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Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

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DOI:

10.3791/66164

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12 de julio de 2024

 ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Resumen

Los estudios in vivo del comportamiento tumoral son un elemento básico de la investigación del cáncer; Sin embargo, el uso de ratones presenta desafíos significativos en costo y tiempo. Aquí, presentamos larvas de pez cebra como un modelo de trasplante que tiene numerosas ventajas sobre los modelos murinos, incluida la facilidad de manejo, el bajo costo y la corta duración experimental. Además, la ausencia de un sistema inmune adaptativo durante las etapas larvales obvia la necesidad de generar y utilizar cepas inmunodeficientes. Si bien existen protocolos establecidos para el xenotrasplante en embriones de pez cebra, presentamos aquí un método mejorado que involucra la estadificación del embrión para una transferencia más rápida, el análisis de supervivencia y el uso de la citometría de flujo para evaluar la carga de la enfermedad. Los embriones se organizan en etapas para facilitar la inyección rápida de células en la yema de las larvas y el marcado celular para controlar la consistencia del bolo celular inyectado. Después de la inyección, se evalúa el análisis de supervivencia embrionaria hasta 7 días después de la inyección (ppp). Por último, también se evalúa la carga de enfermedad marcando las células transferidas con una proteína fluorescente y analizándolas mediante citometría de flujo. La citometría de flujo es posible gracias a un método estandarizado de preparación de suspensiones celulares de embriones de pez cebra, que también podría usarse para establecer el cultivo primario de células de pez cebra. En resumen, el procedimiento descrito aquí permite una evaluación más rápida del comportamiento de las células tumorales in vivo con un mayor número de animales por brazo de estudio y de una manera más rentable.

Introducción

El análisis del comportamiento de los tumores en respuesta a una alteración genética o al tratamiento farmacológico in vivo es un elemento esencial de la investigación del cáncer 1,2,3,4. En la mayoría de los casos, estos estudios implican el uso de modelos de ratón inmunocomprometidos (Mus musculus)5; Sin embargo, los estudios de xenotrasplantes en ratones son limitados en muchos aspectos, incluyendo la capacidad limitada, la duración prolongada, el gasto significativo y la necesidad de equipos de imagen sofisticados para monitorear la progresión de los tumores internos 6,7. Por el contrario, el modelo de pez cebra (Danio rerio) permite una mayor capacidad, menor duración, menor gasto y, debido a su transparencia, un seguimiento sencillo de la progresión de la enfermedad 8,9.

El pez cebra es un sistema modelo de vertebrados bien desarrollado con desarrollo ex-útero y alta fecundidad, con hembras individuales que producen más de 100 embriones10. Además, los embriones de pez cebra son transparentes, lo que permite una fácil visualización de los procesos de desarrollo utilizando técnicas relacionadas con la fluorescencia, como los reporteros. Finalmente, la conservación de los procesos críticos de desarrollo los convierte en un modelo ideal para muchos tipos de estudios, incluyendo el comportamiento de las células malignas trasplantadas11,12. Los embriones de pez cebra de tipo salvaje desarrollan melanocitos, que los vuelven ópticamente opacos a las 2 semanas de edad, pero esto se ha superado con la generación de embriones de casper (Roya9; mitfaw2), que permanecen transparentes a lo largo de la vida13. Debido a sus propiedades ópticas, el pez cebra casper es un receptor ideal de células tumorales trasplantadas 14,15,16. El xenotrasplante de células tumorales en pez cebra ha ganado importancia en las últimas 2 décadas 17,18,19,20,21. Los embriones de pez cebra tienen inmunidad innata; Sin embargo, carecen de inmunidad adaptativa durante su etapa larvaria, lo que los hace funcionalmente inmunocomprometidos, lo que les permite servir como huéspedes efectivos para xenoinjertos tumorales trasplantados22.

Se han desarrollado protocolos para el injerto tumoral en embriones de pez cebra y en adultos que han considerado una serie de variables diferentes 23,24,25,26,27. Estos han explorado numerosos sitios de depósito tumoral en el pez cebra, incluyendo inyecciones en la yema, el espacio perivitelino y el corazón y en diferentes etapas del desarrollo16,28. La temperatura ambiente de la acuicultura para los xenoinjertos de pez cebra también es importante, ya que la cría del pez cebra suele producirse a 28 °C, mientras que las células de los mamíferos crecen a 37 °C. En consecuencia, se debe emplear una temperatura de compromiso que sea tolerada por los peces pero que apoye el crecimiento tumoral, y 34 °C parece lograr ambos objetivos29. El análisis del comportamiento y la progresión de los tumores después de un xenotrasplante es otra área importante de interés, y esto implica el uso de una variedad de modalidades de imagen, así como el análisis de la supervivencia30. Una de las principales ventajas del modelo de pez cebra es la disponibilidad de un gran número de animales de estudio para proporcionar un inmenso poder estadístico a los estudios in vivo del comportamiento tumoral; Sin embargo, los enfoques anteriores han limitado severamente este potencial debido al requisito de tediosos procedimientos de montaje para las inyecciones.

Aquí, abordamos esta limitación a través del desarrollo de un método simple y rápido con el que organizar embriones que permite un alto rendimiento y monitoreo de la calidad de la inyección utilizando la línea transparente de pez cebra casper . Esto implica la inyección de xenoinjertos en el saco vitelino de los embriones de pez cebra casper a los 2 días después de la fertilización (dpf). Observamos la supervivencia de los embriones después del xenotrasplante como parte del análisis del comportamiento tumoral. Además, mostramos la evaluación de la carga de enfermedad tras el xenotrasplante mediante la realización de suspensiones unicelulares y el análisis mediante citometría de flujo (Figura 1).

Protocolo

El mantenimiento, la alimentación y la cría del pez cebra se realizaron en condiciones acuícolas estándar a 28,5 °C, como se describe31. Todos los experimentos relacionados con el pez cebra se realizaron a esta temperatura; sin embargo, después del xenotrasplante, los animales se cultivaron a 34 °C durante la duración del experimento, de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

1. Cría (3 días antes de la inyección)

  1. Proporcionar alimento seco (alimento adicional; 5-6 gránulos por pez) a las parejas de peces una semana antes de la reproducción para maximizar la salud del animal y aumentar el número de embriones producidos por las parejas reproductoras.
  2. La noche anterior a la recolección de embriones, coloque los animales de cría en tanques de cría con un divisor que separe a los peces machos y hembras, utilizando apareamientos de harén de 2 hembras para cada macho.
    NOTA: Para experimentos con 4 brazos de 100 animales por brazo, emplee 20 parejas reproductoras por experimento. Para determinar el número de parejas reproductoras necesarias, una buena estimación es de 50 embriones por pareja reproductora de casper . Otra opción es emplear una cepa de pez cebra más robusta y pigmentada y tratarla con 1-fenil-2-tiourea (PTU) para prevenir la pigmentación31. En la práctica, el experimento debe escalarse de tal manera que uno tenga suficientes embriones para inyectar el doble del número deseado 1 día después de la inyección (ppp).

2. Recogida de embriones (2 días antes de la inyección)

  1. A la mañana siguiente, retire los divisores, permitiendo que los peces se reproduzcan.
  2. Visualice los embriones en los tanques 20 minutos (min) después de retirar los divisores.
  3. Recoja los embriones usando un tamiz en una placa de Petri de 90 mm que contenga agua de embriones hecha como se describe en El libro del pez cebra31.
    1. Para hacer agua de embrión, agregue 1,5 mL de sales de caldo a 1 L de agua destilada y azul de metileno al 0,1% final. Prepare la solución salina disolviendo 40 g de sales marinas (Tabla de Materiales) en 1 L de agua destilada. La composición iónica del agua embrionaria es K+ (0,68 mg/L), Cl- (31,86 mg/L), Na+ (17,77 mg/L), SO4− (4,47 mg/L), Mg2+ (2,14 mg/L) y Ca2+ (0,68 mg/L).
  4. Deje que el pez cebra se reproduzca durante una hora más y recoja los embriones resultantes.
  5. Agrupa los embriones para el experimento.
  6. Por la noche, retire todos los embriones no fertilizados o muertos, que son reconocibles por su morfología anormal, y proporcione agua fresca para el embrión.

3. Mantenimiento del embrión y preparación de la herramienta para las inyecciones (1 día antes de la inyección)

  1. A la mañana siguiente, retire los embriones muertos adicionales y proporcione agua fresca para embriones.
  2. Prepare una placa de agarosa calentando agarosa al 1,5% en agua de embrión y vierta la mezcla calentada en una placa de Petri de 90 mm. Un plato de 90 mm requiere 30-35 mL de la mezcla.
  3. Extraiga las agujas sin filamento de los capilares de vidrio (borosilicato) con el extractor de agujas. Las agujas se tiran (bajo presión de calor) produciendo un extremo cerrado; Córtelos con pinzas para generar un orificio óptimo. Evaluar la idoneidad del orificio de la aguja determinando el volumen de líquido desplazado por unidad de tiempo (ver más abajo, sección 6.3).
    NOTA: Los capilares de vidrio se pueden comprar con o sin filamentos centrales. Los capilares que carecen de filamentos centrales son los preferidos para las inyecciones celulares.
  4. Coloque las agujas en una placa de Petri cubierta de 90 mm en las ranuras hechas con arcilla (arcilla para modelar niños) hasta su uso (Figura 2A).

4. Preparación y marcaje de células leucémicas con CM-Dil (día de la inyección)

  1. Mantener las células a trasplantar en condiciones óptimas para su crecimiento. Las células leucémicas murinas empleadas aquí fueron suficientes (M82; Rpl22+/+) o deficiente (M109; Rpl22-/-) para la proteína ribosómica Rpl22, que funciona como supresor tumoral32.
  2. Células de pellets en un tubo cónico de 50 mL. Cuente, luego centrifugue a 300 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
    NOTA: El número de células necesarias dependerá del alcance y las condiciones experimentales, pero 1 x 106 células es un buen punto de partida.
  3. Realizar la tinción CM-Dil
    NOTA: La tinción con CM-Dil permite el seguimiento del bolo de inyección.
    1. Prepare una solución madre de CM-Dil resuspendiendo un vial de 50 μg de CM-Dil en 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO; 1 mg/mL o ~1 mM final).
    2. Producir una solución de trabajo diluyendo el stock (4,8 μL de tinción/mL) en suero fetal bovino (FBS) al 1% / solución salina balanceada de Hank (HBSS) que contenga cualquier suplemento de apoyo necesario para las células que se van a utilizar.
  4. Vuelva a suspender las células a 1 x 106/100 μL en la solución de trabajo de la tinción.
  5. Incubar a 37 °C durante 10 min.
    NOTA: Las condiciones de tinción deben estar optimizadas para las células empleadas (tiempo, etcétera). Las células utilizadas aquí requirieron dos incubaciones distintas de 10 minutos a diferentes temperaturas para lograr una tinción óptima.
  6. Lavar con 10 mL de 1x HBSS a temperatura ambiente (RT).
  7. Celdas de pellets (centrifugación a 300 x g durante 5 min a RT), decantar el sobrenadante, luego resuspender con 10 mL de HBSS y repetir lo mismo para un segundo lavado.
  8. Vuelva a suspender las células tumorales teñidas a 40.000 células/μL al 1% de FBS/PBS y cualquier suplemento de apoyo necesario y mantenga la suspensión celular a 34 °C hasta la inyección.
    NOTA: Se requirieron suplementos de apoyo para el mantenimiento de las líneas celulares utilizadas en este estudio (p. ej., 1% de FBS y citocinas). Es posible que los suplementos y los xenotrasplantes deban adaptarse a las líneas celulares particulares en estudio. En este caso, se seleccionó PBS en lugar de medios para evitar cualquier toxicidad potencial en la yema.

5. Decorionación

  1. Decorionar los embriones de pez cebra casper manualmente a 2 dpf utilizando jeringas de inyección de insulina con un aumento de 2x en un microscopio óptico. Perfore el corion con una aguja mientras usa la otra aguja para inmovilizar el corion.
    NOTA: No se recomienda el uso de pronase para la descorionación porque a veces resulta en una disminución de la salud del embrión. Es preferible descorionar los embriones a 2 dpf porque es más fácil y los embriones son menos frágiles que en momentos anteriores (1 dpf).
  2. Durante la descorionación, tenga cuidado de no tocar los embriones con las agujas. Tocar o dañar la yema de los embriones por contacto inadvertido con las agujas podría causar la muerte.
  3. Retire los coriones despojados cambiando el agua del embrión.

6. Configuración del microinyector y la aguja

  1. Encienda el microinyector y la bomba y configure las condiciones adecuadas para las microinyecciones de células. Una presión de inyección de 9-11 psi y un tiempo de inyección de 0,5 segundos (s) son un buen punto de partida para cortar la aguja y ajustar el orificio.
  2. Cargue la suspensión de la línea celular tumoral (~ 5 μL) en la microaguja con cuidado en una sola pasada, evitando la formación de burbujas de aire, que interrumpirán el flujo de células dentro de la aguja.
  3. Corte el extremo de la aguja con pinzas (número 5 de Dumont) para producir un orificio que admita la expulsión de 10-15 nanolitros (nL) de suspensión celular por 0,2-0,3 s.
    NOTA: El cálculo anterior del volumen de nL se realiza utilizando capilares de calibración, donde 1 mm = 30 nL. En resumen, ajuste el tiempo a 0,5 s y, después de cada clip de la aguja, presione inyectar y recoja el volumen en el capilar de calibración. A continuación, se mide la longitud del volumen recogido utilizando la escala bajo un microscopio, y el clipaje de la aguja se detiene cuando se inyectan 30 nL en 0,5 s. A continuación, establezca el tiempo de las inyecciones en 0,2-0,3 s. (inyectando ~10-15 nL de células)

7. Preparación embrionaria para inyección

  1. Seleccione embriones sanos bajo el microscopio, seleccionando aquellos con anomalías en el desarrollo, como edema cardíaco o un tronco corto o curvo.
  2. Anestesiar los embriones con metanosulfonato de tricaína (MS-222; 0,16 g/L de agua embrionaria) durante 1 min en una placa de Petri de 90 mm.
  3. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para recoger los embriones. Coloque de 10 a 15 embriones en posición lateral en la placa de agarosa al 1,5% (Figura 2B-D).
  4. Elimine el exceso de agua con la pipeta Pasteur, dejando la cantidad mínima de agua embrionaria necesaria para mantener vivos los embriones.

8. Procedimiento de inyección

  1. Revise bajo el microscopio óptico para asegurarse de que las células se hayan acumulado en la punta de la aguja.
  2. Inyectar los embriones con la aguja calibrada durante 0,2-0,3 s (con 10-15 nL correspondientes a 400-600 células) en la yema de los embriones.
  3. Repita la inyección para todos los embriones, luego recójalos en agua fresca para embriones.
    NOTA: Debido a que las células tienden a acumularse en la punta de la aguja, la punta deberá recortarse ligeramente cada 15-20 inyecciones. Esto también requerirá restablecer la presión y el tiempo con cada recorte para asegurarse de que se inyecte un volumen similar.
  4. Para asegurarse de que la comparación del comportamiento de dos conjuntos distintos de células transferidas es válida, supervise el bolo de células transferidas. Para ello, clasifique los embriones en función de la tinción CM-Dil (en el canal RFP) 1 hora después de la inyección (hpi), separando aquellos con una tinción óptima ("bolo bueno") de aquellos con una tinción inferior ("bolo inferior"; Figura 3, flecha amarilla).
  5. Deseche los embriones con un bolo inferior o utilícelos para evaluar el impacto de una dosis celular diferente en la progresión de la enfermedad.
  6. Retire los embriones muertos al final del día, ya que su muerte está relacionada con un traumatismo por inyección en lugar de con el crecimiento del tumor. Retire del análisis los embriones que no retienen células, ya que es probable que las células se hayan escapado del lugar de la inyección.
  7. Mantener los embriones inyectados a 34 °C durante todo el experimento en una placa de 90 mm con ~60 embriones por placa.
    NOTA: Después de 5 dpf, la yema habrá sido consumida por los embriones en crecimiento, por lo que los embriones deben recibir alimento con paramecio durante la duración del experimento. Para garantizar una nutrición adecuada, los embriones deben administrarse diariamente a los embriones de 6 dpf (4 dpi) a 9 dpf (7 dpi). Los paramecios se propagan por cultivo en frascos en condiciones óptimas de nutrición y temperatura, como se describe31.

9. Análisis de supervivencia

  1. Controle los embriones durante los próximos 7 ppp, cambiando el agua del embrión diariamente. Los cambios de agua pueden reducirse a días alternos por conveniencia si el estudio involucra tratamiento con medicamentos.
  2. Verifique la salud del embrión y califique la muerte durante la duración del análisis.
    NOTA: La duración del experimento fue de 7 días, pero puede ser más corta o más larga dependiendo de la agresividad del tumor xenotrasplantado.
  3. Utilice la fluorescencia CM-Dil para evaluar la carga de la enfermedad (Figura 4A) y determinar el impacto de las alteraciones genéticas o los tratamientos farmacológicos en la supervivencia utilizando el análisis de Kaplan Meier y representados gráficamente (p. ej., con GraphPad Prism; Figura 4B) Artículo 33.

10. Suspensión unicelular de embriones para análisis de citometría de flujo

NOTA: La carga de enfermedad puede evaluarse mediante análisis de citometría de flujo después de un xenotrasplante; Sin embargo, para ello es necesario un marcado indeleble de las células tumorales. La proteína fluorescente roja (RFP) administrada retroviral o lentiviralmente o mCherry es eficaz ya que proporciona una buena señal sobre la autofluorescencia de las células de pez cebra, lo que oscurece la señal de la proteína fluorescente verde.

  1. Aislar los embriones en la etapa de dpi de elección. Aquí se muestran 5 ppp (Figura 5).
  2. Reúna de 30 a 40 embriones por condición como punto de partida, pero el número de embriones puede diferir según la etapa y la agresividad de las células trasplantadas. Anestesiar los embriones como se ha descrito anteriormente.
    NOTA: Los embriones pueden subdividirse como réplicas para proporcionar significación estadística, como se muestra aquí (Figura 5B).
  3. Transfiera los embriones a tubos de centrífuga de 1,5 ml.
  4. Utilice 100 μL de solución de Ringer sin calcio (receta31) por muestra para disolver la yema, ya que el bajo contenido de calcio ablanda los tejidos embrionarios, lo que permite una disociación más eficaz de los tejidos.
  5. Pipetear hacia arriba y hacia abajo de forma intermitente durante 5 minutos para extraer la yema con una punta de pipeta de 200 μL.
  6. Precalentar tripsina/PBS al 0,05% (sin indicador de rojo fenol) a 29 °C y complementar con 27 μL de colagenasa IV (100 mg/mL) por mL de solución de tripsina. Se necesitará un volumen de 1 mL de solución para cada muestra de embriones.
  7. Añadir 1 mL de la solución de tripsina/colagenasa a cada muestra de embriones desviteliados e incubar a 29 °C durante 30-35 min.
  8. Pipetear los embriones hacia arriba y hacia abajo en esta solución con una punta de pipeta de 1 ml cada 5 minutos hasta que la estructura de los embriones (columna vertebral) ya no sea visible.
  9. Detenga la reacción con 200 μL de FBS.
  10. Mezclar bien e incubar a 29 °C durante 5 minutos más para asegurar la inactivación completa de la tripsina.
    NOTA: Se emplea una temperatura de 29 °C para el protocolo de disociación de tejidos para prevenir la muerte inducida por choque térmico de las células de pez cebra, que ocurre a 37 °C; sin embargo, si no se requiere la conservación de las células del pez cebra, la digestión se puede realizar a 37 °C.
  11. Granular la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  12. Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS a 4 °C y pellet como se indicó anteriormente.
  13. Repita el lavado, luego cuele las células a través de un colador de células de 70 μm.
  14. Granulice y proceda con la tinción para el análisis de citometría de flujo.
    NOTA: Si se requiere el cultivo de células primarias de pez cebra, lavar dos veces más con PBS a 4 °C y volver a suspender en medio L15 (con antibióticos y FBS al 10%).

11. Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS): Tinción y clasificación de células xenotrasplantadas

  1. Vuelva a suspender la suspensión celular en un medio de tinción (HBSS con 1% de FBS) y gránule a 300 x g durante 5 min.
  2. Vuelva a suspender el pellet celular en el medio de tinción con un anticuerpo reactivo con las células trasplantadas para proporcionar un segundo marcador (además de RFP o mCherry) con el que distinguir las células trasplantadas de las células de pez cebra. En este caso, se emplearon 50 μL de CD45 anti-ratón (APC-CD45) por muestra en una dilución de 1:50 (Figura 5).
  3. Incubar durante 20 min a 4 °C antes de lavar como se ha indicado anteriormente con 1 mL del medio de tinción para eliminar el anticuerpo no unido.
  4. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en 200 μL de medio de tinción que contenga el colorante vital Helix NP Blue (1 μM), que permitirá la discriminación de vivos/muertos.
  5. Transfiera la mezcla de células a tubos de policarbonato de fondo redondo de 5 ml para el análisis de citometría de flujo.
    NOTA: La tinción de un control de células tumorales en paralelo proporciona claridad para dibujar puertas durante el análisis de citometría de flujo.

12. Citometría de flujo

  1. Encienda el citómetro de flujo que está disponible con un caudal bajo (500 eventos por segundo o menos) para establecer los parámetros.
  2. Utilice el control de células tumorales (las mismas células que se usan para los xenotrasplantes) para establecer el voltaje de los canales FSC (dispersión directa), SSC (dispersión lateral), BV421/CasB (viabilidad), CE-594 (mCherry) y APC (CD45.2).
    NOTA: Se requerirán muestras teñidas individualmente para establecer los ajustes de compensación que eliminen la superposición de fluorocromo entre tinciones distintas.
  3. Utilice la muestra de embrión no inyectado para establecer entornos que se adapten tanto a las células trasplantadas como a las de pez cebra.
  4. Aumente el caudal a 8000 eventos por segundo y registre 1 millón de eventos para cada muestra.
  5. Analice los datos resultantes utilizando un software de análisis adecuado, seleccionando primero los singletes mediante el trazado de FSC-H v/s FSC-A (altura v/s área), seguido de un gráfico para seleccionar las células viables. El software FlowJo es ampliamente utilizado para este tipo de análisis.
  6. Utilizando el control de células tumorales, dibuje una puerta alrededor de las células trasplantadas por FSC-A v/s SSC-A, luego use las tinciones indicadoras, en este caso, CD45 y mCherry (Figura 5B).
    NOTA: La puerta de tamaño seleccionada para el tumor también contendrá células de pez cebra, lo que proporciona la base para la normalización y la determinación de la carga de la enfermedad.
  7. Analice las muestras de embriones utilizando la misma configuración de puerta que la anterior. El gráfico final de la tinción tumoral y el indicador de proteína fluorescente proporcionará una medida de la carga de enfermedad (Figura 5C).
    NOTA: Aquí, la diferencia en la carga de enfermedad se trazó para los embriones que recibieron un buen bolo de células inyectadas frente a los que recibieron un bolo inferior.
  8. Si es necesario, clasifique las células tumorales de los embriones mediante citometría de flujo para el análisis molecular posterior.

Resultados

Xenotrasplante
En la Figura 1 se muestra una visión completa de todo el experimento y el análisis, que abarca desde la producción de embriones hasta la evaluación de la progresión de la enfermedad mediante el análisis de la supervivencia y la carga de enfermedad mediante citometría de flujo. Este enfoque aporta varias mejoras que mejoran la reproducibilidad y la escalabilidad de los xenotrasplantes, además de añadir una nueva forma de evaluar la carga de la enfermedad. El éxito de estos experimentos depende en gran medida de la salud de las células trasplantadas, ya que las células que no están sanas y están en fase logarítmica no se propagan tras el trasplante. La duración de la sesión de inyección también es un parámetro crítico. Después de preparar las células tumorales, es fundamental completar la inyección en el pez cebra dentro de las 3-4 horas. El enfoque utilizado en este estudio permite inyectar un mayor número de embriones durante este período de tiempo mediante la simple modificación de colocarlos directamente de lado en una placa de agarosa e inyectarlos en la yema (Figura 2C, D). Además, es imperativo que se seleccione el orificio óptimo de la aguja para que se inyecten suficientes células (400-600 células) pero que el orificio no sea tan grande como para dañar los embriones. Otra consideración es la presión de inyección. Encontramos que presiones superiores a 12-13 psi alteran la yema de los embriones, causando la muerte. Por último, otra variabilidad inherente a este procedimiento es la consistencia de la inyección. Las células que se van a inyectar se depositan en el extremo de la aguja de inyección, lo que dificulta el control preciso en el bolo de inyección. Cuando las células son xenotrasplantadas, todos los embriones tienen el potencial de recibir el mismo bolo de inyección, pero en la práctica, no lo hacen (Figura 3). El número de células transferidas puede diferir ampliamente según el comportamiento de las células tumorales (por ejemplo, aglomeración) y el nivel de habilidad del operador. Hemos abordado esta incertidumbre a través de la tinción CM-Dil/etiquetado mCherry, que permite la categorización posterior a la inyección de los animales que han recibido un bolo celular apropiado y consistente, así como de aquellos que reciben un bolo inferior. La tinción con CM-Dil, pero de forma más eficaz con una proteína fluorescente, tiene la ventaja añadida de facilitar el seguimiento de la progresión de la enfermedad, ya sea por microscopía o por citometría de flujo (Figura 4 y Figura 5).

Análisis del comportamiento tumoral
La progresión tumoral se puede monitorizar fácilmente mediante microscopía de fluorescencia simple centrada en la RFP (Figura 4A). Del mismo modo, el monitoreo tradicional de la supervivencia se puede realizar mediante análisis de Kaplan-Meier (Log-rank y prueba de Wilcoxon) (Figura 4B). Sorprendentemente, en contraste con los estudios de xenotrasplante basados en ratones, en los que normalmente hay entre 8 y 10 animales por grupo de estudio, utilizando el método del pez cebra descrito aquí, no es difícil lograr grupos de estudio con más de 60 animales cada uno (Figura 4B). Esto mejora notablemente el poder de resolución de los estudios in vivo. Por último, hemos implementado otro enfoque para el análisis de la carga de enfermedad mediante citometría de flujo. Esto implica la interrupción de un número equivalente de embriones y el análisis del contenido de células tumorales de la suspensión unicelular resultante mediante citometría de flujo. Mediante la combinación de un marcador de superficie celular específico del tumor con el indicador de proteína fluorescente, los ratones/células humanas xenotrasplantadas pueden identificarse con confianza mediante citometría de flujo como enfoque para evaluar la carga de la enfermedad (Figura 5). Para este propósito, las proteínas fluorescentes rojas son superiores, ya que las proteínas fluorescentes verdes no lograron proporcionar una señal sobre la autofluorescencia de las células de pez cebra huésped. En este caso, se empleó mCherry para el marcaje y el seguimiento de células durante el curso del xenotrasplante para el análisis de FACS junto con CD45. El doble marcaje nos permitió medir las diferencias en la carga tumoral entre la inoculación en bolo buena frente a la incorrecta (Figura 5B,C).

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Figura 1: Esquema de todos los procedimientos de xenotrasplante y análisis post-inyección. (A) Se esquematiza la configuración de la cría, la recolección de embriones y la morfología 2 días después de la fertilización (dpf). (B) Preparación, tinción e inyecciones de células leucémicas para xenotrasplante en la yema de embriones de pez cebra. (C) Análisis post-xenotrasplante, incluyendo supervivencia y citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes representativas de las herramientas utilizadas para las inyecciones. (A) Agujas extraídas en una placa de Petri. (B) La placa de agarosa para la estadificación de los embriones. (C,D) Una placa que muestra los embriones escalonados (diagrama representativo en el panel C y los embriones reales (encerrados en rojo) en el panel D) para inyecciones en la placa de carga embrionaria. El recuadro en la esquina inferior derecha del panel D muestra una vista de mayor aumento de los embriones en etapas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes representativas de embriones xenotrasplantados. Se muestran imágenes de campo claro e inmunofluorescentes de células positivas para la tinción CM-Dil (rojo) en la yema de los embriones de casper a 1 ppp (imagen de nidada). Los embriones con un bolo inferior se indican con una flecha amarilla, mientras que los que tienen una morfología alterada se indican con un asterisco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Evaluación de la progresión de la enfermedad mediante imágenes de fluorescencia y análisis de supervivencia. (A) Imagen representativa de embriones xenotrasplantados a 4 ppp y 7 ppp. (B) El diagrama de Kaplan Meier que muestra el análisis de supervivencia de embriones con dos líneas de leucemia genéticamente distintas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Análisis citométrico de flujo de la carga de enfermedad en pez cebra xenotrasplantado. (A) Representación esquemática de la preparación de la suspensión celular y análisis de citometría de flujo. En resumen, los embriones a 4 dpi se desagregan en suspensiones unicelulares utilizando tripsina y colagenasa, seguidas de citometría de flujo. (B) Gráficos representativos para el análisis de citometría de flujo donde la imagen de la izquierda en cada panel es el gráfico FSC-A v/s SSC-A y la imagen de la derecha es CD45 v/s señales mCherry. (C) Gráfico de barras que muestra las estadísticas celulares para células xenotrasplantadas obtenidas de la parcela CD45 v/s mCherry para embriones no inyectados, buenos e inferiores (n = 45, 40 y 40 para cada réplica (n = 3); valor p * ≤ 0.05, calculado utilizando la prueba t no apareada con la corrección de Welch en GraphPad Prism 9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El xenotrasplante de pez cebra ha surgido como una alternativa rápida, robusta y rentable a los estudios con ratones12. Aunque se han descrito varios enfoques para el xenotrasplante de pez cebra, nuestra adaptación ha dado lugar a mejoras significativas. Además de estandarizar los parámetros en torno al procedimiento, estas mejoras se centran específicamente en acelerar la velocidad a la que se pueden realizar las inyecciones tumorales, lo que permite un aumento en el número de animales por grupo de estudio y el uso del etiquetado tumoral para monitorear la calidad de la inyección y el comportamiento posterior a la inyección.

Si bien las mejoras a este método descritas aquí tienen un gran potencial, la ejecución exitosa de esta estrategia requerirá un profesional capacitado y optimización para la aplicación específica. Se emplearon células leucémicas. En consecuencia, el uso de cánceres sólidos puede traer desafíos adicionales. Estos tumores pueden ser propensos a la agregación, lo que crearía variabilidad en la administración del bolo celular; sin embargo, incluso en tales circunstancias, el etiquetado RFP debe permitir un control de calidad adecuado posterior a la inyección del bolo. Esto es superior al marcaje GFP o a los tintes verdes, que están oscurecidos por la autofluorescencia. Finalmente, la estandarización descrita aquí de la mayoría de los parámetros que afectan el éxito (salud del embrión, temperatura de la acuicultura, orificio de la aguja, presión de inyección, etcétera) minimiza la variabilidad de este proceso.

Una consideración importante para los experimentos de xenotrasplante en pez cebra es el lugar de inyección. Aquí, hemos demostrado que las inyecciones en la yema son bastante fáciles en relación con otros sitios técnicamente más desafiantes, como el espacio perivitelina34, el conducto de Cuvier35 y la inyección intracardíaca (ventrículo cardíaco)36. La desventaja de la inyección de yema es que es un órgano vital para los embriones en crecimiento, por lo que se debe tener cuidado para garantizar que el diámetro y la presión de la aguja se controlen cuidadosamente para que el embrión no muera debido a un traumatismo por inyección. El enfoque descrito aquí mitiga esta preocupación al minimizar las lesiones y descartar cualquier lesión obvia o muerte por 1 ppp, ya que esos problemas no están relacionados con el crecimiento del tumor. La consideración final con respecto al sitio de inyección es que los distintos microambientes pueden tener una mayor o menor capacidad para apoyar la propagación de tumores xenotrasplantados. En consecuencia, tal vez las inyecciones de yema se puedan realizar primero antes de proceder a inyecciones ortotópicas más desafiantes. La principal ventaja de la inyección de yema es que no requiere una estadificación embrionaria precisa y, por lo tanto, permite una inyección más rápida de un mayor número de embriones, preservando así mejor su salud y aumentando el poder estadístico para resolver las diferencias en el comportamiento de las células tumorales trasplantadas.

El seguimiento de la progresión de la enfermedad después de la inyección se evalúa típicamente a través de los efectos sobre la supervivencia mediante el análisis de Kaplan-Meier37; Sin embargo, las pruebas de carga de enfermedad también pueden ser bastante informativas. En el caso de las células trasplantadas que permanecen en el lugar de la inyección, la carga tumoral puede cuantificarse utilizando diversos métodos de microscopía, siempre que el método de marcaje de las células tumorales no esté oscurecido por la autofluorescencia29. La tinción CM-Dil se resuelve fácilmente y no se ve afectada por la autofluorescencia, por lo que funciona bien para cuantificar la carga tumoral de las células localizadas. El desafío ocurre cuando las células tumorales no permanecen en el lugar de la inyección y se diseminan. En estos casos, la citometría de flujo, junto con el marcado genético indeleble mediante proteínas fluorescentes rojas, es una forma muy eficaz de controlar la carga de enfermedad en nidadas estandarizadas de embriones, ya que el tumor marcado puede analizarse mediante el uso de tinciones específicas de la especie diferentes a las células del pez cebra. Un defecto de CM-Dil es que se diluye por la división celular38. En consecuencia, la adaptación mediante el marcaje genético de los tumores mediante RFP o mCherry conlleva beneficios significativos. La expresión de mCherry, junto con un anticuerpo específico del tumor, permite la identificación segura de las células trasplantadas entre lo que puede ser un patrón complejo de señales de fondo proporcionadas por las células del pez cebra huésped.

En conjunto, el enfoque optimizado de xenotrasplante de pez cebra y el método de análisis utilizados en este estudio proporcionan una mejora sustancial a una plataforma experimental ya poderosa.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH R37AI110985 y P30CA006927, una asignación de la Mancomunidad de Pensilvania, la Sociedad de Leucemia y Linfoma y el Fondo Bishop. Este estudio también contó con el apoyo de las instalaciones principales de Fox Chase, incluidas las instalaciones de cultivo celular, citometría de flujo y animales de laboratorio. Agradecemos a la Dra. Jennifer Rhodes por mantener las instalaciones de pez cebra y microinyección en FCCC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-fenil 2-tiourea (PTU)SigmaP7629
colador de células de 70 micrasCorning CLS431751-50EA
Placa de Petri de 90 mmThermo Fisher ScientificS43565
AgarosaApex bioresearch20-102GP
APC APC anti-ratón CD45.2 AnticuerpoBiolegend109814
BD FACSymphony A5 Analizador de célulasBD BiosciencesBD FACSymphony A5
capilares de calibraciónSigma P1424-1PAK
Rastreador de células CM-dil tinteInvitrogenC7001
Collageanse IVGibco17104019
Pinzas Dumont número 55Herramientas de ciencia fina11255-20
FBSCorning 35-015-CV
Microscopio de fluorescenciaNikonmodelo SMZ1500
Capilares de vidrio (borosilicato)Instrumentos de precisión mundial1B100-4
HBSSCorning 21-023-CV
Helix NP BlueBiolegend425305
Instant Ocean Sal marinaInstant oceanSS15-10
Microscopio ópticoNikonmodelo SMZ1000
Azul de metilenoMicrocargador SigmaM9140-100G
(puntas largas para células laoding)eppendorf930001007
P1000 extractor de micropipetasSutter instrumentsmodelo P-97
PM 1000 microinyectorde células MicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
Metanosulfato de tricaína (Etilo 3-aminobenzoato metanosulfato)SigmaE10521-10G
Tripsina-EDTA (0,5%), sin fenol rojoGibco15400054
Dieta irradiada para adultos de pez cebra (alimento seco)Zeigler388763

Referencias

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