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Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

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DOI:

10.3791/66232

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12 de abril de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

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Resumen

El protocolo describe un método factible, fiable y reproducible de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo que puede utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar en modelos de ratón.

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) durante el trasplante de pulmón es un factor de riesgo importante para las complicaciones posteriores al trasplante, incluida la disfunción primaria del injerto, el rechazo agudo y crónico y la mortalidad. Los esfuerzos para estudiar los fundamentos de la IRI condujeron al desarrollo de un modelo de ratón fiable y reproducible de pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo. Este modelo consiste en un procedimiento quirúrgico realizado en un ratón anestesiado e intubado. Se realiza una toracotomía izquierda, seguida de una movilización pulmonar cuidadosa y disección del hilio pulmonar izquierdo. La pinza hiliar implica la ligadura reversible del hilio pulmonar con un nudo corredizo, que detiene la entrada arterial, la salida venosa y el flujo de aire a través del bronquio principal izquierdo. La reperfusión se inicia mediante la extracción cuidadosa de la sutura. Nuestro laboratorio utiliza 30 min de isquemia y 1 h de reperfusión para el modelo experimental en las investigaciones actuales. Sin embargo, estos períodos de tiempo pueden modificarse dependiendo de la pregunta experimental específica. Inmediatamente antes del sacrificio, se puede obtener gasometría arterial del ventrículo izquierdo después de un período de 4 minutos de pinzamiento del hilar derecho para garantizar que los valores dePaO2 obtenidos se atribuyan solo al pulmón izquierdo lesionado. También describimos un método para medir la extravasación celular con citometría de flujo, que implica la inyección intravenosa de un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para la(s) célula(s) que se va a estudiar antes del sacrificio. A continuación, se puede extraer el pulmón izquierdo para la citometría de flujo, congelado o fijo, inmunohistoquímica incluida en parafina y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Esta técnica de pinzamiento hiliar permite un estudio detallado de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la IRI. Los resultados representativos revelan una disminución de la oxigenación del pulmón izquierdo y evidencia histológica de lesión pulmonar después del pinzamiento hiliare. Esta técnica puede ser fácilmente aprendida y reproducida por personal con y sin experiencia microquirúrgica, lo que conduce a resultados confiables y consistentes y sirve como un modelo ampliamente adoptable para el estudio de la IRI pulmonar.

Introducción

La IRI durante el trasplante de órganos es un factor de riesgo importante para la disfunción primaria del injerto y los episodios posteriores de rechazo del injerto 1,2. Durante el trasplante, el tiempo de isquemia caliente se define como el período de tiempo que transcurre desde el pinzamiento cruzado de la aorta del donante hasta el inicio de la perfusión fría y desde la extracción del órgano desde el hielo hasta la implantación del órgano. El tiempo de almacenamiento en frío se define como el período de tiempo que transcurre desde el inicio de la perfusión en frío hasta la extracción del órgano del hielo3. La isquemia caliente es más deletérea para la función orgánica posterior que la isquemia fría 4,5,6, y sus mecanismos subyacentes justifican estudios adicionales en modelos preclínicos. Además, el trasplante de órganos por donación después de la muerte cardíaca (DCD) se asocia con tiempos isquémicos cálidos más largos que la donación tradicional después de la muerte encefálica (DBD)7. Si bien el uso de donantes con DCD puede ampliar el grupo de donantes y aumentar la utilización pulmonar, se necesitan más estudios preclínicos para evaluar los efectos de la isquemia caliente en la función pulmonar posterior al trasplante. A continuación, describimos un modelo de IRI caliente en ratones a través de la pinza hiliar pulmonar izquierda.

En los últimos años se han desarrollado y adaptado varios modelos animales de pinzamiento hiliar pulmonar que pueden incluir el uso de una pinza microvascular atraumática 8,9,10,11,12,13, un torniquete de Rumel 14,15 o una ligadura de sutura16 como la pinza hiliare. El quid de la pinza hiiar es que debe ser reversible y causar un daño mínimo o nulo a las estructuras hiliares para que se pueda lograr la reperfusión. Aquí, describimos nuestra técnica de pinzamiento hiliar en ratones que implica la ligadura reversible de sutura del hilio pulmonar izquierdo con un nudo corredizo. Este método ocluye el flujo arterial pulmonar de entrada, el flujo venoso de salida y el flujo de aire dentro y fuera del bronquio principal. El principal beneficio de un nudo corredizo sobre una pinza vascular, un clip o un torniquete es que el tórax puede cerrarse durante períodos prolongados de isquemia, minimizando así la pérdida de líquido insensible y calor en el ratón. Proporcionamos un protocolo para obtener mediciones fiables de la gasometría arterial (GAB) y para medir la extravasación celular después del pinzamiento hiliar.

Esta técnica de pinzamiento hiliar ocupa un lugar importante en el estudio más amplio del trasplante de pulmón. En comparación con los modelos de trasplante pulmonar ortotópico de animales pequeños, la técnica de pinzamiento hiliar puede aislar los efectos de la IRI sin la adición de trauma anastomótico quirúrgico o alogenicidad17. Además, la técnica de pinzamiento hiliar puede dominarse más fácil y rápidamente que el trasplante de pulmón de ratón. De hecho, utilizando técnicas de pinzamiento hiliar, se han identificado en la última década varios mecanismos importantes en la patogénesis de la IRI, como TLR4, NADPH oxidasa y el receptor de adenosina A2A 14,18,19,20. En el siguiente protocolo, presentamos un método fiable, enseñable y reproducible de pinzamiento hiliar como herramienta para el estudio de la IRI pulmonar.

Protocolo

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio,8ª edición21 preparada por la Academia Nacional de Ciencias y publicada por los Institutos Nacionales de Salud, y los Principios de cuidado de animales de laboratorio formulados por la Sociedad Nacional de Investigación Médica.

1. Anestesia e intubación

  1. Seleccione un ratón que pese al menos 25 g. Esto facilitará la intubación debido al orificio más grande entre las cuerdas vocales.
  2. Inyectar al ratón por vía intraperitoneal una mezcla de ketamina (dosis de 100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (dosis de 10 mg/kg de peso corporal). Esta mezcla debe cargarse en una jeringa de 1/2 cc con una aguja 29G de 1/2 pulgada. Espere unos 5 minutos para que la ketamina haga efecto: el ratón no debe mostrar movimiento espontáneo y no responde a un pellizco en el dedo del pie, lo que confirma una anestesia adecuada.
  3. Inyecte buprenorfina (dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea antes de la cirugía para un control adicional del dolor.
  4. Aplique un ungüento oftálmico no medicado sobre ambos ojos para evitar la desecación de la córnea durante la cirugía.
  5. Afeitar el ratón con una maquinilla sobre el pecho izquierdo y la espalda (véase la figura 1A), extendiéndolo hasta el abdomen si se planea una laparotomía (véase el paso 5.3).
  6. Una vez que el ratón esté anestesiado, realice la intubación utilizando una configuración de intubación preferida y el resto del procedimiento bajo un microscopio sobre una esterilla calentada a ~ 37 °C (para mantener la normotermia en el ratón).
  7. Después de lograr una visión adecuada de las cuerdas vocales, inserte un introductor casero (ver Figura complementaria 1) con una curva en el extremo en un angiocatéter 20G de 1 pulgada, que se utiliza como tubo endotraqueal (TET). Guíe la punta del introductor y luego el ETT entre y más allá de las cuerdas vocales.
    NOTA: Es importante visualizar el TET atravesando las cuerdas vocales para evitar una falsa intubación en el esófago. Se debe tener cuidado para evitar lesiones en las cuerdas vocales durante la intubación (es decir, el número de intentos de intubación debe limitarse a 5 y el TET no debe adelantarse si se encuentra resistencia).
  8. Una vez que se inserte el ETT, retire el introductor y conéctelo a un ventilador para animales pequeños. Observar la elevación simétrica del tórax para confirmar la correcta intubación endotraqueal. Los ajustes del ventilador deben ser de 100 a 105 respiraciones por minuto y la fracción de oxígeno inspirado del 100%. El volumen corriente es de 0,35 mL y la presión positiva al final de la espiración es de 1 cm H2O.
    NOTA: Asegúrese de que el tórax en lugar del abdomen esté subiendo, ya que la intubación esofágica accidental provocará la muerte si no se corrige rápidamente.
  9. Una vez que se haya confirmado que está en posición, asegure el ETT con una tira de 5 cm de cinta de seda de 1 pulgada alrededor de la nariz del ratón, asegurando un contacto adecuado con el ETT y la nariz para que el ETT no se deslice fuera de la boca (consulte la Figura 1B-C).
  10. Para mantener una anestesia adecuada durante toda la cirugía, administre isoflurano al 1%-1,5% en línea con el flujo de oxígeno.

2. Toracotomía

  1. Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho, con ambas patas delanteras pegadas a la esquina superior izquierda, la pata trasera derecha pegada a la esquina inferior izquierda y la pata trasera izquierda pegada a la esquina inferior derecha (consulte la Figura 2G para ver la cinta).
  2. Desinfectar con piel sobre el tórax izquierdo con al menos 3 rondas alternas de povidona yodada seguidas de la aplicación de alcohol al 70%.
  3. Realice una incisión en el4º espacio intercostal desde la línea axilar anterior hasta la línea axilar posterior, utilizando tijeras para abrir la piel suprayacente (véase la figura 2A). El4º espacio intercostal se encuentra aproximadamente 1 cm por debajo de la axila en la línea axilar media.
  4. Para minimizar la pérdida de sangre, coagule los vasos sanguíneos visibles dentro de las capas subcutáneas y musculares con una pluma de cauterización manual.
  5. Divida bruscamente los músculos dorsal ancho y serrato anterior con unas tijeras a lo largo de la incisión cutánea (véase la figura 2B).
  6. Con pinzas curvas finas, eleve cuidadosamente la4.ª costilla (teniendo cuidado de no lesionar el pulmón subyacente) y haga un corte preciso con unas tijeras finas justo por encima de la5.ª costilla para entrar en el4.º espacio intercostal (véase la figura 2C). Realizar la toracotomía por encima de la5ª costilla en lugar de por debajo de la4ª costilla para evitar lesionar el haz neurovascular intercostal.
  7. Una vez que se pierde la presión negativa de la cavidad pleural y el pulmón se retrae de la pared torácica, extienda la toracotomía anterior y posteriormente en el4º espacio intercostal justo por encima de la5ª costilla (ver figura 2D-E). Toda la longitud de la incisión debe ser lo suficientemente larga como para exponer todo el pulmón, generalmente ~ 1 cm.
    NOTA: El sangrado interno de la arteria mamaria puede ocurrir si la toracotomía se extiende demasiado hacia atrás; si se encuentra, debe cauterizarse para evitar una pérdida excesiva de sangre.
  8. Aplique dos retractores de nervaduras para abrir el espacio de la nervadura, permitiendo una ventana de trabajo de al menos 1cm2 para una visualización adecuada (consulte la Figura 2F-G).

3. Aplicación de pinza hiliar

  1. Con aplicadores de dos puntas con punta de algodón, movilice el pulmón izquierdo elevándolo cefálico y luego dividiendo bruscamente el ligamento pulmonar inferior translúcido (véase la figura 3A-B).
    NOTA: Si esto es difícil de realizar sin desgarrar el pulmón, el ligamento pulmonar inferior también se puede dividir bruscamente con tijeras finas.
  2. Refleja el pulmón anteriormente para que se pueda visualizar el hilio pulmonar izquierdo posterior. Corte un trozo de corbata de seda 6-0 a ~10 cm y coloque el punto medio de esta corbata posterior al hilio (ver Figura 3C).
  3. A continuación, voltee el pulmón izquierdo hacia atrás para colocarlo sobre la atadura y tire de ambos extremos de la atadura hacia delante (véase la figura 3D).
  4. Con los dos extremos libres (A y B) de la corbata, ame un nudo corredizo reversible con pinzas y una pinza antimosquitos curvada. Véase la descripción detallada en los pasos 3.4.1 y 3.4.2. El tiempo isquémico caliente comienza con el atado del nudo corredizo. El pulmón izquierdo ya no debería inflarse con cada respiración del ventilador una vez que se ata el nudo. Debe volverse de color blanco pálido, lo que implica el cese de la perfusión.
    NOTA: Se debe tener cuidado para asegurarse de que el nudo se asiente en el medio del hilio, evitando atrapar inadvertidamente la aurícula izquierda centralmente y el parénquima pulmonar lateralmente (ver Figura 3F).
    1. Con la pinza en la mano dominante y las pinzas en la mano no dominante, sujete el extremo de A con pinzas y enrolle el punto medio de A alrededor de la pinza cerrada una vez (véase la figura 3E).
    2. Agarre el punto medio de B con la abrazadera y tire con ambas manos para sujetar el nudo corredizo. No dejes que el extremo de B atraviese el nudo, lo que haría que el nudo fuera irreversible. Después de atar el nudo, B debe tener un lazo que emane del nudo, mientras que A debe ser recto (ver Figura 3F). El nudo se puede soltar tirando del extremo de B.
  5. Confirme la oclusión adecuada del bronquio ocluyendo manualmente el tubo de salida del TET al ventilador, lo que debería hacer que el pulmón izquierdo no se infle (véase la figura 3G). La oclusión vascular se asume con oclusión bronquial dada la mayor colapsabilidad de la arteria y las venas pulmonares en comparación con el bronquio cartilaginoso.
  6. Después de la aplicación de la pinza hiliare, cierre la incisión cutánea con una simple puntada interrumpida utilizando sutura de nailon 6-0, para minimizar las pérdidas insensibles de líquido durante el período de isquemia caliente.

4. Liberación de la pinza hiiar

  1. Después del período deseado de isquemia caliente, suelte el nudo corredizo tirando suavemente del extremo libre corto de la corbata de seda (B de la Figura 3F y el paso 3.4). Inicie el tiempo de reperfusión al soltar el nudo corredizo.
    NOTA: Después de la liberación de la atadura, la ventilación pulmonar puede confirmarse mediante una oclusión manual nuevamente del flujo de salida del TET, lo que ahora debería causar la expansión del pulmón izquierdo. Una vez más, la perfusión está implícita en la insuflación del pulmón, sin embargo, también puede confirmarse por el enrojecimiento del pulmón (véase la figura 4A).
  2. Durante el período de reperfusión, cierre el tórax en tres capas para minimizar las pérdidas insensibles. Primero, cierre el espacio de la4ª costilla con un solo punto con sutura de nailon 6-0, con un bocado justo por encima de la4ª costilla y un bocado justo por encima de la6ª costilla (véase la Figura 4B-C). Úntelo a la máxima inflación pulmonar, para minimizar el riesgo de un neumotórax iatrogénico (ver Figura 4D-E).
  3. A continuación, cierra la capa muscular con un simple punto corrido con sutura de nailon 6-0.
  4. Finalmente, cierre la incisión en la piel con una sutura interrumpida simple con sutura de nailon 6-0 (véase la figura 4F). Evite colocar puntos de sutura en la piel debido al riesgo de que los animales despiertos hurguen en su incisión y provoquen una dehiscencia completa de la herida.
  5. A partir de este punto, el pulmón se puede extraer directamente al final del tiempo de reperfusión deseado. Si se desea la evaluación de ABG, consulte el paso 5. Si se desea una inyección intravenosa adicional antes del sacrificio, consulte el paso 6. Se trata de una cirugía terminal.
  6. Si se pretende que el tiempo de reperfusión sea superior a un par de horas, apague el isoflurano para permitir que el ratón se despierte de la anestesia y se extubar. Los criterios de extubación incluyen espasmos con pellizco de la pata y respiraciones y movimientos espontáneos. Despertar a un ratón de la anestesia con ketamina e isoflurano suele tardar entre 30 y 45 minutos. Se trata de una cirugía de supervivencia.
    1. Para la cirugía de supervivencia, inyecte 1 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para compensar las pérdidas de líquido de la cirugía. Inyecte buprenorfina (dosis de 0,05 a 0,1 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea antes de la cirugía para controlar el dolor. Repita la anestesia cada 4-6 h durante al menos 3 días después de la cirugía. Considere la posibilidad de colocar un bloqueo de bupivacaína a lo largo de la incisión para controlar el dolor de manera adicional.

5. Evaluación ABG

NOTA: Si se desea la medición de la presión arterial arterial, lo mejor es obtenerla mediante aspiración de sangre arterial desde el ventrículo izquierdo. Para cerciorarse de que la GA refleja solamente la función pulmonar izquierda, esta sangre arterial debe obtenerse después de unos 4 min de pinzamiento del hilio derecho22,23, tiempo durante el cual sólo el pulmón izquierdo realiza la oxigenación y ventilación.

  1. Si el ratón ha sido despertado de la anestesia después de la pinza hiilar, vuelva a anestesiar e intubar al ratón de acuerdo con el paso 1.
  2. Unos 15-20 minutos antes del final del tiempo de reperfusión deseado, coloque el ratón en decúbito supino, asegurando las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
    NOTA: Se debe asignar suficiente tiempo para realizar los siguientes pasos antes del final de la reperfusión. El momento específico para abrir el abdomen y el tórax variará según el cirujano y su experiencia.
  3. Realizar laparotomía de la línea media desde el hueso púbico hasta el xifoides, incidiendo con tijeras la piel seguida de la pared abdominal a lo largo de la línea alba (ver figura 5A-B).
  4. En la xifoides, extender la laparotomía de izquierda a derecha hasta la línea axilar anterior, siguiendo la curva de la costilla más inferior (ver Figura 5C).
  5. Desde el abdomen, haga una incisión en el diafragma anterior en la línea media para entrar en el tórax, teniendo cuidado de no profundizar demasiado para evitar lesionar el corazón (véase la figura 5D-E). Luego, extienda la incisión del diafragma anterior hacia la izquierda y hacia la derecha hasta la línea axilar anterior, a lo largo de la costilla más inferior (vea la línea punteada blanca en la Figura 5D).
  6. Divida las costillas bilaterales a lo largo de la línea axilar anterior, extendiéndose hacia arriba hacia la axila, para crear una toracotomía en forma de concha. Luego, refleje la pared torácica anterior (esternón y costillas anteriores bilaterales) cefálica, lo que permite la exposición completa del corazón y los pulmones bilaterales (ver líneas punteadas blancas en la Figura 5F).
  7. Aplique una pinza en la pared torácica anterior que está volteada para facilitar la retracción. Retraiga el diafragma hacia abajo con una pinza antimosquitos curvada en la línea media para mejorar la visualización del tórax (véase la figura 5F).
  8. Para movilizar completamente el pulmón derecho (que tiene 4 lóbulos), regrese el lóbulo accesorio que se extiende más allá de la línea media hacia el tórax izquierdo y vuelva al tórax derecho (véase la figura 5G-H). Hay un ligamento delgado que une este lóbulo al pecho izquierdo: divídalo sin rodeos con aplicadores con punta de algodón o bruscamente con tijeras.
    NOTA: Este lóbulo accesorio cruza la línea media posterior a la vena cava inferior (VCI), por lo que se debe tener cuidado de no lesionar la VCI durante esta maniobra.
  9. Una vez que todos los lóbulos hayan regresado al tórax derecho, refleje todo el pulmón derecho anteriormente y coloque otra corbata de seda 6-0 (cortada a ~ 10 cm) posterior al hilio derecho. Luego, vuelva a colocar el pulmón derecho en el tórax sobre la corbata.
  10. Ata otro nudo corredizo alrededor del hilio derecho usando la misma técnica que se describe en el paso 3.4, teniendo cuidado de rodear los cuatro lóbulos del pulmón derecho. Este paso de pinza hiliar derecha debe programarse para que sea aproximadamente 4 minutos antes del final de la reperfusión.
  11. Cubra una aguja 31G de 1/2 pulgada en una jeringa de tuberculina de 1 cc con aproximadamente 200 μL de heparina 1000 unidades/mL. Para hacer esto, aumente el volumen de heparina y tire repetidamente del émbolo hacia adelante y hacia atrás 3-4 veces para permitir que la heparina cubra todo el interior de la jeringa. Esto se hace para minimizar el riesgo de coagulación de la sangre aspirada durante el transporte desde la estación quirúrgica hasta la máquina ABG.
  12. Después de 4 min de pinzamiento del hiliar derecho, aspire la sangre arterial del ventrículo izquierdo a la jeringa recubierta de heparina (véase la figura 5I). Tenga cuidado de evitar perforar el tabique ventricular y aspirar inadvertidamente sangre venosa del ventrículo derecho. Hay una clara diferencia de color entre el ventrículo derecho más oscuro y el ventrículo izquierdo más brillante (véase el recuadro de la Figura 5I). Inclina la aguja hacia el cuello izquierdo. Es posible que se requieran múltiples punciones para obtener suficiente sangre para ejecutar un ABG (~ 150 μL).
    NOTA: Durante los 4 minutos de pinzamiento del hilar derecho, el ratón puede comenzar a exhibir una respiración agónica que anuncia la muerte inminente. Si esto ocurre, la sangre arterial debe aspirarse rápidamente antes de un paro cardíaco. No es posible aspirar sangre de un corazón que no late.
  13. Ejecute la sangre arterial en una máquina de ABG para obtener la saturación de oxígeno, la presión parcial de oxígeno, la presión parcial de dióxido de carbono, entre otras mediciones. Eutanasiar al ratón después de la recolección de ABG y/o el tratamiento con anticuerpos (ver paso 6).

6. Inyección intravenosa de anticuerpos para la medición de la extravasación celular

NOTA: Esta técnica se puede utilizar para determinar la extravasación celular a través de la inyección de anticuerpos marcados con fluorocromo por vía intravenosa en la VCI antes del sacrificio, seguido de un análisis de citometría de flujo, como se publicó anteriormente18. En resumen, los neutrófilos intravasculares se pueden distinguir de los neutrófilos intersticiales utilizando anticuerpos anti-Ly6G específicos de neutrófilos. El anti-Ly6G (clon 1A8) marcado con isotiocianato de fluoresceína (marcado con FITC) se inyecta por vía intravenosa 5 minutos antes del sacrificio, lo que marca los neutrófilos intravasculares circulantes. La concentración del anticuerpo FITC-Ly6G utilizada es de 100 ng diluidos en 200 μL de solución salina tamponada con fosfato. Luego, después de la preparación de la suspensión unicelular del pulmón izquierdo para la citometría de flujo, todos los neutrófilos se marcan con aloficocianina (marcado con APC) anti-Ly6G (clon 1A8). Así, los neutrófilos APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ son intravasculares, mientras que los APC-Ly6G+FITC-Ly6G- son extravasculares o intersticiales. Esta técnica se puede adaptar a monocitos con anticuerpos anti-Ly6C, células B con anticuerpos anti-CD19, por ejemplo.

  1. Cargue el anticuerpo deseado en una jeringa de 3/10 cc con aguja 31G de 5/16 de pulgada, teniendo cuidado de minimizar las burbujas de aire dentro de la jeringa. Utilícelo para la inyección intravenosa en la VCI en el paso 6.5.
  2. Realice la laparotomía de acuerdo con los pasos 5.3-5.4.
  3. Después de la laparotomía, realice la rotación visceral medial derecha de forma contundente con dos aplicadores puntiagudos con punta de algodón. En un ratón, esto se hace eviscerando todo el intestino a la izquierda del abdomen, lo que permitirá una visión clara de la VCI (véase la figura 6A).
  4. Limpie la grasa que recubre la VCI sin rodeos con aplicadores con punta de algodón.
  5. Inyectar la solución de anticuerpos en la VCI mediante venopunción (véase la figura 6B). Tras la extracción de la aguja, aplique inmediatamente una presión suave con un bastoncillo de algodón en el sitio de la venopunción hasta que quede hemostática (generalmente alrededor de 2-3 minutos).
  6. Regrese el intestino eviscerado al abdomen sobre el hisopo de algodón para continuar aplicando presión sobre la VCI (véase la figura 6C).
  7. Realice la toracotomía en forma de concha de acuerdo con los pasos 5.5-5.7 para extraer el pulmón izquierdo. Permita que los anticuerpos tengan al menos 5 minutos para circular sistémicamente antes del sacrificio y la cosecha. Sacrificar al ratón después de la recolección de ABG y/o el tratamiento con anticuerpos.

7. Tinción histológica (H&E)

  1. Después de la fijación en formol y la inclusión en parafina del pulmón izquierdo y la sección hasta un espesor de 5 μm, desparafinar el portaobjetos en xileno (dos lavados de 10 minutos).
  2. Deshidratar en lavados secuenciales con etanol: 2 lavados de 5 minutos con 100%, 1 lavado de 2 minutos con 95% y 1 lavado de 2 minutos con etanol al 70%. Luego, enjuague con agua desionizada.
  3. Tiñe el portaobjetos con hematoxilina durante 2-4 minutos, luego lávalo con agua desionizada durante 5 minutos o hasta que salga limpio. La duración precisa de la tinción con hematoxilina deberá optimizarse según el tejido y la intensidad de tinción nuclear deseada.
  4. Lavar en solución definitoria durante 30 s para diferenciar las manchas, luego lavar con agua durante 2 min. Lavar en solución formadora de color azul durante 30 s, luego lavar en agua durante 2 min.
  5. Deshidrate aún más sumergiendo en etanol al 95% 15x. Teñir en eosina durante 1 min.
  6. Deshidratar con 2 minutos de lavado con etanol (2x), seguido de 2 min de lavados con xileno (2x). Aplique los medios de montaje y el cubreobjetos.

Resultados

Después del pinzamiento hiliar izquierdo, la presión parcial de oxigenación en la sangre arterial (PaO2) atribuida al pulmón izquierdo es de ~100 mmHg, significativamente menor en comparación con los ~500 mmHg después de la toracotomía simulada (Figura 7A, n = 6-7). Cabe destacar que se realizaron toracotomías simuladas en ratones B6 con medición de la GAB tomada después de 4 min de pinzamiento hiliar derecho, lo que representa valores atribuidos solo al pulmón izquierdo. La tinción con H&E del pulmón izquierdo pinzado hiliar demostró la infiltración de células inflamatorias que llenan las vías respiratorias y la congestión de los vasos sanguíneos con eritrocitos, mientras que estos hallazgos están ausentes en el pulmón izquierdo ingenuo (Figura 7B, n = 2). Estos resultados demuestran la lesión tisular inmediata y la infiltración celular después de un período de isquemia y reperfusión.

Como se discutió en el paso 6, los neutrófilos intravasculares e intersticiales se pueden diferenciar con la inyección intravenosa de anticuerpos anti-Ly6G marcados con FITC 5 min antes del sacrificio, seguida del marcaje de todos los neutrófilos con anticuerpos APC-Ly6G18,24. Los gráficos representativos muestran que ~75% de los neutrófilos son intravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) y ~25% son intersticiales (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) después del pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo (Figura 7C, n=4). Estos resultados demuestran una forma fiable de evaluar la extravasación de neutrófilos y pueden adaptarse a otros tipos de células en función de los anticuerpos utilizados (es decir, anti-Ly6C para los monocitos, anti-CD19 para las células B). Esta técnica es útil para el estudio de la dinámica celular después de la IRI.

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Figura 1: Intubación del ratón. (A) Ratón con el pecho izquierdo y el abdomen afeitados. (B) Tubo endotraqueal conectado al tubo del ventilador. (C) Una vez confirmada la intubación, pegue el tubo circunferencialmente a la nariz del ratón. (D) Ratón intubado con tubo de entrada y salida desde y hacia el ventilador para animales pequeños. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Toracotomía izquierda. (A) Incisión en la piel sobre el4º espacio intercostal (CSI). (B) Capas musculares divididas en el4º espacio intercostal. (C) Hacer una pequeña incisión justo por encimade la 5ª costilla. (D) Extensión de la incisión anterior y posterior en el4º ICS. (E) Pulmón visualizado en4º ICS. (De F a G) Retractores de costillas colocados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Pinza hiliar izquierda. (A) Pulmón izquierdo movilizado con hisopos de algodón. (B) Ligamento pulmonar inferior (IPL) visualizado. (C) Con el pulmón izquierdo volteado hacia atrás, la corbata de seda se coloca posterior al hilio. (D) Con la izquierda volteada posteriormente sobre el lazo de seda, se visualiza el hilio anterior. (E) Amarre instrumental de un nudo corredizo sobre el hilio izquierdo. (F) Nudo corredizo en hilio. (G) Con la oclusión manual del flujo de salida, el pulmón izquierdo no se infla, lo que indica un pinzamiento hiliar exitoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Liberación de la pinza hiiar izquierda y cierre del tórax izquierdo. (A) Con el nudo corredizo suelto, el pulmón izquierdo se vuelve a inflar. (B) Cierre de costilla con un bocado justo por encimade la 4ª costilla y (C) un bocado justo por encimade la 6ª costilla. (D-E) Pecho cerrado con un punto atado en el extremo de la inspiración. (F) Cierre de la piel con puntos interrumpidos (después del cierre de la capa muscular con puntos corridos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Laparotomía, toracotomía bilateral en forma de concha y extracción de sangre arterial. (A) Ratón ajustado a posición supina. (B) Incisión en la piel sobre la línea media del abdomen. (C) Laparotomía que se extiende desde el xifoides hasta el pubis, con extensión hacia la izquierda y hacia la derecha a lo largo de la costilla más inferior. (D-E) Apertura del diafragma para entrar en la cavidad torácica, con extensión de la incisión del diafragma hacia la izquierda y hacia la derecha a lo largo de la costilla más inferior (línea punteada). (F) Toracotomía bilateral con incisiones en las líneas axilares anteriores (línea punteada) hacia el ápice del tórax. (G) Lóbulo accesorio del pulmón derecho que se extiende hacia el tórax izquierdo posterior a la vena cava inferior. (H) Lóbulo accesorio movilizado y devuelto al tórax derecho. (I) Aspiración de sangre arterial desde el ventrículo izquierdo (recuadro: diferencia de color entre los ventrículos derecho e izquierdo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Inyección intravenosa en la vena cava inferior. (A) Rotación visceral medial derecha para exponer la vena cava inferior (VCI). (B) Inyección de solución en IVC. (C) Aplicar presión sobre la VCI para lograr la hemostasia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-7
Figura 7: Resultados representativos de la oxigenación pulmonar, histología y extravasación de neutrófilos después de la pinza hiliar izquierda. (A) Presión parcial de oxígeno en la sangre arterial de un ratón C57BL/6 que se sometió a una toracotomía simulada frente a una pinza hiilar. Los resultados se presentan como media ± SEM, n=6-7. Valores de p calculados por la prueba U de Mann-Whitney. **P <0,01. (B) Tinción de H&E de una sección pulmonar fijada en formol e incluida en parafina de un ratón C57BL/6 que se sometió a una toracotomía simulada frente a una pinza hiliare. La barra de escala representa 250 μm. (C) Figura representativa de la distribución de neutrófilos Ly6G+FITC-Ly6G+extravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) Ly6G+ extravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) en un ratón C57BL/6 tras pinza hiliar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Introductor para tubo endotraqueal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Describimos una técnica de pinzamiento hiliar que consiste en la aplicación de un nudo corredizo en el hilio izquierdo que ocluye la arteria pulmonar y las venas y bronquios para inducir isquemia caliente seguida de reperfusión. Después del pinzamiento hiliar, se puede extraer el pulmón izquierdo para una variedad de técnicas experimentales como histología, citometría de flujo, secuenciación masiva o de una sola célula y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Además, la sangre y el bazo pueden utilizarse para estudiar los efectos sistémicos, mientras que el pulmón derecho no isquémico puede servir como control interno. En este protocolo, también describimos métodos detallados para obtener mediciones de ABG y/o determinar la extravasación celular.

La técnica de pinzamiento hiliar murino es fundamental para el estudio de la IRI pulmonar y para el campo más amplio del trasplante pulmonar. Por ejemplo, utilizando este modelo de pinza hiliar, nuestro grupo descubrió que los monocitos clásicos CCR2+ derivados del bazo median la extravasación de neutrófilos al pulmón después de IRI18. Otro grupo demostró que las células epiteliales alveolares tipo II producen CXCL1 (un quimioatrayente de neutrófilos) de una manera dependiente de la NADPH oxidasa-IL-17-TNFα utilizando un modelo de pinza hiliar19. Se encontró que TLR4 desempeña un papel en el desarrollo de edema en un modelo murino de pinzamiento hiliar20.

Si bien el trasplante ortotópico de pulmón murino es más aplicable clínicamente y puede simular isquemia tanto caliente como fría, también introduce trauma quirúrgico por anastomosis vasculares y bronquiales y estímulos alogénicos por incompatibilidad donante-receptor. Por lo tanto, la principal ventaja de la técnica de pinzamiento hiliar es su capacidad para aislar los efectos de la IRI pulmonar de estos otros factores. Además, para el microcirujano de ratón sin experiencia, el procedimiento de pinza hiliar es técnicamente menos exigente y se puede dominar más rápidamente en comparación con el trasplante de pulmón. Una limitación del modelo de pinza hiliar es que la isquemia fría es difícil de lograr. La isquemia fría in situ se ha realizado en cerdos con perfusión al ras anterógrada a través de la arteria pulmonar izquierda25, sin embargo, esto es mucho más desafiante en el ratón debido a su menor tamaño y la necesidad de mantener la normotermia durante la cirugía. Sin embargo, el estudio de la isquemia caliente aislada es importante, ya que generalmente es más deletérea para la función orgánica que la isquemia fría 4,5,6. Además, los centros de trasplante están adoptando cada vez más los trasplantes de pulmón con DCD, que se acompañan de tiempos isquémicos cálidos mucho más largos que los trasplantes de pulmón con DBD tradicionales7. Por lo tanto, el estudio detallado de los eventos durante la isquemia caliente y el posterior período de reperfusión es crítico y se puede lograr con este modelo de pinza hiliare.

En las últimas dos décadas se han creado muchas variaciones de la técnica de pinzamiento hiliare. Estos incluyen el uso de una pinza microvascular atraumática 8,9,10,11,12,13, un torniquete de Rumel 14,15 y una corbata con un nudo corredizo alrededor del hilio16. Describimos nuestra adaptación de la técnica del nudo corredizo en ratones. La principal ventaja que tiene esta técnica sobre otras técnicas de pinzamiento hiliar es que permite el cierre del tórax durante el período de isquemia, lo que minimiza las pérdidas insensibles de líquido, particularmente en protocolos con períodos más largos de isquemia. Esto no se puede lograr cuando se coloca una pinza o un torniquete en el hilio.

En cuanto a la selección de animales, se optó por desarrollar este modelo en ratón en lugar de en ratas o modelos de animales grandes, como el cerdo. El razonamiento es doble: nuestro laboratorio tiene una amplia experiencia en microcirugía de ratón con trasplante ortotópico de pulmón de ratón17. En segundo lugar, si bien los ratones son más pequeños y técnicamente más difíciles de operar que las ratas, actualmente hay más cepas de ratones transgénicos disponibles comercialmente que cepas de ratas26,27. Los ratones también se reproducen más rápidamente, lo que permite un desarrollo más rápido de nuevas cepas, lo que es particularmente útil cuando se investigan los mecanismos inmunológicos de la IRI. Por estos motivos, hemos optado por desarrollar esta técnica en ratones.

Hasta donde sabemos, este es el primer artículo basado en video que utiliza la técnica de pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo en ratón con un nudo corredizo. Saito et al han publicado un artículo basado en vídeo que demuestra el pinzamiento hiliar en ratas utilizando un pinzamiento microvascular22. En ratón, Liao et al publicaron un modelo IRI pulmonar con pinzamiento de la arteria pulmonar (AP) con un nudo corredizo, sin embargo, el pulmón permanece ventilado en este modelo ya que el bronquio está excluido de la pinza28. La técnica de pinzamiento por AP se ha utilizado como modelo para estudiar la embolia pulmonar29, la hipertensión pulmonar y/o el fallo ventricular derecho30,31. Dado que el área de estudio es la IRI pulmonar en el trasplante, optamos por pinzar todo el hilio, incluido el bronquio, para minimizar el barotrauma además de la lesión isquémica.

Cabe destacar que se eligieron 30 min de isquemia tibia seguida de 1 h de reperfusión porque estamos interesados en la dinámica de las células infiltrantes pulmonares en el período muy temprano post-IRI. Por ejemplo, los estudios han reportado una regulación positiva de los genes citoprotectores, como la hemo oxigenasa 1, después de solo 30 minutos de isquemia seguidos de 2 h de reperfusión13. Anteriormente se pensaba que los neutrófilos eran el tipo de célula central que infiltraba el pulmón después de IRI32, sin embargo, demostramos que los monocitos preceden a los neutrófilos en su llegada al pulmón18,24. Más recientemente, descubrimos que las células B preceden incluso a los monocitos y entran en el pulmón dentro de 1 h después de la reperfusión (datos no publicados). Al adaptar esta técnica, las duraciones de la isquemia caliente y la reperfusión se pueden ajustar de acuerdo con la pregunta y la hipótesis del estudio. Es posible que se produzcan períodos más largos de isquemia caliente sin preocuparse por la pérdida excesiva de líquido y calor, ya que el tórax puede cerrarse durante este período.

Varias complicaciones pueden ocurrir perioperatoriamente, y el resultado final común es la muerte perioperatoria. Hemos observado que la incidencia de muerte de animales durante la cirugía disminuye con las repeticiones de la técnica por parte del cirujano. Estimamos que los cirujanos requieren al menos 2 meses de práctica y/o al menos 20 casos para alcanzar una meseta en habilidad. En este punto, estimamos que la mortalidad intraoperatoria ocurre en aproximadamente 1 de cada 50 casos. La muerte en el ratón anestesiado a menudo es anunciada por respiraciones agónicas que involucran contracciones forzadas del diafragma y la musculatura de la pared torácica. Al inicio de estas respiraciones agónicas, la muerte ocurrirá en 3-5 minutos si no se toma ninguna intervención. Hay varias causas que pueden precipitar la muerte intraoperatoria, muchas de las cuales son reconocibles y prevenibles. Destacaremos a continuación los pasos críticos de esta cirugía y las técnicas de solución de problemas para lograr un resultado exitoso.

Intubación
El primer paso crítico es la intubación cuidadosa y la fijación de las vías respiratorias para evitar la extubación inadvertida. En una cirugía de supervivencia, es particularmente importante asegurarse de que las cuerdas vocales no se dañen durante la intubación inicial, ya que el ratón no podrá respirar después de la extubación. El avance del TET más allá de los cordones debe realizarse bajo visualización directa a través del microscopio. Si se encuentra resistencia durante la intubación, el TET no debe avanzarse a ciegas. Al mantener la orofaringe abierta con la pinza antimosquitos, se debe tener cuidado de no perforar la mucosa oral, ya que la sangre oscurecerá la vista de las vías respiratorias. El número de intentos de intubación debe limitarse a menos de cinco.

Extubación accidental
Si en algún momento durante el procedimiento, los pulmones no parecen estar inflándose adecuadamente, es posible que el tumor se haya desplazado. Otra manifestación de la extubación accidental que pasa desapercibida durante un período prolongado es el desarrollo repentino de la respiración agónica del ratón. Después de la intubación inicial, se debe tener cuidado de asegurar bien el TET a la nariz circunferencialmente con cinta de seda, y se debe limitar el ajuste del cuello y el torso del ratón. Si ni el pulmón izquierdo ni el derecho se inflan, es posible que el tumor se haya salido de la tráquea. Se pueden hacer intentos para empujar el TET hacia adentro, sin embargo, es posible que sea necesario volver a intubar al ratón de manera rápida para evitar la muerte prematura del animal. Si solo un pulmón se está inflando cuando se espera que ambos lo hagan, el TET puede ser demasiado profundo y debe retirarse con cuidado y volver a asegurarse.

Movilización pulmonar
La movilización del pulmón izquierdo debe realizarse con aplicadores con punta de algodón con una presión suave sobre el parénquima pulmonar, ya que la lesión por compresión puede dañar los alvéolos y disminuir la distensibilidad del pulmón. Los pulmones no deben agarrarse con fórceps o pinzas, ya que esto dañará el parénquima pulmonar.

Aplicación de pinza hiliar
La pinza hiliar izquierda debe colocarse bajo visualización directa, teniendo cuidado de no colocar el nudo demasiado central (para no atrapar la aurícula izquierda) o demasiado periférico (para no atrapar ningún parénquima pulmonar). Atrapar la aurícula izquierda con la pinza hiiar probablemente precipitará la fibrilación auricular y la posterior muerte. La visualización del hilio se puede mejorar asegurando una retracción adecuada de las costillas para ampliar el campo de visión. Después de atar el nudo corredizo, es útil asegurarse de que la pinza sea completamente oclusiva realizando una maniobra de reclutamiento, ocluyendo manualmente el tubo de salida que conecta el ETT con el ventilador y asegurándose de que el pulmón izquierdo no se expanda con presión positiva. Se presume oclusión vascular con confirmación de oclusión bronquial, dada la mayor colapsabilidad de la arteria y las venas pulmonares en comparación con el bronquio cartilaginoso. Además, la pinza hiliar no debe atarse con una fuerza excesiva, ya que aplastará las partes cartilaginosas del bronquio del tronco principal izquierdo y evitará la expansión del pulmón izquierdo tras la liberación de la pinza hiliare. Una vez que se libera la pinza hiilar, es importante comprobar que el pulmón aún puede ventilarse realizando otra maniobra de reclutamiento.

Cierre de pecho
Al cerrar el tórax, la4ª y5ª costillas deben juntarse cuando el pulmón está en su máxima inspiración. Esto minimizará la cantidad de aire que queda en la cavidad pleural, lo que resultaría en un neumotórax una vez que las costillas estén cerradas. Las capas musculares y la piel deben cerrarse herméticamente para evitar el desarrollo de neumotórax a tensión.

Obtención de ABG
Por último, al obtener la GA, es importante pinzar primero el hilio derecho para que la medición de la GA refleje únicamente la función pulmonar izquierda 22,23. Sin la pinza hiliares derecha, el pulmón derecho que normalmente ventila compensará con creces el pulmón izquierdo isquémico dañado y las mediciones de la glucea arterial parecerán normales.

En resumen, la técnica de pinzamiento hiliar que describimos anteriormente es una herramienta valiosa para el estudio del trasplante pulmonar y, lo que es más importante, puede aislar el estudio de la IRI caliente sin la introducción de alogenicidad, trauma relacionado con la anastomosis quirúrgica o almacenamiento isquémico frío. En particular, esta técnica descrita de pinzamiento hiliar es fácil de enseñar y ampliamente adoptable, y puede conducir a resultados confiables y reproducibles.

Divulgaciones

Los autores no informan de ninguna divulgación relevante.

Agradecimientos

Este trabajo no recibió ninguna subvención específica de ninguna agencia de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medicamentos
10% de povidona yodadaAplicareNDC 52380-0126-2Para desinfectante
Buprenorfina 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Para el control del dolor
CarprofenoCronus PharmaNDC 69043-027-18Para el control del dolor
Heparina 1000 unidades/mLSagentNDC 25021-404-01Para la obtención de sangre arterial
Isoflurano 1%-1.5%Sigma Aldrich26675-46-7Para anestesia
Clorhidrato de ketamina 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Para anestesia
Puralube Vet ungüento ocularMedi-Vet.com11897Para prevenir la desecación ocular
Xilacina 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Para el control del dolor
Herramientas e instrumentos
cauterización de punta fina de alta temperaturaMcKesson231Para coagular los vasos sanguíneos
Pinza antimosquitos curvadaFine Science Tools13009-12Para procedimientos quirúrgicos
Pinzas curvas finasFine Science Tools11274-20Para cirugía procedimiento
Tijeras finasFine Science Tools15040-11Para procedimiento quirúrgico
Configuración de pinza de intubaciónFine Science Tools18374-44, 18144-30Para sujetar al ratón verticalmente por la lengua durante la intubación. Véase la figura complementaria 1A.
Retractores magnéticos de costillasFine Science Tools18200-01, 18200-10Para la retracción de la toracotomía. El fijador magnético y el retractor deben estar conectados por un tubo de microlátex que se encuentra debajo.
Fibra óptica de plástico de grado óptico sin camisa, 500 μ mEdmund Optics02-532Para hacer el introductor del tubo endotraqueal. Vea la Figura Suplementaria 1B. Una longitud de 1.5 pulgadas de esta fibra óptica debe tener un trozo de cinta de seda asegurado a un extremo. A continuación, se puede utilizar como introductor del tubo endotraqueal. El extremo del introductor debe ser ligeramente curvado.
Power Pro Ultra maquinillaOster078400-020-001Para cortar el pelo
TijerasFine Science Tools14370-22Para procedimiento quirúrgico
Almohadilla térmica para animales pequeñosK& H Pet ProductsAlmohadilla térmica Thermo-PeepPara mantener la normotermia
Ventilador para animales pequeñosHarvard Apparatus55-0000Para ventilación (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Látex Tubo de caucho (1/8 de pulgada de diámetro exterior, 1/16 de pulgada de diámetro interior)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Para la retracción de toracotomía
Stat Profile Prime Analizador de gases en sangre para cuidados críticosNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		Para la retracción de la toracotomía
Pinza rectaFine Science Tools13008-12Para procedimientos quirúrgicos
Pinzas rectasFine Science Tools91113-10Para procedimientos quirúrgicos
Microscopio quirúrgicoWild Heerbruggya no sefabrica Para intubación y procedimientos quirúrgicos; recomendar su sustitución por microscopios quirúrgicos Leica
Supplies
½ jeringa cc con agujaMcKesson 942665 McKessonpara inyectar ketamina / xilacina intraperitonealmente
½ aguja de 31G pulgadas en una jeringa de tuberculina de 1 ccMcKesson16-SNT1C2705Para la aspiración de sangre arterial desde el ventrículo izquierdo
Catéter intravenoso de 1 pulgada y 20 GTerumo SROX2025CAPara tubo endotraqueal (ETT)
seda de 1 pulgada cintaDurapore3M ID 7100057168Para pegar ETT a la nariz y asegurar las extremidades
Jeringa de 3/10 cc con aguja 31G de 5/16 pulgadasMcKesson102-SN310C31516PPara inyección de anticuerpos en la vena cava inferior
6-0 sutura monofilamento en una aguja P-10McKessonS697GXPara el cierre de la toracotomía, la capa muscular y la piel
Corbata de seda 6-0Especialidades Quirúrgicas LookSP102Para hacer nudo corredizo para pinza hiliar
Aplicadores puntiagudos con punta de algodónSolon56225Para manipular el pulmón y para la disección roma
Argent Pluma de de 12 pulgadas

Referencias

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Reimpresiones y permisos

Erratum


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

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