de los resultados.

Este informe también demuestra la evaluación de la integridad intestinal de C. elegans utilizando el colorante sal disódica de erioglaucina. Es posible evaluar la pérdida de la función de barrera intestinal en C. elegans alimentando a los gusanos con un tinte azul que no es absorbible a través de la cutícula. Esta prueba permite comprobar la fuga de tinte fuera del intestino, una prueba conocida como la prueba de los pitufos porque los animales se vuelven azules como los pitufos de dibujos animados²³. Esta metodología se aplicó previamente a Drosophila melanogaster y Danio rerio utilizando un método similar para la evaluación intestinal^24,25. En C. elegans se utilizó el mismo principio de la técnica con la sal disódica de Erioglaucine, considerándose una técnica sencilla y reproducible para verificar la integridad intestinal de C. elegans^19,26.

Este protocolo puede ser utilizado para evaluar la inducción o el retraso del envejecimiento de nematodos y también para verificar el potencial tóxico de sustancias en el intestino de C. elegans de forma fácil y rápida, sin necesidad de utilizar equipos complejos, lo que hace que el método sea económicamente viable^19,27. Además de su uso en la investigación científica, los profesores también pueden emplear este ensayo con fines educativos en instituciones educativas para investigar los cambios en la permeabilidad intestinal de C. elegans. Con una simple prueba, es posible investigar hipótesis sobre el envejecimiento y el efecto de los reactivos químicos sobre la barrera intestinal de los nematodos.

El ensayo se puede adaptar para utilizar otras cepas y estadios larvarios de C. elegans de acuerdo con el propósito del estudio, siempre y cuando los reemplazos cumplan la misma o similar función para mantener la reproducibilidad del método. Para un análisis exitoso, es importante que los gusanos envejecidos se tiñan durante 3 h, como se menciona en el protocolo. Posteriormente, los lavados para eliminar el exceso de tinte son un paso crítico en el método y deben realizarse con cuidado para que los gusanos no se eliminen junto con el sobrenadante. En el caso de la evaluación de sustancias, una de las limitaciones encontradas en el protocolo es la dificultad de encontrar un control positivo de fácil acceso que lise la membrana intestinal de los nematodos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubos de 1,5 mL	Proveedores	locales-incubadora
de 37 grados	KS 4000i	97014-816
Tubo cónico de 50 mL	Proveedores	locales-Placas de
Petri de 6 cm	Proveedores	locales-Agar
bacteriológico	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea Ltda.	9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (tipo salvaje)	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, EE. UU.)	-
CaCL2	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea Ltda.	10035-04-8
Colesterol	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	57-88-5
D-(+)-Glucosa anhidra	Neon	50-99-7
H2O destilado Proveedores		locales-Sal
disódica de erioglaucina	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	3844-45-9
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
Campana de flujo	Mylabor
Incubadora	Panasonic Healthcare, empresa de Norteamérica, MIR-254-PA.	-
KH2PO4	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea Ltda.	7778-77-0
Clorhidrato de levamisol	RIPERCOL L 150F-Lugol
	solución Sigma-Aldrich Brasil Ltda	L6146
MgSO4	Synth	S1063-01-AH
Microcentrífuga	Centrífuga 5425R Eppendorf SE, Alemania
Na2HPO4	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea Ltda.	7558-79-4
NaCl	Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea Ltda.	7647-14-5
Nistatina	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	N6261
Peptona bacteriológica	ê xodo cientí fica	91079-38-8
Microscopio estereoscópico	Leica S8 Apo (Sã o Paulo, Brasil)
Estreptomicina Sulfato	Estreptomax	-