Los organoides gástricos derivados de pacientes encuentran un uso cada vez mayor en la investigación, sin embargo, faltan protocolos formales para generar organoides gástricos humanos a partir de digestión de una sola célula con densidad de siembra estandarizada. Este protocolo presenta un método detallado para crear organoides gástricos de forma fiable a partir de tejido de biopsia obtenido durante la endoscopia superior.
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Artículo de método
Establecimiento y caracterización de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de biopsias de cuerpo gástrico benigno y epitelio antral
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Resumen
Resumen
Los organoides gástricos derivados del paciente (PDO) ofrecen una herramienta única para estudiar la biología y la patología gástrica. En consecuencia, estas DOP se utilizan cada vez más en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Sin embargo, existe una escasez de enfoques publicados para producir PDO gástricas a partir de digestión de una sola célula, manteniendo al mismo tiempo una densidad de siembra celular inicial estandarizada. En este protocolo, se hace hincapié en la iniciación de organoides gástricos a partir de células individuales aisladas y en la provisión de un método para el paso de organoides a través de la fragmentación. Es importante destacar que el protocolo demuestra que un enfoque estandarizado para la densidad inicial de siembra celular produce organoides gástricos a partir de tejido de biopsia benigna y permite la cuantificación estandarizada del crecimiento de organoides. Por último, la evidencia apoya la nueva observación de que las PDO gástricas muestran tasas variables de formación y crecimiento en función de si los organoides se originan en biopsias del cuerpo o en regiones antrales del estómago. Específicamente, se revela que el uso de tejido de biopsia antral para la iniciación de organoides da como resultado un mayor número de organoides formados y un crecimiento más rápido de organoides durante un período de 20 días en comparación con los organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico. El protocolo descrito en este documento ofrece a los investigadores un método oportuno y reproducible para generar y trabajar con éxito con PDO gástricas.
Introducción
Los organoides son estructuras celulares tridimensionales (3D) en miniatura que se asemejan a la arquitectura y funcionalidad de los órganos de los que se derivaron 1,2. Estos modelos cultivados en laboratorio se crean mediante el cultivo de células madre o células específicas de tejido en un entorno controlado que permite que estas células se autoorganicen y se diferencien en varios tipos de células 1,2,3. Una de las principales ventajas de los organoides es su capacidad para recapitular la biología humana más de cerca que los cultivos celulares bidimensionales (2D) tradicionales 1,2,3. En particular, se ha demostrado que los organoides humanos mantienen la diversidad genética de su tejido de origen 3,4,5. Los organoides ofrecen una oportunidad única para estudiar el desarrollo de los órganos humanos, modelar enfermedades y probar posibles terapias en un entorno de laboratorio controlado. Además, los organoides pueden derivarse de muestras individuales de pacientes, lo que permite enfoques de medicina personalizada y el desarrollo potencial de tratamientos individualizados 3,6,7.
Los investigadores han utilizado organoides gástricos humanos para investigar varios aspectos de la biología y la patología gástrica. Ejemplos destacados incluyen el uso de organoides derivados del paciente (PDO) para predecir las respuestas a la quimioterapia del cáncer gástrico 8,9,10 y modelar la respuesta epitelial a la infección por Helicobacter pylori 11,12,13. Los organoides gástricos humanos consisten en varios tipos de células que se encuentran en el estómago, incluidas las células del cuello, las células de la fosa y otras células de soporte11,14. Los organoides gástricos pueden generarse a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o células madre aisladas directamente del tejido gástrico obtenido mediante biopsias o de muestras de resección gástrica11,14. El aislamiento de las células madre gástricas del tejido gástrico se realiza comúnmente mediante el aislamiento y cultivo de glándulas gástricas o la digestión enzimática de muestras de tejido para liberar células individuales 9,13,15. Es importante destacar que la diferenciación de las células dentro de los organoides gástricos generados mediante cualquiera de estas técnicas ha demostrado ser similar13. El protocolo descrito en este documento se centra en un resumen de una sola célula.
Los organoides representan una innovación científica que cierra la brecha entre el cultivo celular tradicional y los órganos completos. A medida que la investigación en el campo continúa progresando, los organoides están preparados para contribuir al desarrollo de tratamientos y terapias más efectivos para una amplia gama de aplicaciones. Dada la creciente utilización de las DOP gástricas, existe una necesidad oportuna de un enfoque estandarizado para su generación. En este trabajo se describe el protocolo para la generación de PDOs gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de tejido de biopsia gástrica benigna adquirido durante la endoscopia alta. De manera importante y única, se determina un número estandarizado de células individuales para la siembra con el fin de generar de manera confiable PDO gástricas y permitir la caracterización posterior. Utilizando esta técnica, se demuestran diferencias confiables en la formación y crecimiento de organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico o del antro gástrico.
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Protocolo
Todo el tejido humano utilizado en este protocolo se recolectó de personas que dieron su consentimiento informado para la recolección de tejido a través de un estudio de recolección de tejido gástrico aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania (IRB #842961). Los participantes en este estudio debían someterse a una endoscopia superior como parte de su atención de rutina, tener al menos 18 años de edad y ser capaces de proporcionar un consentimiento informado. Todas las investigaciones realizadas se adhirieron a las pautas establecidas por la Universidad de Pensilvania.
1. Preparación experimental
- Prepare los medios L-WRN acondicionados como se describió anteriormente16. Aunque no es obligatorio, las concentraciones de Wnt-3A, R-espondina y cabeza contenidas en los medios acondicionados se pueden verificar utilizando un kit ELISA disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare antibióticos RPMI (RPMI-ABX), antibióticos PBS (PBS-ABX), DITIOTRITOL PBS (PPS-TTT), TAMPÓN DIGESTIVO Y MEDIOS ORGANOIDES GÁSTRICOS (consulte la Tabla Suplementaria 1 para obtener información detallada sobre la composición). El medio organoide gástrico es estable durante 1 semana a 4 °C.
- Pinzas de autoclave, tijeras de disección fina y tubos de 1,5 ml.
- Comience a descongelar la matriz de la membrana basal (Matrigel) en hielo.
- Comience a descongelar el tampón de digestión y la tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 °C.
- Ajuste un agitador orbital de incubadora a 37 °C y 200 rpm.
2. Aislar células individuales del tejido de la biopsia
- Recolectar biopsias gástricas durante una endoscopia alta17 siguiendo el protocolo clínico institucional, probablemente con el uso de pinzas jumbo. Utilice una aguja de punta roma para extraer muestras de tejido de las pinzas y colóquelas en un tubo cónico de 15 ml que contenga medios RPMI-ABX. Mantenga el tubo en hielo para una rápida transferencia al laboratorio.
NOTA: Como mínimo, se deben recolectar de 2 a 4 biopsias. - Deje que el tejido de la biopsia se asiente en el fondo del tubo cónico. Utilice una pipeta para aspirar el medio y lave las biopsias dos veces con 1 ml de tampón PBS-ABX. No hay necesidad de centrifugación, ya que las piezas de tejido se depositan naturalmente en el tubo cónico.
- Transfiera un mínimo de 20 mg de tejido de biopsia a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de PBS-DTT.
- Use tijeras de disección finas para cortar el tejido en pedazos de 1 a 2 mm o menos.
- Utilice una minicentrífuga de mesa durante 15 s para agregar piezas de tejido en el fondo del tubo y aspirar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Un pequeño volumen residual de PBS-TDT es aceptable.
- Agregue 5 ml de tampón de digestión recién calentado a un tubo cónico de 50 ml. Para transferir los pequeños trozos de tejido sin perder tejido, tome 500 μL del tampón de digestión y agréguelo al tubo de 1,5 mL que contiene el tejido. A continuación, modifique la punta de una punta de pipeta de 1000 μL con unas tijeras para aumentar el diámetro de la punta, lo que permite una fácil aspiración y transferencia de piezas de tejido al tubo cónico de 50 ml que contiene el tampón de digestión.
- Incubar el tampón de digestión y la mezcla de tejidos a 37 °C durante 30 min con agitación orbital a 200 rpm.
- Añadir 5 ml de tripsina calentada con EDTA al 0,25% al tampón de digestión e incubar durante 10 min más a 37 °C con agitación orbital a 200 rpm.
- Neutralice el tampón de digestión y la tripsina añadiendo un volumen igual de medios DMEM/F12 avanzados (Adv.) y pase la solución a través de un filtro celular de 70 μm.
- Granular las células por centrifugación a 1400 x g durante 4 min a 4 °C. Dependiendo del tamaño inicial del tejido de la biopsia, un gránulo de células pequeñas puede o no ser visible.
- Vuelva a suspender el gránulo de células en 1 ml de medio ADV. DMEM/F12 y cuente el número de células viables con azul de tripano y un hemocitómetro.
- Vuelva a granular las células mediante centrifugación a 1400 x g durante 4 min a 4 °C y retire el sobrenadante.
NOTA: La Figura 1 presenta una representación esquemática del proceso de aislamiento de células individuales del tejido de la biopsia.
3. Incrustación de células individuales en una "cúpula" de matriz de membrana basal
- Con base en el número contado de células viables, calcule el volumen de matriz de membrana basal requerido para lograr una concentración final de 105 células viables por cada 50 μL de matriz de membrana basal.
- Realice lo siguiente rápidamente para evitar que la matriz de la membrana basal se polimerice antes de enchapar. Retire la matriz de la membrana basal descongelada del hielo, agregue el volumen de la matriz de la membrana basal previamente calculado a las celdas y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante aproximadamente 10 s.
NOTA: Es crucial evitar la creación de burbujas durante este paso. No diluir la matriz de la membrana basal. - Pipetear rápidamente 50 μL de alícuotas de la mezcla de matriz de membrana basal/célula en el centro de pocillos individuales en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
- Cubra inmediatamente la placa de 24 pocillos y, con un solo movimiento suave, voltee la placa boca abajo. Coloque la placa invertida en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 35 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice.
NOTA: La inversión de la placa es esencial para evitar que las células se hundan en el fondo de la placa y para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice en forma de "cúpula" 3D. - Agregue 500 μL de medio organoide gástrico precalentado a cada pocillo, asegurándose de que la parte superior de cada "cúpula" esté completamente sumergida en el medio. Dispense el medio por el costado de cada pocillo para evitar perturbar la "cúpula".
- Cambie los medios cada 2-3 días.
4. Pase rutinario de organoides por fragmentación
- Una vez que los organoides estén listos para el paseo, retire el medio de cada pocillo designado.
NOTA: Para determinar el tiempo apropiado para la aprobación, consulte la sección Resultados representativos. - Dispense 1 ml de medio Adv. DMEM/F12 helado directamente sobre una "cúpula" de matriz de membrana basal. Esto debería iniciar fácilmente la ruptura de la "cúpula". Continúe aspirando y dispensando hasta que todos los fragmentos de la "cúpula" se desprendan de la placa.
- Transportar tanto el medio como la matriz fragmentada de la membrana basal al siguiente pozo, repitiendo este proceso para todos los pozos programados para el paso. Después de desmontar la "cúpula" final de la matriz de la membrana basal, dispense el medio y la mezcla de organoides y la matriz de la membrana basal en un tubo de 1,5 ml.
- Coloque una punta de 1000 μL en una pipeta P1000 y, a continuación, inserte esta punta en una punta de 200 μL. Esto creará una punta de pipeta con un diámetro lo suficientemente pequeño como para fragmentar los organoides y, al mismo tiempo, permitir la aspiración de un volumen mayor.
- Pipetear vigorosamente la mezcla de organoides y la matriz de la membrana basal hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 25 veces para fragmentar los organoides en trozos pequeños.
- Centrifugar la mezcla de organoides fragmentados con una centrífuga de mesa a 4 °C durante 30 s a 2000 x g. Esto dará como resultado un gránulo de organoides fragmentados separados de la matriz y el medio de la membrana basal. Utilice una pipeta para aspirar el medio y el sobrenadante de la matriz de la membrana basal. No utilice un vacío para aspirar el sobrenadante, ya que el gránulo está suelto.
- Calcule el volumen de matriz de membrana basal recién descongelada requerido para que el número de pozos/domos se divida en una proporción de 1:2 (50 μL/domo). Agregue la matriz fresca de la membrana basal y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas.
- Alicuar rápidamente 50 μL de la mezcla de fragmentos de organoides y matriz de membrana basal en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
- Cubra la placa, déle la vuelta y colóquela en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C durante 35 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice.
- Agregue 500 μL de medio organoide gástrico precalentado a cada pocillo.
NOTA: La Figura 2 presenta una descripción esquemática del paso de organoides gástricos derivados de pacientes a través de la fragmentación.
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Resultados
Los resultados representativos posteriores se derivan de biopsias tomadas del epitelio benigno de las regiones del cuerpo gástrico y del antro gástrico del estómago de cinco pacientes diferentes sometidos a endoscopia alta. Se sembraron de dos a cuatro "domos"/pocillos y se analizaron por paciente para biopsias de cuerpo gástrico y antro. Los organoides se generaron con éxito a partir del cuerpo gástrico y del tejido de biopsia del antro gástrico de los cinco pacientes. En promedio, se analizaron 41 organoides por "domo"...
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Discusión
En este trabajo se describe un protocolo detallado para generar de forma fiable organoides gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de biopsias de epitelio benigno del cuerpo gástrico y el antro. Los pasos críticos en el protocolo giran en torno al tiempo, así como al manejo de la matriz de la membrana basal. Para preservar la viabilidad, es fundamental iniciar el protocolo lo antes posible después de adquirir el tejido de la biopsia. El objetivo es comenzar a digerir el tejido de la biopsia dentro de ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones relevantes.
Agradecimientos
Medicina Genómica de la Universidad de Pensilvania T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Programa de Hombres y BRCA en el Centro Basser para BRCA (KHB, BWK), Premio de Subvención de la Fundación de la Familia DeGregorio (BWK).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R& D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Anfotericina B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Colagenasa III | Worthington | LS004182 | |
| Dispasa II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Línea celular | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazol | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Suplemento | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin Kit ELISA | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pluma | Strep Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R& D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R& D Sistemas | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referencias
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