Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.
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Artículo de método
Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda
En este artículo
Resumen
Resumen
El microambiente de la médula ósea está formado por distintas poblaciones celulares, como las células estromales mesenquimales, las células endoteliales, las células del linaje osteológico y los fibroblastos, que proporcionan soporte a las células madre hematopoyéticas (CMH). Además de apoyar las HSC normales, el microambiente de la médula ósea también desempeña un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los síndromes mielodisplásicos (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA). Las mutaciones asociadas a los SMD en las CMH conducen a un bloqueo en la diferenciación y a una insuficiencia progresiva de la médula ósea, especialmente en los ancianos. A menudo, los SMD pueden progresar a LMA resistente a la terapia, una enfermedad caracterizada por una rápida acumulación de blastocitos mieloides inmaduros. Se sabe que el microambiente de la médula ósea está alterado en pacientes con estas neoplasias mieloides. En este trabajo se describe un protocolo completo para aislar y caracterizar fenotípicamente células microambientales de la médula ósea a partir de modelos murinos de síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda. Aislar y caracterizar los cambios en las poblaciones del nicho de la médula ósea puede ayudar a determinar su papel en el inicio y la progresión de la enfermedad y puede conducir al desarrollo de nuevas terapias dirigidas a las alteraciones promotoras del cáncer en las poblaciones del estroma de la médula ósea.
Introducción
El microambiente de la médula ósea está formado por células hematopoyéticas, células estromales no hematopoyéticas y la matriz extracelular 1,2. Este microambiente puede promover la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas, regular la diferenciación del linaje y proporcionar soporte estructural y mecánico al tejido óseo 1,2,3,4,5. El nicho estromal incluye células osteolinajes, fibroblastos, células nerviosas y células endoteliales
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de animales de la Universidad de Rochester. Para modelar los SMD de alto riesgo, se emplea el modelo murino NHD1319 disponible en el mercado. En este modelo, se analizan las células estromales de la médula ósea en ratones hembra NHD13 a las 8 semanas de edad, antes de la aparición de la enfermedad. De novo La LMA se genera como se ha descrito anteriormente
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Resultados
En este artículo se describe un método basado en citometría de flujo para analizar poblaciones microambientales de médula ósea, como las células endoteliales y mesenquimales, a partir de modelos murinos de SMD y leucemia (Figura 1). La Figura 2 muestra la estrategia de compuerta para la detección de poblaciones de interés, comenzando con la selección de células (P1) en la fracción digerida y agotada en CD45/Ter119 a través del perfil de dispersión frontal y late.......
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Discusión
Los modelos de leucemia murina se han utilizado ampliamente para identificar señales intrínsecas y de nicho celular que promueven la progresión agresiva de la leucemia mieloide 6,19,21. Aquí, se presenta un protocolo integral basado en citometría de flujo para definir la composición celular del microambiente de la médula ósea en modelos murinos de SMD y LMA.
Antes de adquirir datos de citometría de fl.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo del URMC. Este trabajo fue apoyado por el Premio Académico de la Sociedad Americana de Hematología, el Premio de la Fundación para la Investigación de la Leucemia y las subvenciones de los NIH R01DK133131 y R01CA266617 otorgadas a J.B.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipeta de 1 mL Consejos | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1,7 mL Tubos de microcentrífuga | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µ Consejos para pipetas | L Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Pipetas serológicas estériles envueltas individualmente | Globe | scientific 1760 | |
| Matraz de filtración al vacío de 1000 mL | NEST | 344021 | |
| 15 mL Tubo de centrífuga | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL pipeta de aspiración | NEST | 325011 | |
| 200 µ Consejos para pipetas | L Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Pipetas Serológicas Estériles Envueltas Individualmente | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Pipetas Serológicas Estériles Envueltas Individualmente | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Tubo de Poliestireno de Fondo Redondo 12 x 75 mm estilo | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Tubo de Poliestireno de Fondo Redondo con Tapa de Colador de Células 12 x 75 mm estilo | Falcon | ||
| Tubo de centrífuga de 50 ml | NEST | 602052 | |
| 6 pozos, fondo plano con tapa de baja evaporación | |||
| con barrera impermeable contra la humedad | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separador | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Rata Purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0,5 mg/mL |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Violeta brillante 421 anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) Anticuerpo (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0,2 mg/mL |
| C57BL/6J | Ratones Laboratorio Jackson | 664 | |
| Tanque de gas de dióxido de carbono | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Anticuerpo monoclonal (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0,2 mg/mL |
| CD45 Anticuerpo monoclonal (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0,2 mg/mL |
| Filtro de células 70 y micro; m Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortero y Maja; Ágata, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Colagenasa Tipo I | STEMCELL | 7415 | |
| Mini centrífuga Corning | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispasa II, polvo | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | Gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Absoluto de etanol, KOPTEC, cumple con las especificaciones analíticas de BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Tijeras finas - afiladas | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Suero fetal bovino | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson Kits de inicio de pipetas PIPETMAN L | FisherScientific | ||
| Pinzas Graefe | Herramientas de ciencia fina | 11051-10 | |
| Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocitómetro | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubadora | BINDER | C150-UL | |
| Toallitas Kimtech | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Clase II, Tipo A2 Cabina de seguridad biológica | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columnas | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Mezclador de vórtice | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson y compañía | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Rotador de tubos | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Laboratorio | ratones Jackson | ||
| PE anti-ratón Anticuerpo CD51 (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0,2 mg/mL |
| PE/Cianinina5 anti-ratón CD140a Anticuerpo (RUO) | Biolegend | 135920 | 0,2 mg/mL |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | 10.000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Jeringa | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Yoduro de propidio - 1,0 mg/mL Solución en agua | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separador | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Centrífuga de la serie Sorvall X Pro / ST Plus | Thermo Scientific | ||
| Anticuerpo monoclonal TER-119 (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0,2 mg/mL |
| Solución de azul de tripano 0,4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575-038 |
Referencias
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S.
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Reimpresiones y permisos
