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Artículo de método

Inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína

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DOI:

10.3791/66085

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5 de enero de 2024

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1Department of Molecular and Internal Medicine, Graduate School of Biomedical & Health Sciences, Hiroshima University

En este artículo

Resumen

Las interacciones proteína-proteína son importantes para dilucidar la función de las proteínas diana, y la coinmunoprecipitación (co-IP) puede confirmar fácilmente los IBP. Transfectamos transitoriamente un plásmido que codifica una proteína marcada con un epítopo en células HEK-293 y desarrollamos un método de inmunoprecipitación para confirmar fácilmente la unión de dos proteínas objetivo.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína (IBP) desempeñan un papel fundamental en los fenómenos biológicos, como la organización celular, la transducción de señales intracelulares y la regulación transcripcional. Por lo tanto, la comprensión de los IBP es un punto de partida importante para una mayor investigación de la función de la proteína diana. En este estudio, proponemos un método simple para determinar la unión de dos proteínas diana mediante la introducción de vectores de expresión de mamíferos en células HEK-293 utilizando el método de polietilenimina, lisando las células en un tampón de lisis de proteínas casero y tirando de las proteínas diana en un gel de afinidad de etiqueta de epítopo. Además, el PPI entre las diversas proteínas fusionadas con la etiqueta del epítopo puede confirmarse mediante el uso de anticuerpos de afinidad contra cada etiqueta en lugar del gel de afinidad de la etiqueta del epítopo. Este protocolo también podría utilizarse para verificar varios IBP, incluidos extractos nucleares, de otras líneas celulares. Por lo tanto, se puede utilizar como método básico en una variedad de experimentos de PPI. Las proteínas se degradan por un curso de tiempo prolongado y ciclos repetidos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la lisis celular, la inmunoprecipitación y la inmunotransferencia deben realizarse de la manera más fluida posible.

Introducción

Las proteínas desempeñan un papel importante en todas las funciones celulares, incluido el procesamiento de la información, el metabolismo, el transporte, la toma de decisiones y la organización estructural. Las proteínas median sus funciones interactuando físicamente con otras moléculas. Las interacciones proteína-proteína (IBP) son importantes para mediar las funciones celulares, como la mediación de la transducción de señales, la detección del entorno, la conversión de energía en movimiento físico, la regulación de la actividad de las enzimas metabólicas y de señalización, y el mantenimiento dela organización celular. Por lo tanto, los IBP se pueden utilizar para dilucidar funciones desconocidas2. Los métodos para detectar IBP se pueden clasificar en tres tipos: in vitro, in vivo e in silico. Para la detección in vitro de IBP se han utilizado la coinmunoprecipitación (co-IP), la cromatografía de afinidad, la purificación por afinidad en tándem, las matrices de proteínas, la visualización de fagos, la complementación de fragmentos de proteínas, la cristalografía de rayos X y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear3. Entre estos métodos, la co-IP es ampliamente utilizada debido a su simplicidad.

La etiqueta de fusión FLAG consta de ocho aminoácidos (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), incluido un sitio de escisión de enteroquinasa, y fue diseñada específicamente para la cromatografía de inmunoafinidad4. Las proteínas marcadas con DYKDDDDK se reconocen y capturan mediante un anticuerpo anti-DYKDDDDK. Por lo tanto, se reducen de manera eficiente utilizando perlas de agarosa de unión DYKDDDDK5 para confirmar su unión a proteínas específicas de una manera simple. La inmunoprecipitación se puede realizar en una variedad de células, y una amplia gama de IBP se puede confirmar utilizando anticuerpos contra la proteína de interés. La inmunoprecipitación y la elución de péptidos con perlas de agarosa anti-DYKDDDDK han sido reportadas previamente5.

Aquí, proporcionamos un método de inmunoprecipitación simple en el que un plásmido que codifica una proteína marcada con DYKDDDDK se introduce transitoriamente en las células HEK-293 para confirmar la asociación de dos proteínas de interés. Ciertos anticuerpos DYKDDDDK pueden unirse tanto al extremo N-terminal como al extremo C-terminal de las proteínas de fusión, pero no a otros6. Por lo tanto, para evitar confusiones, se debe elegir el anticuerpo que reconoce la etiqueta fusionada con los extremos N y C. Al insertar una etiqueta de epítopo, puede ser posible evitar cambios conformacionales en la proteína insertando de 3 a 12 pares de bases entre la etiqueta de epítopo y la proteína objetivo. Sin embargo, la secuencia insertada debe ser un par de bases en múltiplos de 3 para evitar el cambio de marco.

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Protocolo

La Figura 1 presenta una descripción general del protocolo.

1. Preparación de soluciones y tampones

  1. Tampón de lisis de proteínas: Prepare el tampón de lisis de proteínas siguiendo un informe publicado anteriormente7 (Tabla 1).
  2. Tampón de lisis de proteínas + inhibidor de proteasa (PI): Añada un inhibidor de proteasa (véase la tabla de materiales) al tampón preparado anteriormente (paso 1.1). Conservar a -20 °C.
  3. Tampón de muestra: Mezclar 900 μL de 4 tampones de muestra Laemmli (ver Tabla de Materiales) y 100 μL de 2-mercaptoetanol. Conservar a -20 °C.
  4. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20) (PBS-P): Mezclar 1.998 L de PBS y 2 mL de monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20) (ver Tabla de Materiales). Almacene a temperatura ambiente.
  5. 1x Tampón Tris/Glicina/SDS: Mezcle 450 mL de DDW y 50 mL de 10x Tris/Glycine/SDS. Preparar a temperatura ambiente el día de su uso.

2. Transfección de plásmidos

  1. Cultivo de células HEK-293 en una placa recubierta de colágeno de 10 cm hasta subconfluencia (80%-95%) utilizando el medio de águila modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades/mL de penicilina G y 10.000 μg/mL de estreptomicina) (ver Tabla de Materiales).
  2. Prepare 1-10 μg de plásmido7 a transfectar por plato y haga una mezcla de transfección. Añadir 150 mM de NaCl a un volumen final de 250 μL por plato. Agita y gira la mezcla.
  3. Añadir 60 μL de 1 mg/mL de polietilenimina (PEI, ver Tabla de Materiales) por placa, seguido de 150 mM de NaCl hasta un volumen final de 250 μL de solución de PEI.
  4. Agregue la solución de PEI a la mezcla de transfección para hacer una solución mezclada. Inmediatamente vórtice (a la velocidad máxima durante 3-5 s, realice lo mismo a partir de entonces) y gire hacia abajo.
  5. Incubar a temperatura ambiente durante 15-30 min. Durante este tiempo, cambie el medio de las células HEK-293.
  6. Espolvorear 500 μL/plato de solución mezclada por todo el plato de células HEK-293 e incubar durante la noche (13-14 h).
  7. Realice el intercambio medio al día siguiente.

3. Lisis celular y preparación de muestras

NOTA: Para evitar la degradación de las proteínas, los pasos posteriores deben realizarse sin conservar ni congelar y descongelar la muestra en la medida de lo posible.

  1. Aproximadamente 48 h después de la transfección, lavar las células tres veces con PBS helado, añadir 500 μL/plato de tampón de lisis de proteínas + PI, y recoger las células mediante un raspador celular y una pipeta en un tubo con baja adsorción de proteínas en hielo.
  2. Agite el vórtice cada 5 min e incube las muestras en hielo durante 10 min.
  3. Centrifugar a 16.400 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo fresco de 1,5 mL con baja adsorción de proteínas. Las muestras pueden almacenarse a -80 °C.
  4. Determine la concentración de proteínas de las muestras con un kit de medición de concentración de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de Materiales).
  5. Separe 200-1000 μg de la misma cantidad de proteína en cada muestra, luego agregue tampón de lisis de proteínas + PI para ajustar el volumen total a 500-1000 μL.
    NOTA: Los siguientes pasos se realizan con hielo.

4. Preparación de la lechada

NOTA: Prepare una suspensión 1:1 de gel de proteína G y gel de afinidad con etiqueta de epítopo el día anterior o el día de la inmunoprecipitación.

  1. Preparación de un gel de proteína G
    1. Con una punta con el extremo cortado, mezcle bien y luego separe el gel de proteína G (consulte la tabla de materiales) de manera que se preparen 20 μL de perlas por muestra.
    2. Centrifugar a 12.000 x g durante 20 s a 4 °C y colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
    3. Añadir 1 mL de tampón de lisis de proteínas + PI al gel de proteína G preparado en el paso 4.1.2 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Centrifugar a 12.000 x g durante 20 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante.
    4. Repita el paso 4.1.3 tres veces.
    5. Agregue un volumen igual de tampón de lisis de proteínas al gel de proteína G para hacer una suspensión de gel de proteína G 1:1. La suspensión de gel de proteína G puede almacenarse a 4 °C durante aproximadamente 1 día.
  2. Preparación de un gel de afinidad de etiquetas epitopo
    1. Con una punta con el extremo cortado, agite bien y luego separe el gel de afinidad de la etiqueta de epítopo (consulte la Tabla de materiales) de modo que se preparen 10-15 μL de perlas por muestra.
    2. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C y esperar 1 minuto en hielo para que las perlas se nivelen. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
    3. Añadir 1 mL de tampón de lisis de proteínas + PI al gel de afinidad de etiquetas de epítopos preparado en el paso 4.2.2 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante con una pipeta.
    4. Repita el paso 4.2.3 dos veces.
    5. Añadir 500 μL de glicina 0,1 M (pH 3,5) al gel de afinidad de la etiqueta de epítopo preparado en el paso 4.2.4 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Este paso se realiza para eliminar los anticuerpos libres de la marca epítopo. Dentro de los 20 minutos posteriores a la adición de glicina, centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que se nivelen y desechar el sobrenadante.
    6. Añadir 500 μL de tampón de lisis de proteínas + PI al gel de afinidad de la etiqueta de epítopo preparado en el paso 4.2.5 y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante.
    7. Repita el paso 4.2.6 tres veces.
    8. Añada un volumen igual de tampón de lisis de proteínas al gel de afinidad de la etiqueta de epítopo para preparar una suspensión de gel de afinidad de la etiqueta de epítopo 1:1. La suspensión de gel de afinidad con etiqueta epitope puede almacenarse a 4 °C durante aproximadamente 1 día.

5. Aclarado previo con el gel de proteína G y captura de complejos proteicos con el gel de afinidad de etiqueta de epítopo

  1. Mezcle una suspensión de proteína G 1:1 (preparada en el paso 4) con una pipeta provista de una punta de corte y añada 40 μL cada vez a la muestra.
  2. Rotar la muestra durante 1 h en un rotador (ver Tabla de Materiales) en aproximadamente 30 s por ciclo en una cámara refrigerada (4 °C).
  3. Centrifugar a 12.000 x g durante 20 s a 4 °C y colocar las perlas en hielo durante 1 min para permitir que las perlas se nivelen.
  4. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL con baja adsorción de proteínas.
  5. Separe la muestra para la entrada de la muestra en el paso 5.4 y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 mL.
  6. Añadir 20-30 μL de suspensión de gel de epítopo 1:1 a la muestra.
  7. Gire sobre un rotor durante aproximadamente 30 s por ciclo en una cámara refrigerada (4 °C) durante 2 h.
  8. Añada tampón de muestra a la entrada preparada en el paso 5.5 para diluirla a 4x, y caliente a 98 °C durante 10 min. La entrada se puede almacenar a -80 °C.
    NOTA: Debido a la posibilidad de degradación de proteínas debido a la congelación y descongelación, se deben realizar los pasos posteriores sin preservar la proteína tanto como sea posible.

6. Lavado y elución de las proteínas precipitadas

  1. Ajuste la temperatura del bloque de calor a 98 °C.
  2. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C y esperar 1 minuto en hielo para que las perlas se nivelen. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
  3. Añadir 1 mL de tampón de lisis de proteínas + PI y mezclar dando golpecitos e invirtiendo. Gire sobre un rotor durante aproximadamente 30 s por ciclo en una cámara refrigerada (4 °C) durante 5 minutos. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 s a 4 °C, esperar 1 min en hielo para permitir que las perlas se nivelen y desechar el sobrenadante.
  4. Repita el paso 6.3 de 5 a 10 veces.
  5. Añadir 10 μL de tampón de muestra a la muestra preparada en el paso 6.4. Hervir a 98 °C durante 10 min.
  6. Centrífuga a 5.000 x g a 4 °C durante 30 s.
  7. Coloque una columna en un tubo nuevo con baja adsorción de proteínas y transfiera el gel a la columna usando una pipeta con una punta cortada. Se utiliza una columna para evitar la contaminación del gel.
  8. Centrífuga a 9.730 x g durante 1 min a 4 °C. Recoja el flujo continuo. La muestra se puede almacenar a -80 °C.
    NOTA: Si la degradación de la muestra es una preocupación, se debe realizar la siguiente inmunotransferencia sin congelación.

7. Inmunotransferencia

NOTA: Los procedimientos de inmunotransferencia se basan en informes previos 7,8.

  1. Cargue muestras enteras en un gel de poliacrilamida de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE, consulte la tabla de materiales).
    NOTA: Si es necesario, utilice geles de pocillos grandes de manera que se pueda transferir toda la muestra. Aquí se utilizaron geles con pocillos de 50 μL.
  2. Coloque los geles en la cámara de electroforesis y agregue 1x tampón Tris/Glycine/SDS (consulte la Tabla de materiales) hasta el volumen apropiado alrededor de los geles.
  3. Geles electroforosos a 100 V y 400 mA.
  4. Transfiera a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF, consulte la tabla de materiales).
  5. Bloquee las manchas de la membrana de PVDF con leche desnatada al 5% en PBS-P durante 1 h a temperatura ambiente.
  6. Lave la membrana tres veces con PBS-P en una coctelera a máxima velocidad durante 5 minutos. Realice el mismo procedimiento a partir de entonces al lavar.
  7. Incubar durante la noche en un agitador con el anticuerpo primario (ver Tabla de Materiales) a 4 °C.
  8. Lave la membrana tres veces con PBS-P al día siguiente.
  9. Incubar durante 1 h con el anticuerpo secundario en un agitador a temperatura ambiente.
    NOTA: Si el peso molecular de la proteína objetivo está cerca de la cadena pesada IgG, que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, se puede usar un anticuerpo secundario específico de cadena ligera para evitar la superposición de la banda objetivo con la cadena pesada IgG. En este estudio se utilizaron anticuerpos específicos de cadena ligera7 o Veriblot como reactivo de detección de IP (véase la tabla de materiales).
  10. Identificar bandas de proteínas con sustratos luminiscentes de peroxidasa. La membrana se puede guardar en PBS después de lavarla dos veces con PBS-P.
  11. Peque durante 10 min con una solución de decapado (consulte la Tabla de materiales).
  12. Lavar tres veces y bloquear con leche descremada al 5% en PBS-P. A partir de entonces, el protocolo es el mismo que en el paso 7.6 en adelante.

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Resultados

Los adipocitos termogénicos, también conocidos como adipocitos marrones y beige, tienen efectos potenciales contra la obesidad y la intolerancia a la glucosa. El dominio PR (PRD1-BF1-RIZ1 homólogo) 16 (PRDM16) es un cofactor de transcripción que desempeña un papel importante en la determinación de la identidad de los adipocitos termogénicos 9,10.

EHMT1 (histona-lisina N-metiltransferasa 1 eucromática), también conocida como GLP, catali...

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Discusión

Este protocolo es casi iguala los protocolos 5,7,14,15 reportados anteriormente. El punto importante de este protocolo es que nunca detenemos el experimento desde la etapa de lisis celular hasta la etapa de inmunoprecipitación. La degradación de proteínas dificulta la detección de IBP. El curso de tiempo prolongado y los ciclos repetidos de congelación y descongelación degradan las proteínas. L...

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Divulgaciones

Declaramos que ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses relacionado con este estudio.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) y MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA (pH8.0)Gen nipón311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Gel de proteínas prefabricadas, 10 pocillos, 50 y micro; LBiorad4561034
10x Tris/Glicina/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Gel de afinidadSigmaA2220
IgG anti-ratón, oveja ab entera ligada a HRPGE HealthcareNA931-1ML
IgG anti-conejo, burro Ab entero ligado a HRPGE HealthcareNA934-1ML
Raspador de células MSumitomo BaquelitaMS-93170
Plato de Colágeno I 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, Cóctel Inhibidor de la Proteasa sin EDTARoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX suplementoInvitrogen 10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlicerolFUJIFILM Wako072-00626
GlicinaFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Conejo mAb #3724Señalización celularC29F4
Laemmli Tampónde muestra Bio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Columnas de cromatografía Biorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell para mini geles prefabricadosBiorad1658004JA
Anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG M2 producido en ratónSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16Este documentoN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1Este documentoN/A
pcDNA3.1-vectorEste documentoN/A
PEI MAX - Grado de transfección Lineal Clorhidrato de polietileniminaPSI24765
Solución de penicilina-estreptomicinaFUJIFILM Wako168-23191
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCAThermo scientific23227
Éter de polioxietileno(10) octilfenilFUJIFILM Wako168-11805
Polioxietileno(20) Monolaurato de sorbitánFUJIFILM Wako167-11515
Proteína G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs Cytiva17061801
Protein LoBind Tuboseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
desnatadaMorinaga0652842 
Solución de peladoFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actina (13E5) Conejo mAb #4970Señalización celular4970S
leche

Referencias

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  10. Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
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