Method Article

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microambiente de la médula ósea está formado por distintas poblaciones celulares, como las células estromales mesenquimales, las células endoteliales, las células del linaje osteológico y los fibroblastos, que proporcionan soporte a las células madre hematopoyéticas (CMH). Además de apoyar las HSC normales, el microambiente de la médula ósea también desempeña un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los síndromes mielodisplásicos (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA). Las mutaciones asociadas a los SMD en las CMH conducen a un bloqueo en la diferenciación y a una insuficiencia progresiva de la médula ósea, especialmente en los ancianos. A menudo, los SMD pueden progresar a LMA resistente a la terapia, una enfermedad caracterizada por una rápida acumulación de blastocitos mieloides inmaduros. Se sabe que el microambiente de la médula ósea está alterado en pacientes con estas neoplasias mieloides. En este trabajo se describe un protocolo completo para aislar y caracterizar fenotípicamente células microambientales de la médula ósea a partir de modelos murinos de síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda. Aislar y caracterizar los cambios en las poblaciones del nicho de la médula ósea puede ayudar a determinar su papel en el inicio y la progresión de la enfermedad y puede conducir al desarrollo de nuevas terapias dirigidas a las alteraciones promotoras del cáncer en las poblaciones del estroma de la médula ósea.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microambiente de la médula ósea está formado por células hematopoyéticas, células estromales no hematopoyéticas y la matriz extracelular 1,2. Este microambiente puede promover la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas, regular la diferenciación del linaje y proporcionar soporte estructural y mecánico al tejido óseo 1,2,3,4,5. El nicho estromal incluye células osteolinajes, fibroblastos, células nerviosas y células endoteliales6, mientras que el nicho hematopoyético está formado por las poblaciones linfoides y mieloides 1,2,3. Además de apoyar las CMH normales, el microambiente de la médula ósea también puede desempeñar un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los SMD y la LMA 7,8,9,10,11. Se ha demostrado que las mutaciones en las células del linaje osteológico promueven el desarrollo de SMD, LMA y otras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.

Los síndromes mielodisplásicos son un grupo de trastornos preleucémicos que surgen de mutaciones en las células madre hematopoyéticas. El SMD se asocia con frecuencia con un bloqueo en la diferenciación de las HSC y la producción de células displásicas, lo que a menudo puede conducir a insuficiencia de la médula ósea. El SMD es la neoplasia mieloide más comúnmente diagnosticada en los Estados Unidos y se asocia con una tasa de supervivencia a 3 años del 35% al 45%15. Los SMD a menudo se asocian con un alto riesgo de transformación a leucemia mieloide aguda. Esto puede ser una complicación mortal, ya que la LMA derivada de SMD es resistente a la mayoría de las terapias y es probable que recaiga. La LMA que surge de novo debido a translocaciones o mutaciones en el tallo hematopoyético y los progenitores también suele ser resistente a la quimioterapia estándar16,17. Dado que los SMD y la LMA son principalmente enfermedades de los ancianos, y la mayoría se diagnostican después de los 60 años, la mayoría de los pacientes no son elegibles para trasplantes curativos de médula ósea. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Dado que el microambiente de la médula ósea puede proporcionar apoyo a las células malignas14, la definición de los cambios en el nicho de la médula ósea con la progresión de la enfermedad puede conducir a la identificación de nuevas terapias destinadas a inhibir la remodelación del nicho tumoral. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Con este fin, es fundamental identificar y caracterizar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea que pueden proporcionar apoyo a las células malignas.

Se han generado varios modelos murinos de LMA y SMD que pueden utilizarse para estudiar los cambios en el microambiente de la médula ósea durante el inicio y la progresión de la enfermedad 6,1,19,20,21,22. En este trabajo se describen los protocolos para identificar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea utilizando modelos murinos de LMA inducida por retrovirales 6,20, así como el modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible comercialmente de transformación de SMD de alto riesgo a LMA19. Los ratones trasplantados con células de LMA de novo sucumben a la enfermedad en 20-30 días6. Los ratones NHD13 desarrollan citopenias y displasia de médula ósea alrededor de las 15-20 semanas, que finalmente se transforma en LMA, y casi el 75% de los ratones sucumben a la enfermedad alrededor de las 32 semanas. Para analizar las poblaciones de microambiente de médula ósea modelo murino, se recolectan huesos, se digieren médula ósea y espículas óseas mediante digestión enzimática, y luego se enriquecen las células para poblaciones no hematopoyéticas CD45-/Ter119- mediante clasificación magnética. Si bien se han descrito previamente análisis similares 11,13,22,23,24,25, a menudo se centran en la médula ósea o en el hueso y no incorporan células de ambas fuentes en sus análisis. La caracterización combinada de estas poblaciones, junto con los análisis de expresión génica, puede proporcionar una comprensión completa de cómo el microambiente hematopoyético celular proporciona apoyo para el inicio y la progresión de la enfermedad (Figura 1). Si bien el protocolo que se describe a continuación se centra en el modelo de LMA inducida por retrovirales y en un modelo genético de SMD, estas estrategias se pueden adaptar fácilmente para estudiar los cambios en el nicho de la médula ósea de cualquier modelo murino de interés.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de animales de la Universidad de Rochester. Para modelar los SMD de alto riesgo, se emplea el modelo murino NHD1319 disponible en el mercado. En este modelo, se analizan las células estromales de la médula ósea en ratones hembra NHD13 a las 8 semanas de edad, antes de la aparición de la enfermedad. De novo La LMA se genera como se ha descrito anteriormente 6,11,20. Los oncogenes utilizados para inducir LMA, como MLL-AF9 y NRas, se marcan con GFP o YFP, lo que permite el análisis de las poblaciones de médula ósea GFP no leucémicas mediante citometría de flujo. En resumen, los ratones hembra C57BL/6J de 10 semanas de edad se trasplantan con células murinas de LMA GFP/YFP+, y la médula ósea se extrae 2 semanas después del trasplante. Si bien en este estudio se utilizan ratones hembra con fines de demostración, este protocolo se puede realizar con ratones machos o hembras. También se puede llevar a cabo utilizando un fémur o todos los huesos largos.

1. Extracción de médula ósea

NOTA: Para obtener más información sobre el protocolo de disección animal, consulte Amend et al.26.

  1. Limpie el mortero con etanol al 70%, enjuáguelos con tampón FACS frío (Tabla 1) y colóquelos en hielo para que se enfríen antes de comenzar la cosecha. Además, coloque el tampón MAC (Tabla 1) en el banco para permitir que alcance la temperatura ambiente.
  2. Sacrificar al animal siguiendo las pautas y protocolos institucionales de cuidado y uso de animales.
  3. En la mesa de trabajo, rocíe bien el ratón con etanol al 70% hasta que su pelaje esté mojado. Con pinzas y tijeras curvas, levante la piel del abdomen y haga dos incisiones de aproximadamente 0,5 mm de longitud a ambos lados del ratón, laterales desde el abdomen. A continuación, realice una incisión de 0,5 mm distal desde el abdomen. Tira hacia abajo para quitar la piel y el pelaje de las patas del ratón.
  4. Coloque las tijeras perpendiculares a la pelvis, presione hacia abajo mientras tira hacia arriba del fémur con fórceps. La cabeza femoral debe separarse de la pelvis. Separe el fémur y la tibia en la articulación patelofemoral. Coloque los huesos en el tampón FACS en una placa de 6 pocillos sobre hielo.
  5. Extraiga el tejido de los huesos con tejido de laboratorio y coloque los huesos limpios en una nueva placa de 6 pocillos con tampón FACS fresco en hielo.
  6. Coloque todos los huesos en el mortero con 2-5 ml de tampón FACS para que todos los huesos queden sumergidos en el tampón (ajuste el volumen de tampón en función de la cantidad de huesos que esté procesando). Triture y muela los huesos con el mortero con movimientos circulares hasta que se libere el tejido de la médula ósea.
  7. Con una jeringa de 3 ml, homogeneice la médula ósea tirando hacia arriba y hacia abajo del líquido del mortero.
  8. Con una jeringa de 3 ml, extraiga el líquido del mortero y fíltrelo a través de un colador de células de 70 μm en un tubo de 50 ml con hielo. Enjuague los trozos de hueso/tejido del filtro nuevamente en el mortero con tampón FACS y regrese al paso 1.7 para homogeneizar y colar por segunda vez. Esto constituye la fracción de la médula ósea.
  9. Enjuague las piezas óseas restantes (espículas) nuevamente en el mortero con tampón FACS y enjuáguelas en un tubo de 15 ml con tampón FACS para garantizar el máximo rendimiento celular. Esta es la fracción de las espículas óseas.

2. Digestión de la médula ósea

  1. Centrifugar la médula ósea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar y desechar el sobrenadante.
  2. Resuspender la médula ósea en 2 mL de la mezcla de digestión de médula ósea (Tabla 1) y transferirla a un tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min en un rotador.
  3. Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la digestión enzimática. Filtre la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
  4. Diluir la mezcla a 400 x g durante 7 min a 4 °C.
  5. Vuelva a suspender el gránulo de médula ósea en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (ver Tabla de materiales). Incubar durante 4 minutos en hielo.
  6. Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la lisis. Filtre la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
  7. Diluir la mezcla a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 100 μL de tampón FACS.

3. Digestión de las espículas óseas

  1. Agita las espículas óseas del paso 1.9 y deja que se asienten. Decantar el sobrenadante y conservar el hueso en la parte inferior.
  2. Resuspender las espículas óseas en 1 mL de la mezcla de digestión de la espícula ósea (Tabla 1).
  3. Coloque los tubos en un rotador de tubos durante 60 minutos a 37 °C.
  4. Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la digestión enzimática. Filtrar la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en el tubo de 50 ml que contiene médula ósea lisada y digerida por glóbulos rojos.

4. Tinción

  1. Mezcle suavemente las espículas óseas y la suspensión de células de la médula ósea.
  2. Utilizar 10 μL de la suspensión celular para contar el número de células vivas en un hemocitómetro utilizando tinción basada en azul de tripano al 0,4%, como se describe en los protocolos publicados27. Recoja 50.000 células para un control sin tinción de la suspensión celular.
  3. Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspenderlo en 100 μL de tampón FACS.
    NOTA: Los anticuerpos se pueden ajustar para determinar la dilución ideal. La selección de anticuerpos (epítopos y fluorocromos) se puede personalizar.
  4. Para la tinción con anticuerpos para la depleción magnética, agregue FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) y Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (consulte la Tabla de materiales).
  5. Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con tampón FACS, extraer 50.000 células (~50 μL) para el control teñido con APC, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C y volver a suspender en 100 μL de tampón FACS.
  6. Para la tinción de la suspensión celular con microperlas para el agotamiento magnético, agregue mIgG (8 μL por 25 x 106 células) y microperlas anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabla de materiales).
  7. Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con 10 ml de tampón FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.

5. Agotamiento de la muestra por clasificación magnética

NOTA: Este paso se lleva a cabo utilizando un separador magnético manual disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este paso también se puede realizar con un separador automatizado (ver Tabla de materiales).

  1. Prepare la columna LD lavándola con 2 mL de tampón MACs (Tabla 1). Deseche el efluente y cambie el tubo de recolección.
  2. Resuspenda hasta 1 x 108 células en tampón MAC y fíltrelas a través de un tubo de ensayo de 5 ml con una tapa de filtro de células de 35 μm.
  3. Coloque la columna LD en el soporte del separador magnético. Coloque un tubo de ensayo de 5 ml debajo de la columna para recoger el eluido.
  4. Agregue la suspensión de celda a la columna LD preparada. Deje que la fracción negativa fluya hacia el tubo de recolección. Lavar la columna dos veces con 1 mL de tampón MACs, recogiendo el eluido en el mismo tubo. Esta es la fracción negativa utilizada en el paso 5.6 a continuación.
  5. Retire la columna LD del soporte del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de ensayo de 5 ml. Utilice una pipeta para dispensar 3 ml de tampón en la columna para eliminar las células que han sido marcadas positivamente, utilizando el émbolo de columna.
  6. Centrifugar las fracciones negativa y positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspenderlos en 100 μL de tampón FACS.
  7. Contar 10 μL de las fracciones negativa y positiva con azul de tripano al 0,4%. Los volúmenes para el osteoanálisis/tinción del panel endotelial a continuación se basarán en este recuento de células.
  8. Utilice 50.000 células vivas de la fracción positiva para los controles de compuerta de citometría de flujo.

6. Osteoanálisis/tinción del panel endotelial

NOTA: La compensación debe realizarse siguiendo los protocolos estándar de citometría de flujo, incluidos todos los controles apropiados de tinción y compuerta.

  1. Para la tinción de la fracción negativa CD45/Ter119 (1 μl de cada anticuerpo por 1 x 106 células), agregue CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE y CD140a-PE-Cy5 (consulte la tabla de materiales).
  2. Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con 2 ml de tampón FACS, luego centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  3. Agregue 1 ml de tampón FACS y una dilución 1:1000 de PI para tinción viva/muerta, luego filtre la muestra a través de un tubo de ensayo de 5 ml con una tapa de filtro celular de 35 μm.
  4. Analice las celdas en un citómetro de flujo multicolor.

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Results

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En este artículo se describe un método basado en citometría de flujo para analizar poblaciones microambientales de médula ósea, como las células endoteliales y mesenquimales, a partir de modelos murinos de SMD y leucemia (Figura 1). La Figura 2 muestra la estrategia de compuerta para la detección de poblaciones de interés, comenzando con la selección de células (P1) en la fracción digerida y agotada en CD45/Ter119 a través del perfil de dispersión frontal y late...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los modelos de leucemia murina se han utilizado ampliamente para identificar señales intrínsecas y de nicho celular que promueven la progresión agresiva de la leucemia mieloide 6,19,21. Aquí, se presenta un protocolo integral basado en citometría de flujo para definir la composición celular del microambiente de la médula ósea en modelos murinos de SMD y LMA.

Antes de adquirir datos de citometría de fl...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No se declaran conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo del URMC. Este trabajo fue apoyado por el Premio Académico de la Sociedad Americana de Hematología, el Premio de la Fundación para la Investigación de la Leucemia y las subvenciones de los NIH R01DK133131 y R01CA266617 otorgadas a J.B.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pipeta de 1 mL Consejos Genesee Scientific 24-165RL
1,7 mL Tubos de microcentrífugaAVANTL211511-CS
10 µ Consejos para pipetasL Genesee Scientific 24-140RL
10 mL Pipetas serológicas estériles envueltas individualmenteGlobescientific 1760
Matraz de filtración al vacío de 1000 mLNEST344021
15 mL Tubo de centrífugaVWR10026-076
2 mL pipeta de aspiraciónNEST325011
200 µ Consejos para pipetasL Genesee Scientific 24-150-RL
25 mL Pipetas Serológicas Estériles Envueltas IndividualmenteGlobe scientific1780
5 mL Pipetas Serológicas Estériles Envueltas IndividualmenteGlobe scientific1740
5 mL Tubo de Poliestireno de Fondo Redondo  12 x 75 mm estiloFalcon352054
5 mL Tubo de Poliestireno de Fondo Redondo con Tapa de Colador de Células 12 x 75 mm estiloFalcon
Tubo de centrífuga de 50 mlNEST602052
6 pozos, fondo plano con tapa de baja evaporación
con barrera impermeable contra la humedadVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparadorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Rata Purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block)BD Biosciences5531410,5 mg/mL 
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Violeta brillante 421 anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) Anticuerpo (D7)Invitrogen404-59810,2 mg/mL
C57BL/6JRatones Laboratorio Jackson 664
Tanque de gas de dióxido de carbonoAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Anticuerpo monoclonal (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820,2 mg/mL
CD45 Anticuerpo monoclonal (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820,2 mg/mL
Filtro de células 70 y micro; m Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Mortero y Maja; Ágata, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Colagenasa de Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Colagenasa Tipo ISTEMCELL7415
Mini centrífuga CorningCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Desoxirribonucleasa I del páncreas bovinoSigma-AldrichD4513
Dispasa II, polvoGibco117105041
DPBS 10xGibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
Absoluto de etanol, KOPTEC, cumple con las especificaciones analíticas de BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Tijeras finas - afiladasFine Science Tools14061-10
Foundation B Suero fetal bovinoGeminiBio900-208
Gilson  Kits de inicio de pipetas PIPETMAN LFisherScientific 
Pinzas GraefeHerramientas de ciencia fina11051-10
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocitómetroFisher02-671-10
Incubadora BINDERC150-UL
Toallitas KimtechKIMTECHK222101
LABGARD Clase II, Tipo A2 Cabina de seguridad biológicaNuaireNU-425-400
LD ColumnasMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Mezclador de vórticeCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson y compañía647800L6
MACS MULTI STAND Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Rotador de tubos Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) Laboratorioratones Jackson 
PE anti-ratón Anticuerpo CD51 (RMV-7)Biolegend1041060,2 mg/mL
PE/Cianinina5 anti-ratón CD140a Anticuerpo (RUO)Biolegend1359200,2 mg/mL
Penicilina-Estreptomicina Gibco1514012210.000 U/mL
Plastipak 3 mL JeringaBecton, Dickinson and Company309657
Yoduro de propidio - 1,0 mg/mL Solución en aguaThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separador Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Centrífuga de la serie Sorvall X Pro / ST PlusThermo Scientific 
Anticuerpo monoclonal TER-119 (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820,2 mg/mL
Solución de azul de tripano 0,4%Gibco15-250-061
Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0 Invitrogen15575-038
352235 Almohadillas absorbentes Falcon 353046 F167370G de 01050575009521

References

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