Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

En los últimos años, las tecnologías de organoides se han convertido en una herramienta prometedora para el cultivo de tejidos similares a órganos ^1,2,3. Especialmente para los órganos a los que no se puede acceder fácilmente, como el cerebro humano, los organoides ofrecen la oportunidad de obtener información sobre el desarrollo y la manifestación de la enfermedad⁴. Como tal, los organoides cerebrales han sido ampliamente utilizados como modelo experimental para investigar diversos trastornos del cerebro humano, incluidas enfermedades del desarrollo, psiquiátricas o incluso neurodegenerativas ^4,5,6.

Con el advenimiento de las tecnologías de perfiles de transcriptoma de una sola célula, los tejidos humanos primarios y los modelos complejos in vitro pudieron estudiarse con un nivel de granularidad sin precedentes, proporcionando información mecanicista sobre los cambios en la expresión génica a nivel de las subpoblaciones celulares en la salud y la enfermedad e informando sobre nuevos objetivos terapéuticos putativos ^7,8,9. El campo de los organoides ha progresado mediante la utilización del perfil del transcriptoma de una sola célula para evaluar la composición celular, la reproducibilidad y la fidelidad de las tecnologías de organoides cerebrales 10,11,12. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) permitió la clasificación celular y la identificación de la desregulación genética en organoides enfermos^13,14. Es importante destacar que es la complejidad de los tejidos organoides lo que requiere la implementación de técnicas que permitan el perfil de células individuales. La caracterización de organoides utilizando métodos como el perfil del transcriptoma masivo (secuenciación masiva de ARN) conduce a una heterogeneidad celular enmascarada y perfiles de expresión génica que se promedian en todos los tipos de células dentro del tejido complejo, lo que en última instancia limita nuestra comprensión de los procesos en curso durante el desarrollo de organoides en la salud y la enfermedad 15,16,17. A medida que los métodos de scRNA-seq continúan avanzando, se está creando un número cada vez mayor de atlas, ejemplificados por recursos como el Allen Brain Atlas o el Single cell atlas of human brain organoids de Uzquiano et ^al.18.

El éxito de la scRNA-seq a partir de organoides cerebrales depende del aislamiento y la captura eficaces de las células intactas. Dado que la disociación de los organoides cerebrales para obtener células individuales se basa en la digestión enzimática, puede influir en los patrones de expresión génica al inducir estrés y daño celular^19,20. Por lo tanto, la disociación del tejido en células individuales es el paso más crucial. Un enfoque alternativo es la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq), que facilita la extracción sin enzimas de núcleos de tejidos, tanto frescos como congelados^21,22. Sin embargo, el aislamiento de núcleos de un tejido plantea otros desafíos, como el enriquecimiento de los tipos celulares de interés y el bajo contenido de ARN de los núcleos en comparación con las células.

Los estudios de transcriptoma de organoides cerebrales se realizan comúnmente utilizando scRNA-seq 10,18,23. Sin embargo, el aislamiento de núcleos individuales podría proporcionar un método ortogonal y complementario para investigar el perfil transcriptómico de los organoides. Aquí, presentamos una caja de herramientas para la secuenciación de scRNA y snRNA para organoides cerebrales y discutimos los puntos críticos para obtener datos de secuenciación de la mejor calidad.

El protocolo descrito se lleva a cabo en un laboratorio de bioseguridad de nivel 1 del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (número de aprobación: 138/08), de acuerdo con los requisitos y de conformidad con las normas nacionales y de la UE sobre ética en la investigación.

1. Derivación de organoides del prosencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

NOTA: Este protocolo se probó para varias líneas diferentes de iPSC cultivadas en una variedad de medios de células madre de diferentes compañías (Tabla 1). La generación de organoides del prosencéfalo depende en gran medida de iPSCs de alta calidad y de una confluencia del 60%-70% antes de iniciar el protocolo. En este caso, utilizamos una línea celular disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).

1. Día 0: Formación del cuerpo embrioide
   1. Para el tratamiento de la placa de 96 pocillos con solución plurónica, agregue 80 μL de solución plurónica filtrada estéril al 2% por pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos. Incubar durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente (RT) o 37 °C.
      NOTA: Las placas tratadas con Plurónico pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas y pueden utilizarse directamente sin necesidad de lavados para la formación del cuerpo embrioide.
   2. Retire la solución plurónica de cada pocillo con un aspirador o una pipeta multicanal antes de sembrar las células.
   3. Antes de comenzar, prepare los siguientes reactivos para una placa de 96 pocillos: Tubo de centrífuga de 15 mL con 5 mL de DMEM precalentado: medio F12; 11 mL de medio de células madre suplementado con 50 μM de Y-27632, placa tratada con plurónico (como se ha descrito anteriormente).
   4. Aspire los medios de un pocillo de una placa de 6 pocillos de iPSC confluentes al 60-70%. Lave las celdas una vez con PBS. Añadir 500 μL de reactivo a base de tripsina e incubar durante 2-6 min a 37 °C.
      NOTA: El tiempo de incubación para el desprendimiento adecuado de las células con reactivo a base de tripsina depende de la densidad celular y de las propiedades adhesivas de la matriz celular de cada línea de iPSC. Para evitar la digestión excesiva, se recomienda examinar la morfología celular después de 2 minutos de incubación con un reactivo a base de tripsina utilizando un microscopio de campo claro.
   5. Separe las células con una pipeta de 1000 μL y transfiéralas al tubo de centrífuga de 15 mL previamente preparado con medio DMEM:F12 para detener la disociación.
   6. Suspensión de la célula centrífuga durante 3 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante y mantener el pellet de la célula. Resuspender las células en 1 mL de medio de células madre suplementado con 50 μM de Y-27632.
   7. Cuente las células utilizando un contador de células y agregue el número deseado de células al medio de células madre suplementado con 50 μM Y-27632. La generación de un solo cuerpo embrioide requiere de 3.000 a 12.000 células, dependiendo de la línea celular.
   8. Transfiera la suspensión celular a un depósito de reactivo multicanal utilizando una pipeta de 10 mL. Utilizando una pipeta multicanal, coloque 100 μL/pocillo de la suspensión celular en la placa de 96 pocillos previamente tratada con plurónico.
   9. Coloque una placa de 96 pocillos en una incubadora a 37 °C, 5% de O₂ y 5% de CO₂. Para evitar cualquier perturbación durante la formación del cuerpo embrioide, absténgase de mover la placa.
2. Día 2: Examen de formación del cuerpo embrioide
   1. Examine la formación del cuerpo embrioide utilizando un objetivo 10x de un microscopio de campo brillante. Los cuerpos embrioides deben mostrar bordes claros y una muerte celular mínima.
   2. Aspire la mayor cantidad de medio posible y reemplácelo con 100 μL/pocillo de medio de células madre. (Crítico) Los cuerpos embrioides se retiran fácilmente del pocillo durante el intercambio de medios. Preste atención a no quitarlos, por lo tanto, controle el medio después de la aspiración.
3. Día 3: Inducción del neuroectodermo
   1. Aspire la mayor cantidad de medio posible y reemplácelo con 120 μL/pocillo de medio de inducción y coloque la placa a 37 °C, 20% de_O2 y 5% de CO₂.
4. Día 6: Incrustación
   1. Dependiendo de la línea iPSC, se requieren 3 o 4 días para inducir la aparición del neuroectodermo. Monitoree los cuerpos embrioides regularmente. Una vez que los bordes se vuelven brillantes, los cuerpos embrioides están listos para ser incrustados. Utilice uno de los dos métodos diferentes que se pueden utilizar para la inclusión del cuerpo embrioidal como se describe a continuación²⁴.
   2. Método de incrustación 1: Incrustación de cookies
      1. Descongele una alícuota de gel de matriz extracelular sin diluir en hielo durante 1-2 h. (Crítico) Mantenga siempre el gel de matriz extracelular en hielo para evitar que se solidifique. Prepare las alícuotas con anticipación para minimizar el tiempo de descongelación y los ciclos de descongelación repetidos.
      2. Corte la punta de una pipeta de 200 μL con pinzas de garra y recoja entre 16 y 32 cuerpos embrioides en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Transfiera los cuerpos embrioides en 67 μL del medio a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 100 μL de gel de matriz extracelular con una punta de pipeta cortada de 200 μL y mezclar suavemente.
      4. Distribuya uniformemente los cuerpos embrioides en un plato de 6 cm y coloque el plato durante 5-10 minutos para permitir que el gel de la matriz extracelular se solidifique.
      5. Añadir unos 4 mL de medio de diferenciación e incubar a 37 °C, 20% de_O2 y 5% de_CO2. Al día siguiente, coloque el plato en un agitador orbital (84 rpm). Asegúrese de que todos los cuerpos embrioides se desprendan de la parte inferior. De lo contrario, utilice una punta de pipeta cortada y medios para separarlos suavemente.
   3. Método de incrustación 2: Incrustación líquida
      1. Descongele una alícuota de gel de matriz extracelular sin diluir en hielo durante 1-2 h y coloque los medios de diferenciación en hielo. (Crítico) Los medios deben estar helados al agregar gel de matriz extracelular.
      2. Una vez que el medio esté frío, agregue gel de matriz extracelular hasta la concentración final del 2%. Corte la punta de una pipeta de 200 μL con pinzas de garra y transfiera hasta 24 cuerpos embrioides a un pocillo de una placa de 6 pocillos.
      3. Retire todo el exceso de medios y agregue aproximadamente 4 mL de gel/medio de diferenciación de matriz extracelular al 2% en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Coloque inmediatamente la placa en el agitador orbital (84 rpm).
5. Día 9-20: Realizar un intercambio completo de medios utilizando medios de diferenciación cada 3-4 días.
6. Día 21-30: Transfiera los organoides a los medios de maduración y realice intercambios completos de medios cada 3-4 días.
7. Disociación de organoides: Para la disociación de núcleos individuales y células, utilice organoides de alta calidad. Para evitar cantidades excesivas de muerte celular, corte regularmente los organoides para evitar la acumulación de un núcleo necrótico y permita que se recuperen durante 2 semanas antes de disociarlos para su posterior análisis.

2. Derivación de una sola célula a partir de organoides

NOTA: La disociación de una sola célula se realiza utilizando el Kit de Disociación de Tejido Neural (Tabla 2), que utiliza disociación mecánica y enzimática. Aquí describimos una disociación mecánica manual. Como alternativa, se puede utilizar una máquina de disociación.

1. Prepare la solución STOP y 0.04% BSA en hielo. Prepare la mezcla de enzimas 1 y 2 y 0.04% BSA en PBS y colóquela en hielo.
2. Recoja hasta 5 organoides en un pocillo de una placa de 6 pocillos y aspire el exceso de medio y lávese una vez con PBS para eliminar el medio de cultivo. Coloque los organoides en el medio del pozo y, con un bisturí, pique bien los organoides.
3. Añadir la mezcla de enzimas 1 y colocar a 37 °C, 20%_O2 y 5%_CO2, agitando a 90 rpm durante 10-15 min.
4. Con una punta de pipeta de 1000 μl, vuelva a suspender los organoides pipeteando hasta 10 veces. Añadir la mezcla enzimática 2 y mezclar bien pipeteando con una punta de pipeta de 1000 μL. Colocar a 37 °C, 20%_O2 y 5%_CO2, agitando a 90 rpm durante 10-15 min.
5. Detenga el proceso de disociación resuspendiendo la solución celular en 10 mL de solución STOP fría. Filtre la solución de celda con un filtro de celdas de 70 μM. Centrifugar la solución de celda filtrada durante 10 minutos a 300 x g a 4 °C para formar un pellet.
6. Aspirar los medios, dejando un pellet celular y resuspender las células en 4 mL de BSA frío al 0,04%. Filtre la solución celular con un filtro de células de 40 μM y cuente las células con un contador de células.
7. Centrifugar la solución celular durante 10 min a 300 x g a 4 °C. Aspire la solución de BSA, dejando un pellet de celda. Resuspenda las células de acuerdo con el manual del kit de secuenciación de snARN basado en microfluídica en medio NSB+.

3. Aislamiento de núcleos individuales a partir de organoides

1. Transfiera los organoides a PBS refrigerado y corte cada organoide en 4 trozos. Lave los organoides 2 veces con PBS frío.
2. Cortar con unas tijeras la punta de la pipeta de una pipeta de 1000 μL y transferir los trozos de organoide a una boquilla de 2 mL. Aspire PBS completamente y agregue 1 mL de tampón de lisis NP40.
3. Sucede 3 veces con el mortero A y 3 veces con el mortero B. Transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 15 ml. Lave el dosuncer con 1 mL adicional de tampón de lisis NP40 y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL. Incubar durante 5 min a RT y posteriormente centrifugar la suspensión durante 5 min a 500 x g.
4. Aspirar el sobrenadante dejando 50 μL de sobrenadante. Agregue 1 mL de NSB+ sin alterar el pellet. Vuelva a suspender después de 5 minutos de incubación.
5. Suspensión de capas sobre un gradiente de Percoll (capa inferior: 1 mL de NSB+ y 250 μL de Percoll, capa intermedia: 1 mL de NSB+ y 188 μL de Percoll, capa superior: 1 mL de NSB+ y 125 μL de Percoll). (Crítico) Realice las capas con mucho cuidado para evitar que se mezclen las capas.
6. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C, aspirar sobrenadante y resuspender en NSB+. Filtre la solución de núcleos con un colador de células de 40 μM.
7. Tiñir y contar núcleos utilizando DAPI y una cámara de Neubauer. Resuspenda los núcleos de acuerdo con el manual del kit scRNA-seq basado en microfluídica.

4. Preparación y secuenciación de la biblioteca

1. Cargue 10.000 células y núcleos en un sistema de microfluídica y genere la biblioteca de acuerdo con el manual del kit scRNA-seq basado en microfluídica (Tabla de materiales).
2. Secuenciar las bibliotecas con una estimación de 6 x 10⁸ lecturas por biblioteca de snRNA-seq y 1,6 x 10⁸ lecturas por biblioteca de scRNA-seq, lo que da como resultado una saturación de secuenciación del 87 % para el conjunto de datos de snRNA-seq y una saturación de secuenciación del 36 % para el conjunto de datos de scRNA-seq.

5. Análisis

1. Lleve a cabo análisis de secuenciación utilizando una canalización de análisis de datos para scRNA-seq y snRNA-seq y alinee con el genoma humano GRCh38. Someta la matriz de recuento generada por esta canalización a un análisis más detallado utilizando el paquete R Seurat (versión 4.1.1)²⁵.
2. Cree el objeto Seurat considerando los genes que estaban representados en al menos 5 células e incorporando células que contenían al menos 300 genes. Realice un filtrado de control de calidad adicional reteniendo células que contenían más de 1000 genes pero menos de 4000 genes para el conjunto de datos scRNA-seq y más de 800, pero menos de 4000 genes por núcleo para el conjunto de datos snRNA-seq. Excluya los conjuntos de datos, células y núcleos que superen el 5% de lecturas mitocondriales.
3. Para mitigar los efectos de lote entre ambos métodos, integre ambos conjuntos de datos filtrados, normalice y visualice a través de la aproximación y proyección uniformes de colectores (UMAP). Omita el grupo 1, que muestra un identificador molecular único (UMI) y recuentos de genes bajos. Posteriormente, para los clústeres, asigne identidades celulares basadas en genes marcadores conocidos y en el conjunto de datos de organoides de 30 días de antigüedad de Ana Uzquiano et. al. (Fichero de codificación suplementaria 1)¹⁸.

Para investigar la composición del tipo celular de los organoides cerebrales utilizando scRNA-seq y snRNA-seq, se recolectaron organoides cerebrales después de 30 días de cultivo, ya que los organoides en esta etapa ya exhiben bucles neuroepiteliales que consisten en progenitores rodeados por progenitores intermedios y neuronas en etapa temprana 4,18. El seguimiento de la calidad de los organoides a lo largo del crecimiento y el cultivo es esencial para obtener datos fiables de una sola célula y de un solo núcleo.

Los organoides se forman a través de la agregación de iPSC en cuerpos embrioides (Figura 1B, C). Al ensamblarse, se espera que estos cuerpos embrionarios exhiban bordes claros con un mínimo de desechos celulares (Figura 1C). Después de la inducción del neuroectodermo, los cuerpos embrioides manifiestan un brillo observable alrededor de la superficie con una región interna comparativamente más oscura, lo que indica una inducción neural exitosa (Figura 1D). En las semanas siguientes, los organoides desarrollan los llamados bucles, estructuras neuronales en forma de roseta, compuestas principalmente por células neuroepiteliales (Figura 1E,F). Aunque estos organoides pueden mantenerse en cultivo durante varios meses, hay que tener en cuenta que con el aumento de su tamaño, se produce un aumento correspondiente de la muerte celular en la parte interna de los organoides debido a la falta de nutrientes y disponibilidad de oxígeno, lo que finalmente resulta en el desarrollo de un núcleo necrótico.

Con el fin de explorar la diversidad celular dentro de los organoides corticales a través del análisis de secuenciación, aislamos tanto células individuales como núcleos de organoides. Para equilibrar la heterogeneidad inherente dentro de un solo lote de organoides cerebrales, llevamos a cabo la secuenciación de cuatro organoides agrupados de un lote. Además, para fines comparativos entre los procesos de aislamiento y para eliminar los efectos de lote entre la biblioteca snRNA-seq y scRNA-seq, estos organoides se dividieron en mitades (ocho mitades en total; Figura 2). Tras el aislamiento enzimático de las células individuales, es crucial garantizar que la viabilidad celular se mantenga por encima del 80%, al tiempo que se observa que las células mantienen una morfología redonda (Figura 3A,B). De manera similar, el aislamiento mecánico de núcleos individuales debería producir núcleos intactos de diferentes tamaños con un mínimo o ningún residuo detectable (Figura 3C, D).

El análisis de secuenciación reveló que se capturaron y secuenciaron más células que núcleos. Ambos conjuntos de datos mostraron una buena calidad evaluada por el alto recuento de genes y UMI por célula y núcleo, y el bajo porcentaje de lecturas mitocondriales (Figura 4A-C). Como se esperaba, las lecturas mitocondriales y ribosómicas comprenden una fracción más alta del total de lecturas recuperadas en el conjunto de datos scRNA-seq en comparación con el conjunto de datos snRNA-seq. En el conjunto de datos scRNA-seq, la mayoría de las células contenían menos del 30% de lecturas ribosómicas, mientras que en el conjunto de datos snRNA-seq, la mayoría de los núcleos contenían menos del 5% de lecturas ribosómicas. Además, la mayoría de las células capturadas dentro del conjunto de datos scRNA-seq contienen menos del 5% de lecturas mitocondriales. Después de filtrar las lecturas mitocondriales, alrededor de 10.000 células y 3.000 núcleos superaron el umbral de calidad.

El análisis integrador de ambos conjuntos de datos reveló que todos los clústeres están representados en ambos conjuntos de datos, lo que indica que ambos métodos recuperan los mismos tipos de células (Figura 5A, C). La anotación del conjunto de datos muestra que las principales poblaciones celulares comprenden glía radial, progenitores intermedios, progenitores subcorticales y neuronas, así como neuronas de proyección de capa profunda recién nacidas y tipos de células menos representadas como Cajal-Retzius, el dobladillo cortical y las células del plexo coroideo (Figura 5B). En general, scRNA-seq y snRNA-seq podrían recuperar todos los tipos de células que se espera que estén presentes en un organoide cerebral de 30 días de antigüedad.

Figura 1: Generación de organoides cerebrales a partir de iPSCs. Curso temporal de la generación de organoides cerebrales (A). Imágenes ejemplares de una diferenciación cortical exitosa de las iPSCs (B), que forman cuerpos embrioides (72 h después de la siembra) (C) y muestran una inducción neural exitosa después de 7 días de cultivo (D). El organoide representa bucles distintos en el día 15 (E) y el día 30 (F). Barra de escala: B-D 200 μm, E 400 μm, F 800 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo para obtener células individuales y núcleos individuales a partir de organoides cerebrales. La disociación de los organoides en células individuales se lleva a cabo picando los organoides con un bisturí, seguido de una digestión enzimática (arriba). El aislamiento de los núcleos se lleva a cabo por disociación mecánica, seguida de purificación a través de un gradiente de Percoll (abajo). La célula única y la suspensión de núcleos se filtran y se cargan en un sistema de microfluídica para la generación y secuenciación de bibliotecas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados representativos de células y núcleos aislados de organoides de 30 días de edad. (A) Imagen ejemplar de células teñidas con azul de tripano tomadas con un contador de células y (B) primer plano correspondiente. (C) Superposición de imagen de campo claro y fluorescente de núcleos teñidos con DAPI y (D) primer plano correspondiente. Barra de escala: 100 μM Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Control de calidad de scRNA- y snRNA-seq. Los gráficos de violín ilustran el recuento absoluto de UMI (A), el recuento de genes (B), las lecturas mitocondriales (C) y ribosómicas (D) de las células (azul) y los núcleos (rosa-púrpura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: scRNA-seq y snRNA-seq recuperan poblaciones celulares similares en organoides de 30 días de edad. UMAP integrado e integrado de organoides de 30 días de antigüedad, que muestra los resultados de scRNA-seq (azul) y snRNA-seq (rosa-púrpura) (A), perfiles integrados y anotados e individuales de scRNA-seq y snRNA-seq (B,C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Medios de cultivo celular y componentes de recubrimiento Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Tampones de disociación para scRNA y snRNA-seq. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Fichero de codificación suplementario 1: Archivo de codificación utilizado para analizar los datos de scRNA-seq y snRNA-seq. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.