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Efecto antagónico de Jiawei Shengjiang San en un modelo de rata de nefropatía diabética: relacionado con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1

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DOI:

10.3791/66179

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10 de mayo de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Hebei University of Chinese Medicine

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En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe la farmacología de redes y las técnicas de acoplamiento molecular para explorar el mecanismo de acción de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) en el tratamiento de la nefropatía diabética.

Resumen

Nuestro objetivo fue profundizar en los mecanismos que subyacen a la acción de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) en el tratamiento de la nefropatía diabética y en el despliegue de la farmacología de red. Empleando técnicas de farmacología de redes y acoplamiento molecular, predijimos los componentes activos y las dianas de JWSJS y construimos una meticulosa red de "fármaco-componente-diana". Se utilizaron análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) para discernir las vías terapéuticas y los objetivos del JWSJS. Se implementó Autodock Vina 1.2.0 para la verificación del acoplamiento molecular, y se realizó una simulación de dinámica molecular de 100 ns para confirmar los resultados del acoplamiento, seguida de una verificación en animales in vivo . Los hallazgos revelaron que JWSJS compartía 227 objetivos que se cruzaban con la nefropatía diabética, construyendo una topología de red de interacción proteína-proteína. El análisis de enriquecimiento de KEGG denotó que JWSJS mitiga la nefropatía diabética mediante la modulación de los lípidos y la aterosclerosis, la vía de señalización PI3K-Akt, la apoptosis y la vía de señalización HIF-1, con la proteína quinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1), MAPK3, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la serina/treonina-proteína quinasa 1 (AKT1) identificados como objetivos colectivos de múltiples vías. El acoplamiento molecular afirmó que los componentes centrales de JWSJS (quercetina, ácido palmitoleico y luteolina) podrían estabilizar la conformación con tres objetivos fundamentales (MAPK1, MAPK3 y EGFR) a través de enlaces de hidrógeno. Los exámenes in vivo indicaron un aumento notable del peso corporal y reducciones de las proteínas séricas glicosiladas (GSP), el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), el trifosfato de uridina (UTP) y los niveles de glucosa en sangre en ayunas (FBG) debido al JWSJS. La microscopía electrónica junto con la hematoxilina y la eosina (HE) y la tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) destacaron el potencial de cada grupo de tratamiento para aliviar el daño renal en diversos grados, exhibiendo disminuciones variadas en p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX, e incrementos en la expresión de BCL-2 en los tejidos renales de las ratas tratadas. En conclusión, estos conocimientos sugieren que la eficacia protectora de JWSJS en la nefropatía diabética podría estar asociada con la supresión de la activación de la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 y el alivio de la apoptosis de las células renales.

Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica que afecta a múltiples sistemas y puede causar diversas complicaciones debido a la hiperglucemia continua, como la nefropatía diabética (DN), la retinopatía y la neuropatía1. La DN es una complicación grave de la DM, que representa alrededor del 30-50% de la enfermedad renal terminal (IRCT)2. Su manifestación clínica es la microalbuminuria, que puede progresar a IRCT caracterizada por aumento del volumen glomerular, hiperplasia del estroma mesangial y engrosamiento de la membrana basalglomerular 3. La patogenia de la DN es compleja y no ha sido completamente dilucidada. Los métodos clínicos, como la disminución de la glucosa en sangre, la regulación de la presión arterial y la reducción de la proteinuria, se utilizan principalmente para retrasar su progreso, pero el efecto es general.

En la actualidad, no se ha encontrado ningún fármaco específico para tratar la DN4. Sin embargo, durante siglos, las hierbas medicinales chinas han sido ampliamente utilizadas en el tratamiento de la DM y sus complicaciones5 y han mejorado los síntomas clínicos de los pacientes y retrasado la progresión de la enfermedad. Debido a las ventajas de los efectos multicomponente, multiobjetivo y multivía, se espera que las hierbas medicinales chinas sean una fuente de fármaco innovadora para el tratamiento de la DN6.

"Shengjiang san" se originó a partir del "Wanbing Huichun" del médico de la dinastía Ming Gong Tingxian. El libro "Neifu Xianfang" describe el uso de Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma y Radix Rhei et Rhizome. En base a esto, después de agregar Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba y Smilacis Glabrae Rhixoma, ejerce la función de shengjiang san de aumentar la lucidez, disminuir la turbidez, liberar el "calor" estancado y armonizar el "qi" y la sangre 7,8. También aumenta el efecto de fortalecer el bazo y tonificar los riñones. Su eficacia es consistente con la patogenia del "qi" de DN para subir y bajar de orden debido a la deficiencia de "energía vital", sequedad excesiva y "calor", y estancamiento del "calor" causado por un triple energizante 7,8.

Estudios clínicos previos han demostrado que las hierbas medicinales chinas se han utilizado para tratar la DM y sus complicaciones, y se ha demostrado que el jiawei shengjiang san (JWSJS) regula la glucosa y los lípidos en sangre, reduce la proteinuria y mejora significativamente la eficacia clínica de los pacientes con DN temprano7. La capacidad de JWSJS para reducir los niveles de proteína urinaria y glucosa en sangre en ratas DN ha sido confirmada por estudios previos. Esto probablemente sucede mediante la inhibición de las vías de señalización TXNIP/NLRP3 y RIP1/RIP3/MLKL, reduciendo la piroptosis de podocitos y previniendo la apoptosis necrótica en los tejidos renales de ratas DN, logrando así la protección renal9. El JWSJS puede aumentar la expresión de la nefrina y la proteína podocina y reducir la lesión de los podocitos en ratas DN, lo que sugiere que el JWSJS tiene un efecto inhibidor sobre la lesión de los podocitos. El JWSJS tiene un cierto efecto anti-DN con buenos perfiles de seguridad, pero hay poca investigación al respecto, y este trabajo se centra principalmente en la piroptosis y la apoptosis necrótica. La literatura no es lo suficientemente profunda ni sistemática10. Nuestros hallazgos previos han confirmado que el JWSJS puede reducir la proteinuria y aliviar el daño renal en ratas DN7. Sin embargo, existen pocos estudios sobre el mecanismo del JWSJS para el tratamiento de la DN, y estos carecen de profundidad y sistematización. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo analizar las sustancias moleculares y los mecanismos de acción de JWSJS para el tratamiento de la DN utilizando farmacología en red y proporcionar una base sólida para futuras investigaciones.

La farmacología de redes es un método emergente para estudiar el mecanismo de acción de los fármacos, incluyendo la quimioinformática, la biología de redes, la bioinformática y la farmacología11,12. El diseño de la investigación en farmacología en red es bastante similar al concepto holístico de la medicina tradicional china13,14, y es un método importante para estudiar el mecanismo de las hierbas medicinales chinas. El acoplamiento molecular puede estudiar las interacciones entre moléculas y predecir sus patrones de unión y afinidad. El acoplamiento molecular se ha convertido en una técnica crítica en el campo de la investigación farmacológica asistida por ordenador15. Por lo tanto, este estudio construyó una red de interacción JWSJS-DN-diana a través de métodos de farmacología de red y acoplamiento molecular que ofrece una base teórica y confiable para una mayor exploración del tratamiento de DN con JWSJS.

Protocolo

Todos los animales fueron mantenidos y utilizados de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,8ª Edición, y fueron reportados como se recomienda en las guías ARRIVE16,17. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de China para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Hebei (DWLL2019030).

1. Ingredientes activos de JWSJS y colección de objetivos

  1. Ingrese la composición medicinal JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome y Curcumaelongae Rhizoma) en la base de datos de la base de datos de la plataforma de análisis y farmacología de los sistemas de medicina tradicional china (TCMSP)18 para recuperar todos los componentes químicos.  De acuerdo con la pantalla de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME), la biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y las propiedades similares a los medicamentos (DL) ≥ 0,18 ingredientes químicos19,20.
  2. Utilice la base de datos TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, versión 2.3) para recuperar los objetivos correspondientes de ingredientes químicos.
  3. Obtener los ingredientes activos de Bombyx Batryticatus y Cicadae Periostracum mediante la búsqueda en las bases de datos de Medicina Tradicional China y Composición Química21.
  4. Para mayor credibilidad experimental, seleccione compuestos con números de servicio de resúmenes químicos (CAS) para este estudio. A continuación, descargue los diagramas de estructura 2D (formato .sdf) de los ingredientes activos de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, actualizados en 2021)22.
  5. Utilice SwissADME (www.swissadme.ch, actualizado en 2021)23para detectar los componentes con alta absorción gastrointestinal (GI) como similitud farmacológica (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) cuyos ≥ 2 ítems fueron "Sí". Esto condujo a los componentes activos de Bombyx Batryticatus y Cicadae Periostracum.
  6. Importarlos a la base de datos TCMSP para la predicción de proteínas diana (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Versión. 2.3)18.
  7. Estandarizar los objetivos en la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org, actualizada en 2021) con el estado establecido como Revisado y las especies establecidas como Humano24.

2. Colección de destino DN correspondiente

  1. Búsqueda de nefropatía diabética a través de GeneCards (https://www.genecards.org/, Versión. 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, actualizado en 2021)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, actualizado en 2021)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, actualizado en 2021)28 y bases de datos de DrugBank (https://www.drugbank.ca/, actualizado en 2021)29. Obtenga los objetivos de DN después de combinar y desduplicar.
  2. Cribado de objetivos comunes de JWSJS y DN y construcción de redes
    1. Filtre los objetivos comunes de JWSJS y DN utilizando el software R 4.2.0 y dibuje diagramas de Venn. Importe los ingredientes activos y los objetivos potenciales de JWSJS en el software Cytoscape 3.8.030 para crear un diagrama de red Medicamento-Ingrediente-Objetivo que visualice la conexión entre medicamentos, ingredientes, objetivos y enfermedades.
    2. Deje que el tamaño del nodo refleje el tamaño del valor de grado, donde un valor de grado más alto indica que el nodo es más importante en la red.
  3. Construcción de la red de interacción proteína-proteína de PPI y cribado de dianas principales
    1. Analice los genes que se cruzan utilizando la plataforma en línea STRING (Versión:11.5) para construir una red de interacción proteína-proteína (PPI)31. Construya la red utilizando un modo de análisis de proteínas múltiples , establezca la especie en Homo sapiens y establezca la puntuación de interacción mínima requerida en >0,930.
    2. Utilice Cytoscape 3.8.0 para analizar la red topológicamente, calcular la centralidad de intermediación (BC), la centralidad de cercanía (CC), la centralidad de grado (DC), la centralidad del vector propio (EC), el método basado en la conectividad (LAC) promedio local y los valores de centralidad de la red (NC) para cada nodo, y descartar los seis nodos con todos los valores mayores que la mediana32. Repita este proceso varias veces para identificar los objetivos principales de JWSJS para la terapia de DN.
  4. Análisis funcionales de GO y análisis de enriquecimiento de la vía KEGG
    1. Realizar análisis de enriquecimiento de GO y KEGG para identificar los procesos biológicos, las funciones moleculares, los componentes celulares y las vías asociadas con los objetivos comunes de JWSJS y DN.
    2. Utilice la org. Hs.eg.db paquete para obtener los ID de los destinos de intersección y utilizar clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot y ggplot2 para análisis de enriquecimiento33.
    3. Evalúe el análisis de enriquecimiento funcional de GO en los 10 principales resultados biológicos con un valor P corregido < 0,05, y seleccione las 30 vías principales con el mayor enriquecimiento para el análisis KEGG.

3. Acoplamiento molecular

  1. Utilice el software AutoDock Vina para realizar el acoplamiento molecular entre los componentes principales de JWSJS y los objetivos principales para la terapia DN34.
  2. Busque en la base de datos de PubChem para obtener el archivo sdf de la estructura 2D de los componentes principales de JWSJS. Utilice el software ChemBio 3D Ultra14.0 para generar y optimizar su estructura 3D, guárdelo en formato mol2 y utilícelo como archivo de ligando.
  3. Busque y descargue el formato pdb de la estructura 3D de los objetivos principales de la base de datos del Banco de Datos de Proteínas (PDB) del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Utilice el software Pymol 2.4.0 para eliminar las moléculas de agua y los ligandos de la estructura de la proteína, guardarlo en formato pdb y utilizarlo como archivo receptor.
  4. Importe el archivo pdb del receptor en el software AutoDockTools 1.5.7 para la hidrogenación, convierta tanto la proteína receptora como el ligando de molécula pequeña en formato pdbqt, establezca el bolsillo activo para la proteína receptora con el coeficiente de espaciado establecido en 1.
  5. Utilice Autodock vina 1.2.0 para el acoplamiento molecular y calcule la energía de enlace; si la afinidad < 0, considere que la molécula se une espontáneamente con la proteína, un mayor valor absoluto de afinidad indica una unión más estable entre ellas. Por último, visualice los resultados del acoplamiento utilizando el software Pymol 2.3.0 y LigPlot 2.2.5.

4. Simulación dinámica molecular

  1. Para realizar simulaciones de MD utilizando el software Desmond, siga estos pasos:
    1. Emplear la versión académica 2019-1 del software Desmond para evaluar la estabilidad y flexibilidad de las interacciones proteína-ligando.
    2. Llevar a cabo investigaciones de dinámica molecular (MD) en un trío de los complejos de ligandos más prometedores derivados de estudios de acoplamiento. Realizar simulaciones en un entorno acuoso SPC con 0,15 M de NaCl, replicando las condiciones iónicas fisiológicas. La caja de simulación está diseñada para garantizar que el soluto permanezca al menos a 10 Å de distancia de sus límites. Se introducen contraiones para neutralizar la carga eléctrica del sistema. Además, se aplican condiciones de contorno periódicas, regidas por los parámetros del campo de fuerza OPLS 2005.
    3. Inicie una fase de minimización de energía para 100 ps utilizando los parámetros predeterminados de Desmond.
    4. Garantice la estabilización de la temperatura y la presión a 26,85 °C (300 K) y 1,01325 bar a través de la cadena Nosé-Hoover y las metodologías Martyna-Tobias-Klein en todos los sistemas MD de producción. La simulación de dinámica molecular se ejecuta con un paso de tiempo de 2 fs para una duración total de 100 ns, registrando las coordenadas atómicas cada 100 ps.
    5. Abra el módulo de diagrama de interacciones de simulación (SID). Cargue los archivos de datos de resultados de la simulación en el módulo.
    6. Seleccione el tipo de análisis deseado de las opciones disponibles en el módulo (por ejemplo, desviación cuadrática media [RMSD], fluctuación cuadrática media [RMSF], análisis de enlaces de hidrógeno, etc.). Especifique los parámetros adicionales necesarios para el tipo de análisis elegido.
    7. Ejecute el análisis haciendo clic en el botón Analizar o Iniciar.
    8. Una vez completado el análisis, visualice e interprete los resultados dentro de la interfaz del módulo SID. Exporte los resultados si es necesario para su uso o presentación posterior.

5. Validación de experimentos con animales

  1. Animales y diseño experimental
    NOTA: Este estudio involucró a 75 ratas macho Sprague-Dawley, que se obtuvieron de una instalación de producción animal de grado SPF y tenían 8 semanas de edad con una masa corporal de 150 g ± 20 g (número de certificado de producción animal SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Aloje a las ratas en un laboratorio de animales con nivel de SPF y divídalas aleatoriamente en grupos normales y modelo después de 1 semana de alimentación adaptativa. Proporcionar al grupo normal una dieta normal y al grupo modelo una dieta alta en azúcar y grasas. Después de 4 semanas, ayune las ratas pero no las prive de agua durante 12 h.
    2. Inyectar al grupo modelo una inyección intraperitoneal de estreptozotocina (STZ; 35 mg·kg-1). Después de 72 h, pruebe los niveles de azúcar en sangre a través de una muestra de sangre de las venas de cola. Si el nivel de glucosa en sangre en ayunas es de ≥16,7 mmol· L-1, lo confirman como un modelo diabético exitoso.
    3. Confirmar el éxito del modelo de DN mediante la observación de cambios histopatológicos en el riñón de rata.
    4. Divida aleatoriamente los modelos replicados con éxito en el grupo modelo, que recibió JWSJS a 4,37 g/kg, 8,73 g/kg y 17,46 g/kg (equivalente a 3,2, 6,3 y 12,6 veces la dosis clínica equivalente), así como un grupo de irbesartán (0,014 g/kg). Cada grupo estaba formado por 10 ratas. Administre todos los medicamentos por sonda nasogástrica oral una vez al día. Mantenga este régimen de dosificación de manera constante durante 4 semanas.
    5. Anestesiar a las ratas con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg) y confirmar la anestesia adecuada mediante la pérdida del reflejo de retirada del pedal. Recolectar muestras de sangre de la aorta abdominal antes de la eutanasia.
    6. Recoger los riñones después de sacrificar a las ratas mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 150 mg/kg.
      NOTA: Los animales fueron sacrificados humanitariamente, siguiendo las pautas (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) más actualizadas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) para la eutanasia.
  2. Análisis histológicos renales
    NOTA: Los tejidos renales se fijaron en paraformaldehído al 4% y se deshidrataron en etanol después de 48 h; Las secciones se incrustaron en parafina. Las secciones se cortaron en rodajas finas (4 μm) para la tinción con hematoxilina y eosina (HE) y ácido peryódico-Schiff (PAS), y se observaron los cambios morfológicos de la histología renal bajo un microscopio óptico.
    1. Tinción HE:
      1. Desparafinado e hidratación: Tratar las secciones de tejido con Xileno I y II (10 min cada una), alcohol absoluto I y II (3 min cada una). A continuación, sumerja las secciones de tejido en etanol al 95%, 90%, 80% y 70% (2 min cada una), seguido de un lavado con agua destilada durante 5 min.
      2. Colocar las secciones de tejido en tinción de hematoxilina durante 5 min y luego diferenciar las secciones con alcohol clorhídrico durante 5 s.
      3. Coloque la sección en la solución de tinción de eosina durante 3 min.
      4. Deshidratación, limpieza y montaje: Deshidratar las secciones en diferentes momentos en diferentes etanoles (70%, 80%, 90%, 95% y etanoles absolutos), luego limpiarlas en xileno I y II, seguido de montaje con goma neutra.
    2. Tinción de PAS:
      1. Siga los pasos de desparafinado descritos en el paso 5.2.1 y trate la sección con la solución de tinción de ácido peryódico durante ~8 min.
      2. Enjuague las secciones en agua destilada durante 2 minutos y luego tíñalas con el reactivo Schiff durante 15 minutos en la oscuridad.
      3. Lave las secciones con agua del grifo durante 10 minutos después de tratarlas con el reactivo Schiff.
      4. Contratinción de las secciones con hematoxilina durante 1 min y luego diferenciarlas con alcohol HCl durante 30 s. Vuelva a lavar las secciones con agua del grifo durante 5 minutos para colorear el núcleo de azul.
    3. Microscopía electrónica:
      1. Fije las muestras en glutaraldehído al 2,5% durante 3 h, luego enjuáguelas en PBS durante 3 h. Además, trate las muestras con ácido ósmico al 1% durante 3 h y luego enjuague nuevamente con PBS durante 3 h.
      2. Deshidrate a través de una serie gradual de baños de alcohol que terminan en acetona (cada paso dura aproximadamente 2 h en total).
      3. Infiltrar las muestras con una mezcla de propano epoxi y resina epoxi (1:1) a temperatura ambiente (RT) durante 2 h, seguido de resina epoxi pura a 37 °C durante 2 h adicionales.
      4. Después de esto, curar y endurecer las muestras a temperaturas cada vez más altas durante un período de 36 h antes de cortarlas. Este proceso asegura que el tejido se infiltre completamente con la resina, que luego se endurece para permitir un corte fino para la microscopía electrónica.
      5. Doble tinción con acetato de uranilo al 3% y ácido de plomo, y observe y fotografíe las muestras mediante microscopía electrónica en 15 minutos.
        NOTA: Los ajustes de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) son los siguientes: un aumento de 7000x en modo de alto contraste (Zoom-1 HC-1), con un voltaje de aceleración de 80.0 kV en un sistema TEM.
  3. Inmunohistoquímica
    1. Desparafinado: Coloque las secciones de tejido en xileno I y II durante 10 min cada una.
    2. Rehidratación: Rehidratar las secciones de tejido desparafinado colocándolas sucesivamente en etanol absoluto I y II durante 3 min cada una, seguidas de etanol al 95%, 90%, 80% y 70% durante 2 min cada una.
    3. Recuperación de antígenos: Sumerja las secciones de tejido en una solución tampón de citrato y ácido cítrico de 0,1 M a alta presión durante unos 5 minutos y luego enfríe a RT.
    4. Bloqueo: Para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos, bloquee incubando las secciones de tejido con suero de cabra normal al 5% a aproximadamente 37 °C durante 30 min.
    5. Incubación de anticuerpos primarios: Añadir los anticuerpos primarios p-EGFR (diluido 1:200) y p-MAPK3/1 (diluido 1:200) en secciones de tejido e incubar durante la noche a 4 °C dentro de una cámara humidificada.
    6. Incubación de anticuerpos secundarios: Lave las secciones tres veces con PBS, luego agregue anticuerpos secundarios marcados con biotina (diluidos en PBS según las instrucciones del fabricante) en las secciones e incube a 37 °C durante 30 min.
    7. Aplique la solución de trabajo de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante en las secciones de tejido a 37 °C, seguido de un lavado tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    8. Para el desarrollo de DAB, incube las secciones con la solución de revelado de DAB (3 min en la oscuridad en RT), seguido de un enjuague con agua destilada. El DAB actúa como sustrato cromógeno para la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP), que se vuelve marrón con la oxidación.
    9. Use hematoxilina para contratinción durante aproximadamente 2 minutos, diferencie las secciones con alcohol clorhídrico al 1% durante 5 s, luego lave con agua corriente para que se vuelva azul.
    10. Deshidratar colocando sucesivamente las secciones en una serie de etanol de baja a alta concentración, transparente en xileno I y II, y montar las secciones con goma neutra.
      NOTA: Este procedimiento dura aproximadamente 18-24 h, incluyendo la incubación de anticuerpos primarios durante la noche.
    11. Seleccione aleatoriamente tres campos visuales (200x) para cada sección y analice los resultados de tinción de las secciones utilizando un software de análisis de imágenes. Se utilizó el software Image Pro Plus 6.0 siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    12. Primero, importe una imagen de la sección en el software.
    13. Corrección de densidad: Para garantizar resultados precisos, realice una corrección de densidad.
      1. Navegue hasta Medir > calibración > intensidad > las opciones de densidad > opcionales estándar de la nueva > > imagen. Luego, haga clic en un área en blanco de la imagen para registrar el valor de fondo y confírmelo haciendo clic en Aceptar.
    14. Configuración de los parámetros de medición: Configure los parámetros de medición para calcular el área y la densidad óptica integrada (IOD).
      1. Haga clic en Medir > recuento/tamaño > medir > seleccionar medidas. Seleccione Área(100) e IOD y, a continuación, haga clic en Aceptar.
      2. Vaya a Opciones, marque Fondo oscuro en la muestra, Prefiltro de 4 conexiones y haga clic en Aceptar.
    15. Selección de color: Para determinar con precisión la positividad, seleccione los colores para detectar las áreas manchadas frente a las áreas no manchadas.
      1. Haga clic en Seleccionar colores > histograma basado > HSI. Ajuste el valor H de acuerdo con la imagen mientras mantiene S sin cambios e I entre cero y el valor de fondo. A continuación, confirme haciendo clic en Cerrar.
      2. Recopilación y cálculo de datos: Realice la recopilación y el cálculo de datos haciendo clic en Medir > Recopilador de datos > Diseño, donde se seleccionan Nombre, Área (Suma) e IOD (Suma). A continuación, haga clic en Contar > recopilar ahora > lista de datos para exportar los datos para su posterior análisis o almacenamiento.
        NOTA: Esto dio como resultado una medición semicuantitativa de la expresión de proteínas en cada sección en términos de IOD/Área, que indica cuánta proteína está presente en relación con el área total analizada.
  4. Western blot
    1. Obtener el tejido renal y cortarlo en trozos. Coloque estas piezas en un tubo de centrífuga de 1,5 mL, agregue la solución de lisis de proteínas preenfriada (50 mM de Tris [pH 7.4],150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 1% de desoxicolato de sodio, 0.1% de dodecil sulfato de sodio [SDS]) y homogeneice.
    2. Déjelo en hielo durante 30 minutos, luego centrifugue a 13400 x g durante 20 minutos a 4 °C. Almacene la muestra resultante en un congelador a -80 °C.
    3. Utiliza el método de Bradford para cuantificar las proteínas.
      1. Prepare la solución de trabajo Coomassie Brilliant Blue mezclando reactivo y agua destilada en una proporción de 1:4.
      2. Establezca tres grupos: en blanco, grupo de proteína estándar y grupo de proteína de muestra. Agregue 3 mL de solución de trabajo Coomassie Brilliant Blue a cada grupo, junto con solución salina fisiológica para el grupo blanco, proteína estándar para el grupo estándar y la proteína sobrenadante extraída para el grupo de muestra.
      3. Después de dejar reposar las mezclas durante 5 minutos, mida sus valores de absorbancia con un espectrofotómetro ultravioleta.
      4. Calcule la concentración de la muestra utilizando esta fórmula: Concentración de proteína (mg/mL) = (Valor de absorbancia de la muestra/Valor de absorbancia del tubo estándar) x Concentración de proteína estándar x 5.
    4. Agregue un volumen igual de tampón de carga 6x a cada muestra de proteína. Hervir a 100 °C durante 5 min antes de alícuotas y guardarlos en un congelador a -20 °C hasta su uso posterior.
    5. Realizar electroforesis, transferencia y bloqueo estándar.
      1. Realice la electroforesis estándar en gel de poliacrilamida (PAGE) SDS utilizando un gel resolutivo al 12%. Aplique un voltaje constante de 100 V para el gel apilador y 120 V para el gel resolutivo hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.
      2. Transfiera las proteínas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 2 h en una cámara frigorífica a 4 °C utilizando un sistema de transferencia húmeda.
      3. Después de la transferencia de proteínas, bloquee las membranas con leche descremada al 5% en TBST durante 1 h en RT.
    6. Diluir los anticuerpos primarios EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) y CAPDH (1:5.000) en TBST con 5% de BSA. Añadir estos anticuerpos primarios diluidos e incubar las membranas durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
    7. Después de lavar la membrana tres veces con TBST, añadir anticuerpos secundarios diluidos (1:5.000), seguido de una incubación durante 1 h. Después del desarrollo del color, realice un análisis cuantitativo de las bandas objetivo utilizando el software ImageJ.
  5. Análisis de qPCR
    1. Agrupación: Asigne muestras a los grupos: Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. Extracción de ARN: Realice la homogeneización de tejidos y la extracción de ARN, seguidas de la adición de cloroformo, la centrifugación y la precipitación de ARN según las instrucciones del fabricante.
    3. Precipitación y lavado de ARN: Precipitar ARN con isopropanol y lavar con etanol.
    4. Solubilización de ARN: Secar el pellet de ARN y disolverlo en agua tratada con DEPC.
    5. Síntesis de ADNc: Realice la transcripción inversa utilizando mezclas de reacción específicas según las instrucciones del fabricante.
    6. Amplificación de qPCR: Utilice cebadores específicos para GAPDH, MAPK3, MAPK1 y EGFR para qPCR y realice la amplificación según las instrucciones del fabricante.
      Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Métodos estadísticos

  1. Realice el análisis utilizando el software adecuado (por ejemplo, SPSS) y represente los datos medidos como la media ± desviación estándar. Si los datos cumplieron con los criterios de distribución normal y homogeneidad de varianza, compare entre grupos utilizando ANOVA de un factor y realice comparaciones múltiples con el método de Bonferroni.
  2. Utilice la prueba T2 para comparaciones múltiples si la varianza no es homogénea. Considere P < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Siguiendo el protocolo, finalmente se obtuvieron 90 ingredientes activos de JWSJS del análisis después del cribado y la deduplicación de acuerdo con los estándares establecidos de OB y DL. Estos incluían 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, cuatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum y seis tipos de componentes de Bombyx Batryticatus . Debido a que hay muchos ingredientes activos en JWSJS, solo se enumeran 20 (consulte la Tabla 1). Tras la deduplicación, se obtuvieron finalmente 396 dianas correspondientes a los principios activos de JWSJS.

Después de buscar genes relacionados con enfermedades, finalmente se obtuvieron 3035 genes diana relacionados con DN después de fusionarlos y deduplicarlos. Las dianas correspondientes de DN se compararon y analizaron con las dianas de los principios activos de los fármacos. Se determinó la intersección, lo que dio como resultado 227 objetivos de intersección de JWSJS y DN. A continuación, se dibujó un diagrama de Wayne (véase la Figura 1A). El diagrama de red "fármaco-ingrediente-objetivo" se construyó utilizando el software Cytoscape 3.8.0 (ver Figura 1B), y se realizó un análisis topológico. Cada nodo se clasificó de mayor a menor según el valor del grado. Los cinco componentes principales del fármaco fueron quercetina, ácido palmitoleico, luteolina, kaempferol y naringenina, y los cinco objetivos principales fueron PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR y ESR1.

A continuación, se desarrolló una red PPI para los objetivos de intersección JWSJS y DN (196 nodos y 1714 bordes con un valor medio de grados de 17,4). Además, se obtuvieron siete dianas clave que pueden ser las dianas clave de JWSJS para el tratamiento de la DN después de tres cribados: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 y MAPK1 (véase la figura 1C).

A continuación, se realizó un análisis de enriquecimiento de GO para especular sobre las características biológicas de la diana del JWSJS en el tratamiento de la DN. Entre BP, CC y MF, las diez entradas enriquecidas principales se representan en la Figura 1D. Los resultados muestran que JWSJS podría regular la proliferación, diferenciación y apoptosis celular mediante la unión con factores de transcripción y proteínas quinasas en balsas de membrana y microdominios de membrana, lo que resulta en un efecto terapéutico sobre la DN. Se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG en las dianas participantes para explorar las posibles vías de acción de JWSJS en la DN. Las treinta vías más enriquecidas se trazan en la Figura 1E. Los resultados muestran que el tratamiento con JWSJS de DN podría actuar sobre 181 vías de señalización, principalmente relacionadas con los lípidos y la aterosclerosis, la vía de señalización PI3K-Akt, la carcinogénesis química, la hepatitis, el cáncer de próstata, la apoptosis, la vía de señalización HIF-1 y la vía de señalización TNF.

Para explorar más a fondo los objetivos de las primeras 30 vías enriquecidas con KEGG, utilizamos el software Cytoscape 3.8.0 para construir un mapa de red de relaciones de vías de señalización KEGG para DN tratados con JWSJS. Se descubrió que MAPK1, MAPK3, EGFR y AKT1 son objetivos de múltiples vías que actúan juntas (ver Figura 1F), lo que sugiere que estas proteínas pueden desempeñar un papel central en la mediación de los efectos de JWSJS en DN.

Para validar aún más los objetivos potenciales de JWSJS en el tratamiento de DN, a continuación seleccionamos tres objetivos clave, MAPK1, MAPK3 y EGFR, con valores de alto grado en la red PPI y la red de vías de señalización KEGG. Estos se acoplaron molecularmente con quercetina, ácido palmitoleico y luteolina, los tres componentes principales del núcleo de JWSJS para el tratamiento de DN. Las condiciones para el cribado de PDB ID son las siguientes: (1) Ser derivado de seres humanos; (2) Resolución conformacional ≤ 2,5 Å, es decir, lo más pequeña posible; (3) La secuencia conformacional debe ser lo más completa posible, es decir, el complejo estructural debe tener información de ligando de molécula pequeña; y (4) el valor del pH cristalino debe estar lo más cerca posible del rango fisiológico normal del cuerpo humano35. Por último, los ID de PDB de MAPK1, MAPK3 y EGFR fueron 4QTA, 4QTB y 7JXQ.

Para verificar la fiabilidad del software AutoDock en el sistema de acoplamiento en este estudio36, primero reacoplamos las tres proteínas de MAPK1, Mapk3 y EGFR. La conformación del ligando en la estructura cristalina original de las tres proteínas diana se superpuso con los ligandos después del acoplamiento (Figura 2A). A continuación, se calcularon los valores de la desviación cuadrática media (RMSD) entre la conformación del ligando después del acoplamiento y la estructura cristalina original. Los valores de RMSD fueron 1,129, 1,201 y 1,877 Å, respectivamente, todos ≤ 2Å. Esto demostró que el método de acoplamiento era fiable y podía utilizarse para la próxima verificación de acoplamiento molecular. Para comparar y declarar el potencial inhibitorio de los componentes principales, se utilizaron los ligandos originales de MAPK1, MAPK3 y EGFR como controles. El análisis de acoplamiento predijo con éxito la energía de unión entre la luteolina, el ácido palmitoleico y la quercetina y los tres objetivos principales. Todos ellos fueron negativos e inferiores a -637; véase la Tabla 2. Cabe destacar que el acoplamiento molecular entre luteolina y MAPK1 tiene el tamaño de cavidad más alto y la energía de enlace más baja. En general, los resultados del acoplamiento molecular mostraron que la luteolina, el ácido palmitoleico y la quercetina tenían una buena actividad de unión con tres objetivos principales (Figura 2B, C).

El RMSD se utiliza para cuantificar los cambios de desplazamiento promedio de un grupo seleccionado de átomos en relación con un marco de referencia. Mientras tanto, el RMSF caracteriza eficazmente las alteraciones localizadas a lo largo de la cadena de proteínas. El gráfico RMSD (Figura 2D) muestra que los valores de RMSD del complejo compuesto luteolina-MAPK1 y del complejo quercetina-MAPK3 se estabilizaron dentro de 5 ns. El complejo luteolina-EGFR mostró una RMSD fluctuante que osciló entre 0 y 35 ns; este valor se estabilizó en 35 ns hasta el final de la simulación MD de 100 ns. Todos los complejos interactuaron de manera estable al final de la simulación MD de 100 ns. El valor de RMSF se evaluó a partir de la trayectoria de simulación de MD: los átomos en el sitio activo y la cadena principal que fluctuaban mínimamente implicaban un cambio conformacional mínimo, lo que sugiere que el compuesto principal mencionado está firmemente anclado dentro de la cavidad del bolsillo de unión de la proteína objetivo. Los resultados de la RMSF mostraron fluctuaciones limitadas en las estructuras complejas.

Finalmente, verificamos los resultados anteriores in vivo. Primero observamos que el peso de las ratas en el grupo modelo disminuyó significativamente, y GSP, LDL-C, UTP y FBG aumentaron significativamente (P < 0,05). El peso corporal de las ratas aumentó significativamente en el grupo de irbesartán y en cada grupo de JWSJS en comparación con el grupo modelo. GSP, LDL-C, UTP y FBG disminuyeron en diferentes grados (P < 0,05; ver Tabla 3).

Luego, la tinción HE mostró que los glomérulos del grupo normal tenían un tamaño normal. Eran regulares y de estructura clara y tenían una membrana basal lisa, túbulos renales cuidadosamente dispuestos y sin infiltración de células inflamatorias. En el grupo modelo, los glomérulos eran hipertróficos, la membrana basal estaba engrosada y la matriz mesangial estaba aumentada. El intersticio estaba infiltrado con células inflamatorias. Las manifestaciones patológicas de cada grupo de administración se aliviaron en diferente medida en comparación con el grupo modelo (ver Figura 3A).

La tinción con PAS mostró que el grupo modelo tenía un aumento de los volúmenes glomerulares, un engrosamiento de la membrana basal y un aumento de la matriz mesangial en comparación con el grupo normal. Estas manifestaciones patológicas se aliviaron significativamente con cada grupo de administración (ver Figura 3B). Usando microscopía electrónica de transmisión, encontramos que la membrana basal glomerular en el grupo modelo estaba engrosada en comparación con el grupo normal. La matriz mesangial creció y los procesos del pie podocitario se fusionaron ampliamente. Las manifestaciones microscópicas de las ratas en cada grupo de administración se aliviaron en diversos grados en comparación con el grupo modelo (ver Figura 3C).

Finalmente, se detectaron las expresiones de EGFR total, p-EGFR, MAPK3/1 y p-MAPK3/1 para ver si cambiaban en las ratas DN tratadas con JWSJS. No hubo cambios significativos en la expresión total de EGFR y MAPK3/1 en los grupos modelo en comparación con el grupo normal. La expresión de p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX aumentó significativamente, y la expresión de BCL-2 disminuyó significativamente. En comparación con el grupo modelo, la expresión de p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX se redujo significativamente, y la expresión de BCL-2 se reguló significativamente al alza en diversos grados en los tejidos renales de rata en cada grupo de dosificación (Figura 3D,E). Este resultado fue confirmado por inmunohistoquímica (Figura 3F,G). Este estudio demostró que JWSJS podía proteger los riñones en ratas DN mediante la regulación de la expresión de las proteínas p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX y BCL-2 y la reducción de la apoptosis celular. Además, se utilizó qPCR para evaluar los niveles de expresión de MAPK3, MAPK1 y ARNm de EGFR en varios grupos. Los resultados revelaron que la expresión relativa en el grupo DN fue significativamente mayor en comparación con el grupo control, así como con los grupos Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M y JWSJS-H. Este hallazgo corrobora aún más los resultados iniciales (Figura 3H).

figure-results-1
Figura 1: Network Pharmacology aclaró los posibles objetivos y vías de señalización del JWSJS en la nefropatía diabética. (A) Diagrama de Venn de los objetivos que se cruzan entre el JWSJS y la nefropatía diabética. El verde representa el número de dianas terapéuticas de los componentes de la JWSJS, y el morado representa el número de dianas relevantes de la DN. La parte de intersección representa el número de objetivos que se intersectan (es decir, el número de objetivos de JWSJS para DN). (B) Diagrama de red "Fármaco-ingrediente-objetivo" de JWSJS en el tratamiento de la DN. El azul claro representa los objetivos relevantes de JWSJS para el tratamiento de la DN. El fucsia representa el principio activo de Bombyx Batryticatus. El verde representa los ingredientes activos de Hedysarum Multijugum Maxim. El azul oscuro representa los ingredientes activos de Radix Rhei et Rhizome. El rojo representa los ingredientes activos de Cicadae Periostracum. El morado representa los ingredientes activos de Epimrdii Herba. El amarillo representa los ingredientes activos del rixinoma Smilacis Glabrae. El azul cielo representa los ingredientes activos del rizoma Curcumaelongae. (C) Red PPI de objetivos de intersección JWSJS y DN. (D) Los 10 genes más significativos identificados a través del análisis ontológico de los genes diana de la terapia implicados en el tratamiento de la DN con el JWSJS. (E) Los 30 genes más significativos identificados a través del análisis de la vía de los genes diana de la terapia implicados en el tratamiento de la DN con el JWSJS. (F) La red de relaciones de la vía de señalización KEGG en el tratamiento de la DN por el JWSJS. Los iconos amarillos representan vías de señalización. Los iconos azules representan los objetivos de acción. Un gráfico más grande implica que hay más vías conectadas a él. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Visualización del acoplamiento molecular y las trayectorias de dinámica molecular de JWSJS en el tratamiento de la nefropatía diabética. (A) Las conformaciones del ligando en la estructura cristalina original de los tres complejos de proteínas diana 7JXQ (a), 4QTA (b) y 4QTB (c) se comparan con las conformaciones del ligando después del acoplamiento. El verde, el naranja y el rosa son proteínas diana EGFR, MAPK1 y MAPK3, respectivamente. El oro es la molécula de ligando original y el azul es la molécula de ligando después del acoplamiento. (B) Visualización de acoplamiento molecular en 3D de JWSJS en el tratamiento de la nefropatía diabética. El verde, el naranja y el rosa son las proteínas diana 7JXQ, 4QTA y 4QTB, respectivamente. 1a-3a representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA y 4QTB con el inhibidor original (azul). 1b-3b representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y luteolina (amarillo). 1c-3c representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y ácido palmitoleico (fucsia). 1d-3d representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y quercetina (púrpura). (C) Visualización de acoplamiento molecular en 2D de JWSJS en el tratamiento de la nefropatía diabética. 1a-3a representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA y 4QTB con el inhibidor original. 1b-3b representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y luteolina. 1c-3c representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y ácido palmitoleico. 1d-3d representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y quercetina. (D) Análisis RMSD y RMSF de las trayectorias de dinámica molecular de (a) luteolina y proteína diana 7JXQ, (b) luteolina y proteína diana 4QTA, y (c) quercetina y complejos de proteínas diana 4QTB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: JWSJS alivia la lesión renal y suprime la activación de la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 en experimentos in vivo . (A) tinción de HE y (B) tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) de tejidos renales de rata en diferentes grupos (Magnificación, 200x; n = 10). (C) Microscopía electrónica de transmisión de tejido renal en diferentes grupos de ratas (Magnificación, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3/1, p-MAPK3/1, BAX y BCL-2 en tejido renal de rata diabético a través de Western blot (n = 3). (E) Análisis estadístico de la expresión de p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX y BCL-2. (F) Análisis inmunohistoquímico de la expresión de p-EGFR Y p-MAPK3/1 en los seis grupos (n = 6). (G) Análisis estadístico de la expresión de p-EGFR Y p-MAPK3/1. (H) Análisis de qPCR de la expresión de ARNm de MAPK3, MAPK1 y EGFR en seis grupos. *P < 0,05 frente al control. **P < 0,01 frente al control. ▲P < 0.05 vs. DN. ▲▲P < 0.01 vs. DN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Información de algunos principios activos de JWSJS. Proporciona detalles sobre cada componente y sus características o propiedades. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Tabla de resultados de acoplamiento de los objetivos principales y los principales ingredientes activos de JWSJS. La tabla presenta los resultados de los estudios de acoplamiento de los objetivos principales y los principales componentes activos de JWSJS. Esta tabla muestra cómo estos componentes interactúan con sus respectivos objetivos, lo que puede proporcionar información sobre el mecanismo de acción de JWSJS. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Efecto del JWSJS sobre el peso corporal y los índices bioquímicos en ratas con nefropatía diabética (expresado como media ± desviación estándar, n = 10). En comparación con el grupo normal: * P < 0,05. En comparación con el grupo de modelos: # P < 0,05. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Nuestro estudio empleó una combinación de farmacología de red, acoplamiento molecular y modelos animales in vivo . Un paso crítico fue el establecimiento de la red "farmaco-componente-diana", que fue crucial para identificar los mecanismos potenciales de JWSJS en el tratamiento de la DN, centrándose particularmente en su interacción con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1.

Durante este estudio, hicimos varias modificaciones, particularmente en el proceso de acoplamiento molecular, para mejorar la precisión de nuestras predicciones. La resolución de problemas se centró principalmente en optimizar las condiciones del modelo animal in vivo para garantizar su relevancia para el ADN humano. Al identificar los componentes activos clave y las dianas del JWSJS, este estudio proporciona una base teórica para futuras investigaciones y desarrollos del JWSJS como posible candidato a fármaco para el tratamiento de la DN.

El estudio investigó el posible mecanismo de acción de JWSJS en la reducción de la apoptosis renal en la DN. Los resultados del acoplamiento molecular mostraron que la quercetina, el ácido palmitoleico y la luteolina tienen actividades regulares de unión a objetivos clave, incluidos MAPK1, MAPK3 y EGFR. Seleccionamos estas dianas para su posterior estudio debido a su acción común en múltiples vías. En ratas DN, el tratamiento con JWSJS resultó en una disminución significativa en los niveles de FBG y GSP, una mejoría en UTP y LDL-C, aumento de peso y mejores manifestaciones microscópicas de tejido renal, lo que indica la efectividad potencial de JWSJS en el tratamiento de la DN.

La apoptosis es un modo crítico de muerte celular, y la desregulación puede aumentar el riesgo de diversas enfermedades38. Estudios previos demostraron que las ratas DN tenían una mayor expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis BAX y caspasa-3, y un aumento significativo en el número de células apoptóticas en el tejido renal39,40. Los resultados mostraron que el tratamiento con JWSJS revirtió estos cambios, lo que sugiere que puede atenuar la apoptosis de los podocitos en condiciones diabéticas.

Investigaciones posteriores sobre el posible mecanismo de acción de JWSJS mostraron que tiene un efecto multiobjetivo y multivía sobre la DN. Nos centramos en estudiar MAPK1, MAPK3 y EGFR, ya que tenían el mayor número de vías de enriquecimiento. La vía ERK, que está involucrada en varios procesos fisiológicos y patológicos como el crecimiento celular, la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y la secreción anormal de esteroides, es una vía esencial en la vía de transducción de señales MAPK 13,41,42,43. Dedujo que JWSJS rescató la apoptosis de los podocitos mediante la inhibición de la vía de señalización EGFR/MAPK3/1.

También encontramos que JWSJS podría regular la expresión de p-EGFR y p-MAPK3/1, lo que resulta en niveles marcadamente regulados al alza de Bcl-2, pero una notable regulación a la baja de Bax. Esto, a su vez, condujo a una reducción de la apoptosis de las células renales. Se han encontrado resultados similares en estudios previos. Por ejemplo, Chen informó que la deleción de EGFR en los podocitos atenuó la nefropatía diabética44. Algunos investigadores descubrieron que la vía EGFR/ERK promovía la proliferación y diferenciación de las células epiteliales intestinales porcinas9. La inhibición de EGFR puede regular a la baja la expresión de TGF-β y BAX, mejorando así la fibrosis renal y la apoptosis45. Estos hallazgos sugieren que el JWSJS es una prescripción de medicina tradicional china con un papel significativo en la terapia adyuvante de la DN al inhibir la vía de señal EGFR/MAPK3/1. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender completamente el posible mecanismo de acción de JWSJS en el tratamiento de la DN.

Este estudio tuvo varias limitaciones. En primer lugar, es posible que la dependencia de modelos animales no reproduzca completamente la respuesta humana al JWSJS. Además, las predicciones de farmacología de red, aunque perspicaces, requieren una mayor validación a través de datos experimentales. Se necesitan más estudios clínicos en seres humanos para validar los hallazgos. En segundo lugar, aunque la farmacología de redes es una herramienta útil para analizar las relaciones entre fármacos y enfermedades, los resultados deben interpretarse con cautela, ya que se basan en predicciones más que en datos experimentales. En tercer lugar, el mecanismo de acción de JWSJS para el tratamiento de la DN sigue sin estar claro, y el estudio solo se centró en los posibles objetivos de MAPK1, MAPK3 y EGFR.

Los métodos utilizados en este estudio se pueden aplicar a otras formulaciones de la medicina tradicional china, lo que podría conducir al descubrimiento de nuevas opciones terapéuticas para la DN y otras enfermedades complejas. Además, este enfoque sienta las bases para integrar la medicina tradicional y moderna en la investigación farmacológica futura. Se necesitan más estudios para dilucidar completamente los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos terapéuticos del JWSJS. Por último, el estudio no investigó los posibles efectos secundarios o la toxicidad del JWSJS, que son consideraciones importantes en el desarrollo de cualquier fármaco nuevo. Se necesita más investigación para evaluar la seguridad del JWSJS y garantizar su aplicación clínica.

En resumen, este estudio investiga principalmente el potencial terapéutico de Jiawei Shengjiang San para la nefropatía diabética utilizando farmacología de red, acoplamiento molecular y validación animal in vivo . Se hace hincapié en los aspectos procedimentales, centrándose en la metodología empleada para comprender las interacciones entre el JWSJS y la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 y cómo estas interacciones reducen potencialmente la apoptosis de las células renales en la DN.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el proyecto general de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hebei, China (No. H2019423037).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2&veces; SYBR Verde qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
Cuantificación de proteínas en orina de 24 horas (UTP)Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing JianchengN/A
3,3'-diaminobenzidinaShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Instrumento automático de análisis bioquímicoHitachi, Japón7170A
Etanol anhidroBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Anticuerpos primarios Affinity, USAAF0120Rata
BCL-2 Anticuerpos primarios Affinity, EE. UU.AF6139
Rata BX53 MicroscopioOlympus, JapónBX53
Sustituto del cloroformoECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Desmond software Nueva York, NY, EE. UU.Lanzamiento 2019-1
Baño de agua digital a temperatura constanteChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Anticuerpos primarios Affinity, EE. UU.AF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, EE. UU14900
Glucosa en sangre en ayunas (FBG)Nanjing Jiancheng Instituto de Ingeniería Biológica N/A
FC Analizador de etiquetas enzimáticas de longitud de onda completaMultiskan; Termo, EE. UU.N/A
GAPDH  Anticuerpos primarios Affinity, EE. UU.AF7021
Proteína sérica glicosilada para ratas (GSP)Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing JianchengN/A
Microscopio electrónico de transmisiónHitachi, JapónH-7650
Solución de tinción de hematoxilina/eosina (HE)Servicebio, EE. UU.G1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, EE. UU.N/A
Instrumento de amplificación de PCR en tiempo realApplied Biosystems, EE. UU. iQ5 
Tabletas de irbesartánHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
  Gránulos JWSJSGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM sistema de imagenKodak, EE. UUIS2000
Colesterol de baja densidad (LDL-C)Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing JianchengN/A
MAPK3/1Anticuerpos primarios Afinidad, EE. UU.AF0155
Centrífuga médicaDesarrollo de instrumentos de laboratorio de Hunan Xiangyi, China  TGL-16K
Mini sistema de transferencia trans-blotBio-Rad, EE. UUN/A
Sistema de electroforesis mini-PROTEANBio-Rad, EE. UU/A
Espectrofotómetro NanoVue PlusHealthcare Bio-Sciences AB, Suecia111765
p-EGFR Anticuerpos primarios Affinity, EE. UUAF3044
Solución de tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) para ratasServicebio, EE. UUG1008
p-MAPK3/1 Anticuerpos primarios Afinidad, EE. UUAF1015para ratas
  Santa Cruz, EE. UU.SC-2357
Estreptozotocinade conejo Sigma, EE. UU.S0130
Kit de síntesis de ADNc de primera cadenaSureScript GeneCopeia, EE. UU.QP056T
Reactivo TriQuickSolarbio, Pekín, ChinaR1100
Equipo depurificación de Suzhou, ChinaSW-CJ-1F  
. . de rata . . N. . . Anticuerpos secundarios Banco de trabajo ultralimpio

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