Artículo de método

Cuantificación rápida de formas oxidadas y reducidas de glutatión utilizando orto-ftalaldehído en células de mamífero cultivadas in vitro

DOI:

10.3791/66267

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28 de junio de 2024

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1School of Health and Life Sciences, Teesside University, 2Institute of Biochemical Chemistry, Biophysics, and Bioengineering, Heriot-Watt University

En este artículo

Resumen

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La cuantificación de las formas oxidadas y reducidas de glutatión (GSSG y GSH, respectivamente) se ha logrado mediante el uso de ortoftalaldehído (OPA). El OPA se vuelve altamente fluorescente una vez que se conjuga con GSH, pero no puede conjugar el GSSG hasta que se reduce. Aquí, describimos un ensayo multiparamétrico para cuantificar ambos utilizando la cuantificación de proteínas para la normalización.

Resumen

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El glutatión se ha considerado durante mucho tiempo un biomarcador clave para determinar la respuesta antioxidante de la célula. Por lo tanto, es un marcador primario para los estudios de especies reactivas de oxígeno. El método utiliza ortoftalaldehído (OPA) para cuantificar la concentración celular de glutatión(es). El OPA se conjuga con glutatión (GSH) reducido a través de la unión al sulfhidrilo para formar posteriormente un isoindol, lo que da como resultado un conjugado altamente fluorescente. Para lograr un resultado preciso tanto del glutatión oxidado (GSSG) como del GSH, se requiere una combinación de agentes enmascarantes y agentes reductores, que se han implementado en este protocolo. Los tratamientos también pueden afectar la viabilidad celular. Por lo tanto, la normalización a través del ensayo de proteínas se presenta en este ensayo multiparamétrico. El ensayo demuestra un rango de detección pseudolineal de 0,234 a 30 μM (R2 = 0,9932±0,007 (N = 12)) específico para GSH. El ensayo propuesto también permite la determinación de glutatión oxidado con la adición del agente enmascarante N-etilmaleimida para unirse al glutatión reducido, y se introduce el agente reductor tris(2-carboxietil) fosfina para escindir el enlace disulfuro en GSSG para producir dos moléculas de GSH. El ensayo se utiliza en combinación con un ensayo de ácido bicinconínico validado para la cuantificación de proteínas y un ensayo de adenilato quinasa para la evaluación de la citotoxicidad.

Introducción

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Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son un inductor primario del estrés oxidativo; El estrés oxidativo ha sido bien establecido en la generación de mutaciones en el ADN, envejecimiento/muerte celular, varios tipos de cáncer, diabetes, enfermedades neurológicas (como Parkinson y Alzheimer) y varias otras condiciones debilitantes de la vida 1,2,3,4,5. Una defensa clave contra las ROS son los antioxidantes tiólicos, no enzimáticos, que son capaces de reducir los oxidantes o radicales al actuar como donantes de protones 6,7. El glutatión (GSH) y la cisteína son los dos tioles más prevalentes encontrados en los mamíferos8, mientras que existen otros tioles de bajo peso molecular (como la ergotioneína), el GSH y la cisteína son los antioxidantes no enzimáticos más comúnmente medidos que se encuentran en la literatura 9,10,11 y tienen la mayor relevancia para combatir las ROS 8,12,13,14.

Cuando el GSH se utiliza como antioxidante, dos moléculas de GSH se unen covalentemente a través de un enlace disulfuro para producir disulfuro de glutatión (GSSG). El agotamiento de GSH se utiliza a menudo como indicador de estrés oxidativo15,16. Esta evaluación también puede combinarse con la detección de GSSG, aunque los aumentos de GSSG en las células a menudo están limitados por procesos activos de exportación, ya que GSSG puede ser relativamente reactivo en las células, lo que conduce a la formación de enlaces disulfuro con otros tioles proteicos16.

Los métodos tradicionales para medir GSH y GSSG no son procesos simples y requieren numerosos pasos, incluida la extracción celular con reactivos líticos17,18. El protocolo descrito aquí simplifica estos métodos y permite la medición precisa de tioles no enzimáticos y la normalización utilizando el contenido de proteínas celulares o la liberación de adenilato quinasa. Además, es posible medir la viabilidad celular antes de la extracción de GSH/GSSG. Varios métodos han intentado previamente identificar y cuantificar tioles no enzimáticos reducidos y oxidados de manera eficiente; métodos que incluyen el uso de HPLC 19,20,21, ensayo en placa (bioquímico)22,23,24,25, y que utilizan reactivos comunes para la conjugación de tiol, como el 5,5-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB/ reactivo de Ellman)19, monoclorobimana (mBCI)26,27,28 . Varias empresas también han preparado kits patentados para la detección de glutatión; sin embargo, no publican incompatibilidades de reactivos, lo que presenta problemas dependientes de los tratamientos utilizados29.

Este protocolo describe un ensayo multiparamétrico que detecta tioles reducidos (como GSH) a través de la conjugación de ortoftalaldehído (OPA) para producir una señal fluorescente detectable a 340/450 Ex/Em, respectivamente. Este ensayo facilita la detección de GSH y GSSG simultáneamente (en placa), mediante el uso de agentes enmascarantes (N-etilmaleimida) y agentes reductores de GSSG (tris(2-carboxietil) fosfina). Este protocolo de biomarcadores múltiples también brinda la oportunidad durante la etapa de lisis celular de cuantificar proteínas a través de un ensayo de ácido bicinconínico para la normalización de muestras al finalizar la medición final o mediante un ensayo de adenilato quinasa desde el medio celular. Este ensayo se puede realizar utilizando varios reactivos disponibles en la mayoría de los laboratorios y solo requiere unos pocos productos químicos poco comunes adicionales para realizarlo. El proceso es sencillo, accesible y se puede realizar sin etapas laboriosas en menos de 2 h.

En este protocolo, se eligieron varios nanomateriales que habían demostrado previamente que inducían ROS o que se sospechaba que inducían estrés oxidativo30,31. Se exploró un rango de concentración para ver los efectos de la exposición a estos nanomateriales en varias líneas celulares y la eficacia del ensayo en la cuantificación de tioles antioxidantes.

Protocolo

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NOTA: El siguiente protocolo ha sido diseñado con la capacidad de ser utilizado junto con un ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) y un ensayo de adenilato quinasa (AK) para normalizar las muestras a los tratamientos. Asegúrese de que el operador use la vestimenta adecuada y el equipo de seguridad necesario, como una bata de laboratorio Howie, guantes de nitrilo y gafas de seguridad de clase I, durante la preparación y el uso de los materiales. El protocolo se divide en varias etapas.

1. Preparación de existencias y soluciones de trabajo

  1. Prepare soluciones madre de 100 mM GSH estándar en 1 mM de HCl (preparadas a partir de 37% de HCl en agua bidestilada (ddH2O)).
    NOTA: Si diluye a partir de ácido altamente concentrado, como HCl al 37%, asegúrese de que el proceso correcto de adición de ácido al agua en una campana extractora de clase I.
  2. Prepare un stock de 22,35 mM de OPA en etanol absoluto. Realice este paso en una campana extractora de clase I. Prepare 25 mM de N-etilmaleimida (NEM) en ddH2O. Realice este paso en una campana extractora de clase I.
    NOTA: Estas tres soluciones pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 3 meses.
  3. Prepare 0,01 M de Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) a un volumen total de 500 μL, necesario para 100 pocillos. Prepare 100 μL de 1 mM de patrón GSH, diluido a partir de 100 mM de caldo utilizando ddH2O.
  4. Utilice tampón de lisis de inmunoprecipitación (IP) o la siguiente formulación: 394 mg de Tris-HCl (concentración final de 25 mM), 877 mg de NaCl (concentración final de 150 mM), 29 mg de EDTA (concentración final de 1 mM), 1 mL de NP-40 al 100% o IGEPAL CA-630 (concentración final de 1% V/V), 5 mL de glicerol (concentración final de 5% V/V), 84 mL de ddH2O. Mezcle los componentes agitando suavemente y ajuste el pH a 7,4. Decantar en un matraz aforado de 100 mL y añadir el volumen restante de ddH2O hasta alcanzar un volumen final de 100 mL. Filtre estérilmente a través de un filtro de 0,22 μm y almacene a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
    NOTA: Las soluciones de lisación actúan como contaminantes/interferentes en este ensayo; Por lo tanto, se especifican las formulaciones anteriores.
  5. Prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfato 0,1 M suplementada con ácido etilendiaminotetraacético (PBS-EDTA) a 3 valores de pH diferentes, concretamente 7,2, 8,5 y 9,0. Utilice un tampón comercial de 0,1 M de PBS suplementado con 1 mM de EDTA (292,24 mg/L) o la siguiente formulación de 10x (1 L): 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 800 mL de ddH2O. Añadir y mezclar; rellene hasta 1 L. Esterilizar en autoclave la solución para la esterilidad y almacenarla durante 12 meses a temperatura ambiente. A partir de la solución madre 10x, haga una solución de trabajo de PBS y compleméntela con EDTA (concentración como se indicó anteriormente).
    NOTA: El pH es de vital importancia; asegúrese de que el pH sea preciso antes de comenzar el protocolo.
  6. Realice una dilución en serie 1:2 de 1 mM de GSH utilizando ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM y 7,8125 μM). Añadir 10 μL de cada concentración a los pocillos estándar (realizado por duplicado). Las muestras se diluirán aún más en tampón de lisis; por lo tanto, las concentraciones serán 1/5 de su concentración original después (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM).
    NOTA: Las concentraciones finales para la calibración serán 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm y 234,4 nm.

2. Preparación del ensayo

NOTA: Este protocolo utiliza las líneas celulares humanas HepG2, A549 y J774, que se compraron comercialmente a ATCC. Estas líneas celulares se utilizaron bajo las pautas aprobadas descritas por las leyes y regulaciones de cultivo de animales y tejidos de la Universidad.

  1. A las 24 horas anteriores al inicio del ensayo, las células de siembra en las concentraciones indicadas en la Tabla 1; Sin embargo, dependiendo de la línea celular/tipo y tratamiento utilizado, ajuste la densidad según sea necesario. Cultive células en un medio de crecimiento completo (medio esencial modificado Eagles (EMEM) con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (HIFS), 1% de Penstrep (10,000 U/mL de penicilina/10 mg/mL de estreptomicina) y 1 % de aminoácidos no esenciales.
  2. Células de siembra utilizando métodos convencionales de siembra celular32. Células de semilla en placas completamente negras si no se utiliza microscopía posterior al ensayo. Evalúe la confluencia y el estado general de las células en el matraz T75 antes de usarlo mediante microscopía.
  3. En una cabina de seguridad biológica limpia, estéril y de clase II y siguiendo una estricta técnica aséptica, deseche los medios celulares, lave suavemente las células con ~ 15 ml de PBS estéril a temperatura ambiente (RT) y deséchelo.
  4. Al matraz de células, agregue 5 mL de tripsina estéril 1x, balancee suavemente para asegurar la cobertura de la monocapa celular y colóquelo en una incubadora a 37 °C durante 5 min para facilitar el desprendimiento de las células.
  5. Detener la tripsinización mediante la adición de un medio de crecimiento que contenga suero de ternero fetal inactivado por calor (10%), aproximadamente 10 mL.
  6. Transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 50 mL y granule a 200 x g durante 5 min. Deseche el medio y reemplácelo con 5 ml del mismo medio. Vuelva a suspender las células en el tubo hasta que estén homogéneas y no se puedan observar aglomeraciones.
  7. Retire 20 μL de suspensión celular y colóquelos en un hemocitómetro para el recuento. Una vez que se haya calculado el número de celdas requeridas, realice una dilución para hacer una solución con la densidad celular correcta.
  8. Medios de pipeta que contienen celdas en placas de 96 pocillos (350 μL de capacidad), con un volumen máximo de 200 μL por pocillo. Coloque las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h para que se adhieran a la superficie de la placa.
  9. Para evaluar tanto el glutatión total como el GSSG, trate las muestras para ambas afecciones. Siembre y trate 6 pocillos para proporcionar 2 juegos de GSH y GSSG con 3 repeticiones técnicas (la Figura 1 muestra el diseño).
  10. Asegúrese de que todos los reactivos estén debidamente preparados antes del comienzo del ensayo; asegúrese de que todos los componentes y reactivos del tampón estén en RT antes de comenzar la construcción de tampones o su uso en el ensayo, con la excepción de pH 7,4 PBS (sin EDTA), que debe mantenerse en hielo/refrigerado hasta su uso.
    NOTA: Es de vital importancia que la formación de burbujas se limite al mínimo para permitir que ocurran las reacciones deseadas dentro del ensayo y permitir una cuantificación precisa a través del lector de placas.

Línea celularDensidad de siembra (placa de 96 pocillos)
HepG210.000 células/pocillo
A5495.000 celdas / pozo
J77410.000 células/pocillo

Tabla 1: Densidades de siembra sugeridas para las líneas celulares elegidas. Se demuestran diferentes densidades de siembra para tres líneas celulares diferentes utilizadas en los datos representados, específicamente A549, J774 y HepG2.

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Figura 1: Diseño propuesto para la siembra de placas de 96 pocillos para la determinación simultánea de glutatión total y disulfuro de glutatión. También se muestran pozos para calibración y controles. Los pozos que no se utilizan se representan con una cruz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Tratamiento de nanomateriales

  1. Pesa nanomateriales (específicamente ZnO, TiO2, CuO y Ag) en una báscula con capacidad de μg. Realizar un cálculo para alcanzar una concentración inicial de 1 mg/mL por nanomaterial.
  2. Transfiera las soluciones de nanomateriales a un sonicador y sonique durante 16 minutos utilizando un baño de sonicación (38 W) para producir una solución homogénea. Realizar una serie de diluciones para cada nanomaterial a 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL.
  3. Retire las células de la incubadora y lávelas ligeramente con RT PBS. Después de asegurarse de que se ha eliminado todo el PBS, agregue 100 μL de tratamientos a la placa, con controles (medios de cultivo sin HIFS). Después de aplicar el tratamiento a las células, incubar con los nanomateriales en una incubadora a 37 °C (5% CO2) durante 4 h; A continuación, utilice el siguiente protocolo para cuantificar GSH: GSSG, concentración de proteínas y liberación de AK.

4. Protocolo de ensayo

  1. Después de la exposición al tratamiento (Figura 2A), evaluar la viabilidad a través de la actividad de la adenilato quinasa (AK) (opcional). Utilice un kit comercial para este ensayo siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Centrifugar las placas en una centrífuga a 200 x g durante 5 min para tratar ligeramente los pellets y los restos celulares (Figura 2B).
  3. Retire suavemente 20 μL de sobrenadante de medio de cada pocillo de muestra y control (como se especificó anteriormente) y pipetee en una placa blanca adyacente de 96 pocillos en el mismo formato de diseño (Figura 2C).
  4. Añada 100 μL de solución de trabajo del kit AK a cada pocillo, proteja la placa de la luz y deje actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Registre la luminiscencia utilizando un lector de placas a 1000 cuentas/s.
  5. Para los estándares de GSH, agregue 40 μL de tampón de glutatión total a cada pocillo (Figura 2D; opcional, requerido para la cuantificación).
  6. Aspire el medio restante de la placa y lave 3 veces con PBS 0.1 M helado, pH 7.2, desechando cada lavado (Figura 2E) con la excepción de los estándares. Deje el lavado final en la placa hasta que la calibración GSH se haya cargado en la placa.
  7. Añadir 10 μL de cada concentración de glutatión y blanco (ddH2O) en los pocillos por triplicado.
  8. Retire el lavado final de PBS y agregue las mezclas a cada pocillo según la Tabla 2 para la cuantificación objetivo deseada (Figura 2E). Calcule los volúmenes necesarios antes de comenzar este paso debido a la pérdida de actividad urgente con búferes completos. Asegúrese de preparar estas mezclas de reactivos antes de comenzar el proceso de ensayo, pero no permita que se asienten durante más de 30 minutos antes de su uso.
  9. Colóquelo en un agitador de placas orbital y deje que la placa se agite a 300 RPM durante 2 minutos (Figura 2F).
  10. Retirar del agitador y añadir 5 μL de solución de TCEP 0,01M a cada pocillo, excluyendo el pocillo de control NEM. Regrese la placa al agitador e incube durante 10 minutos (Figura 2F).
  11. Transfiera la placa a la centrífuga y centrifuga a 200 x g durante 5 min. Transfiera 25 μL de cada pocillo de muestra a otra placa de 96 pocillos (transparente); Esto se utilizará para la concentración de proteínas (ver Paso 4.15 ; Figura 2G). No transfiera patrones ni controles de ensayo.
  12. Asegúrese de que el volumen final de cada pocillo sea de 30 μL; eliminar el volumen de los controles y estándares para cumplir con este requisito (Figura 2H).
  13. Agregue 170 μL de solución de OPA funcional a cada pocillo, proteja la placa de la luz y colóquela en el agitador durante 15 minutos (Figura 2I).
  14. Lea la fluorescencia usando un lector de placas en Ex340/EM450 (Figura 2J). Asegúrese de que no haya burbujas durante la etapa de medición; Tendrán un impacto perjudicial tanto en la reacción como en la cuantificación a través del lector de placas.
  15. Para cuantificar el contenido de proteínas de las células lisadas, utilice un kit de ensayo comercial de BCA. Transfiera las muestras tomadas del paso 4.12 a una nueva placa de 96 pocillos (transparente) a 25 μL por pocillo.
  16. Utilice un patrón de albúmina sérica bovina (BSA) diluido en tampón de lisis IP y añádalo a la placa por triplicado a 25 μL por pocillo. Las concentraciones exactas se definen en el protocolo del kit BCA.
  17. Prepare una solución de trabajo que consista en una proporción de 50:1 de los reactivos A y B del kit de BCA y agregue 200 μL a cada pocillo que contenga la muestra, el patrón y el control. Proteja las placas de la luz e incube a 37 °C durante 30 minutos (Figura 2K).
  18. Retire las muestras de la incubadora, deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego lea la absorbancia a través del lector de placas a 562 nm (Figura 2L).
Concentración total de glutatión Mezcla de reactivos de lisis
ComponenteVolumen
Tampón de lisis50 μL
Volumen total / pozo50 μL
Mezcla de reactivos de lisis con concentración de glutatión oxidado
ComponenteVolumen
Tampón de lisis49,5 μL
NEM (25mM)0,5 μL
Volumen total / pozo50 μL
USE AMBAS SOLUCIONES DENTRO DE LOS 30 MINUTOS POSTERIORES A LA COMPOSICIÓN DE LA MEZCLA
Componente de la solución de detección OPAVolumen
OPA 3 mg/mL5μL
PBS (pH 9.0)165 μL
Volumen total / pozo170 μL

Tabla 2: Volúmenes necesarios de reactivos para la realización del protocolo. Volúmenes requeridos por pocillo para la determinación de glutatión total, disulfuro de glutatión y reactivo de trabajo requeridos. Asegúrese de que se calculan los volúmenes necesarios y de que se incluya un exceso para tener en cuenta la pérdida de volumen a través de la transferencia.

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Figura 2: Representación esquemática del protocolo. (A) Siembra inicial, incubación y tratamiento de las células. (B) Centrifugación para separar los medios de los sólidos en suspensión. (C) Transferencia de medios para el ensayo de adenilato quinasa. (D) Adición de concentraciones de glutatión para el rango de calibración. (E) Etapas de lavado y adición de reactivos de lisación. (F) Adición de tampón y adición de fosfina tris (2-carboxietilo) con paso de agitación. (G) Centrifugación de células lisadas para la eliminación de medios para el análisis de proteínas. (H) Eliminación de medios para igualar el volumen a través de la placa. (I) Adición de solución de trabajo de ortoftalaldehído con incubación por agitación. (J) Medición de la fluorescencia del ortoftalaldehído mediante lector de placas. (K) Etapas de incubación para el ensayo de ácido bicinconínico para la determinación de proteínas. (L) Medición de la concentración de proteínas, permitiendo la normalización del glutatión: valores de disulfuro de glutatión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

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Siguiendo este protocolo, las líneas celulares A549 y J774 se sembraron a densidades de 5.000 células/pocillo y 10.000 células/pocillo, respectivamente, y se cultivaron a 37 °C en 5% de CO2 durante 48 h. El análisis de AK después del tratamiento con nanomateriales se muestra en la Tabla Suplementaria 1, y la concentración de proteínas se muestra en la Tabla Suplementaria 2.

Gráfico de calibración
En la Figura 3 se muestran tres calibraciones utilizando el rango de concentración indicado (concentración final de 0,234 a 30 μM) de tres placas separadas de tres tipos de celdas diferentes (aunque no deben afectar la calibración) en tres días diferentes no consecutivos. Si bien se muestran 3 muestras, se observó un N de 12 y se demostraron regresiones lineales similares con un valor promedio de R2 de 0.9932 ± 0.007.

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Figura 3: Gráficos de calibración de glutatión para el ensayo. Tres gráficos de calibración de rangos de calibración de glutatión en placa separados, cada uno realizado con una semana de diferencia; barras de error ± SD (n=3, N=12) n=réplicas técnicas, N=réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados de la muestra
Las células HepG2, A549 y J774 se utilizaron en la evaluación de varios nanomateriales sospechosos de inducir cambios en los mecanismos celulares a través del estrés oxidativo. Se utilizó el protocolo de detección y cuantificación descrito.

Los datos recibidos de las 3 mediciones (AK, BCA y GSH/GSSG) se manejaron de la siguiente manera. Se implementó el ensayo AK y BCA para la normalización; el ensayo de AK, utilizando el kit recomendado, proporcionará los datos más rápidos y sencillos de la cantidad de AK liberada en el medio celular. Se espera un aumento en los valores de AK para aumentar la muerte celular. Por lo tanto, se requiere un control -ve (Alive) y +ve (Dead). Esto permitirá la normalización basada en porcentajes.

El ensayo BCA es un proceso más largo, pero permitirá obtener resultados cuantificables a través de la cuantificación de proteínas (mg/mL). Esto no requiere un control -ve o +ve como en el AK, pero aún requerirá un control -ve general (celdas no tratadas) para permitir que se logre la normalización de los valores.

En esta sección de resultados representativos, se encontró que el tratamiento (nanomateriales) tenía el potencial de causar interferencia con el ensayo de AK. Por lo tanto, toda la normalización se realizó utilizando los datos de BCA. Por lo tanto, la información se presenta como la concentración de las especies detectadas (GSH o GSH+GSSG (sin embargo, se realiza una resta de la concentración total de GSH + GSSG para obtener la concentración de GSSG) por mg/mL de proteína (mediante ensayo BCA). Si se desea, esto se puede convertir en una proporción para evaluar el cambio en GSH: GSSG con respecto al tratamiento deseado.

En la Figura 4 se muestran los datos de la relación GSH:GSSG de tres líneas celulares diferentes (A549, J774 y HepG2) adquiridos mediante el protocolo OPA y normalizados a la expresión de proteínas a través de BCA (μg/mL), se pueden encontrar más datos que especifican valores adicionales de GSH y GSSG en la Figura complementaria 1.

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Figura 4: Glutatión: Relación de disulfuro de glutatión de la realización del ensayo. Se muestran las proporciones de glutatión: disulfuro de glutatión de 3 líneas celulares, a saber, (A) A549, (B) J774 y (C) HepG2. Las células se incubaron con tratamientos (diversos nanomateriales en medios libres de suero) durante 4 h. Las células se procesaron utilizando este protocolo para cuantificar los cambios en el glutatión y el disulfuro de glutatión y se normalizaron mediante cuantificación de proteínas, barras de error ± SE (n = 3, N = 3) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La placa también contiene una serie de controles para garantizar que el ensayo se haya realizado correctamente. NEM se agrega como un componente individual para demostrar una falta de interacción con los medios de detección de OPA. El estándar de calibración demuestra un aumento lineal con la concentración de GSH, lo que demuestra la capacidad efectiva del reactivo de detección de OPA para unirse de manera efectiva a concentraciones crecientes de GSH.

Debe tenerse en cuenta que este ensayo se dirige específicamente a los grupos sulfhidrilo libres que se encuentran comúnmente en los tioles (como el GSH, que comúnmente se consideran antioxidantes). Una posible interacción es la unión de OPA a los tioles de las proteínas, lo que daría lugar a una recopilación de datos inexacta. Por lo tanto, el ensayo BCA es una etapa crucial para normalizar los datos a proteínas y permitir una reflexión precisa de GSH libre.

Figura complementaria 1: Figuras que demuestran glutatión, disulfuro de glutatión y glutatión: proporción de disulfuro de glutatión de 3 líneas celulares, a saber, (A) A549, (B) J774 y (C) HepG2. Las células se incubaron con tratamientos (diversos nanomateriales en medios libres de suero) durante 4 h. Las células se procesaron utilizando este protocolo para cuantificar los cambios en el glutatión y el disulfuro de glutatión y se normalizaron mediante cuantificación de proteínas, barras de error ± SE (n = 3, N = 3) Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Metadatos de los valores de adenilato quinasa para las células A549 y J774. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Cuadro complementario 2: Metadatos de los valores de ácido bicinconínico con calibración para las células A549, J774 y HepG2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Como se ha señalado, la necesidad de comprender el redox celular, monitorear los estados de estrés oxidativo y la respuesta antioxidante siempre ha sido crucial para comprender y prevenir una gran cantidad de enfermedades, como el cáncer y la neurodegeneración33,34. Aquí se demuestra un medio para mejorar el panorama traslacional al aumentar la accesibilidad de la detección precisa de GSH: GSSG con una preparación rápida y mínima.

Este protocolo demuestra una secuencia multiparamétrica de ensayos para la determinación de especies intracelulares de glutatión/tiol (reducidas y oxidadas), con 2 medios de normalización mediante ensayo de proteína BCA y/o ensayo AK. Este ensayo también se puede modificar para detectar otros marcadores a través del paso inicial de extracción del mediador y se puede simplificar de una manera que simplemente dará una relación de tiol oxidado / reducido con la exclusión del rango de calibración.

Al considerar la evaluación de los analitos, se exploraron y compararon tanto el mBCI como el OPA para su uso. Si bien el mBCl demostró inicialmente un buen potencial de señal, se descubrieron limitaciones significativas en su uso. Principalmente, el uso de células vivas demuestra el mejor uso de mBCl; sin embargo, después de la lisis celular, se encontró que la señal se apaga y generalmente disminuye en un formato de pocillos múltiples en comparación con OPA35. Otro problema es la medición de GSSG a través de mBCl, la literatura es escasa al respecto, y a través de la optimización/exploración del protocolo, no se logró una detección precisa de GSSG a través de mBCl.

Hemos demostrado que el ensayo OPA presenta rangos de calibración significativamente fiables, con un promedio de R2 de 0,9932 ± 0,007 (N = 12) en un rango de concentración de 0,234 a 30 μM de GSH. Este rango fue elegido debido a los rangos de referencia previos encontrados en la literatura35. Es teóricamente posible detectar glutatión fuera de estos rangos, pero requerirá modificaciones en la concentración de reactivos, el tiempo de incubación y, potencialmente, el equipo utilizado en la detección. Hay que tener en cuenta que cada placa requiere su propio rango estándar para la cuantificación; La más mínima variación en el tiempo entre placas realizada en diferentes días puede tener un efecto significativo en los valores obtenidos durante la medición.

Lograr datos precisos y confiables de este protocolo depende de que se cumplan estrictamente varios pasos cruciales. Al construir los diversos tampones requeridos en el protocolo, es crucial que el pH sea preciso. Por lo tanto, los tampones que requieren un pH de 9 no deben tener ninguna desviación más allá de ± 0,1 de este valor. Esto se debe a la posibilidad de que los componentes tampón precipiten fuera de la solución con un pH incorrecto; Seguir este protocolo exactamente evitará este problema.

La eliminación completa del tratamiento y el lavado preciso antes de la lisis también son fundamentales para evitar artefactos y la adquisición de datos inexactos durante la etapa de lectura de la placa. Una vez que se han lisado las células (paso 4.8), no es posible retirar el tratamiento y la placa no se podrá salvar. Debido a que los volúmenes de tampones/reactivos que se añaden a lo largo del protocolo varían entre muestras y estándares, es fundamental que el usuario sea consciente de los volúmenes variados, en los pasos 4.12 y 4.13. El operador del ensayo también es consciente de estos volúmenes variados y se le indica que se asegure de que todos los volúmenes sean iguales para permitir que se logre una medición precisa. Como los volúmenes entre las muestras y los patrones no son visiblemente significativos, puede ser un error fácil de cometer con respecto a tener un exceso de solución en el pocillo de muestra.

Existen limitaciones para este protocolo que dependen de pasos cruciales, que son críticos para adquirir datos precisos y confiables. Los usuarios que realizan este ensayo deben poseer un nivel razonable de habilidades de laboratorio para evitar problemas no deseados, como la formación de burbujas. La formación de burbujas tiene un impacto drástico tanto en la capacidad de reacción dentro de la microplaca como en la medición de la fluorescencia. El agente lisante utilizado en este protocolo contiene un detergente, lo que presenta dificultades para un investigador novato que puede tener dificultades para prevenir la formación de burbujas. La centrifugación inmediata puede salvar este error. El protocolo también es potencialmente limitado en cuanto al tipo de célula; Se utilizaron las líneas celulares A549, J774 y HepG2 para optimizar y producir datos para este protocolo. Otras líneas celulares pueden requerir diferentes densidades de siembra y optimización del protocolo para obtener datos precisos.

Este protocolo ofrece numerosas ventajas sobre varios ensayos existentes. Si bien la detección de tioles mediante ftalaldehído no es un concepto nuevo, la utilización en un formato de ensayo combinado como este, en una microplaca, con materiales y equipos requeridos limitados, ofrece un gran potencial para que todos los laboratorios accedan a este protocolo. La mayoría de los kits de tiol/GSH de proveedores comerciales no revelan la composición de sus reactivos. Por lo tanto, puede ser difícil prever el potencial de incompatibilidades/interferencias. Aquí, presentamos cada componente de todos los reactivos utilizados para limitar ese potencial.

Este protocolo también se realiza con bastante rapidez al finalizar el período de tratamiento inicial. Teniendo en cuenta el procesamiento del usuario entre las etapas de incubación, el aspecto de cuantificación de tiol de este protocolo se puede realizar en menos de 1 h. Las muestras se lisan y unen simultáneamente para evitar la autooxidación de las muestras, lo cual es óptimo para estas especies de reacción. Si bien no se especifica en el protocolo, las muestras técnicamente se pueden lisar en una placa y sellar, lo que permite congelarlas para análisis futuros. Sin embargo, esta modificación del protocolo no ha sido explorada.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Esta investigación ha sido financiada por los proyectos europeos GRACIOUS (GA760840) y SUNSHINE (GA952924). Los autores también quieren reconocer los esfuerzos de todos aquellos que, de alguna manera, ayudaron a desarrollar este protocolo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.22 y micro; Filtro m (opcional-Para tampón de lisis)Matraz12561259
100 mlMatraz15290866
1 L Vasode precipitados Fisher scientific 15230876
de 250 ml (opcional para tampón de lisis)Micropipeta Fisher scientific15409083
de 8 canales (20-200 y micro; L)Micropipeta SLSFA10011D2
de 8 canales (2-20 y micro; L)SLSB2B06492
placas de 96 pocillos - negras con fondo transparente, tratadas con TCFisher scientific10000631Placa preferida para la siembra y la fluorescencia, use TC tratada transparente si no está disponible
de 96 pocillos - transparentes (tratadas y no tratadas con TC)Fisher scientific10141161Si las placas negras con fondo transparente no están disponibles / no son adecuadas, use
placas transparentes de 96 pocillos tratadas con TC - blancas, No tratado con TCLínea celular Fisher scientific11457009
A549 (carcinoma de pulmón)ATCCCCL-185
Etanol absolutoMerck (Sigma-Aldrich)1.08543
Papel de aluminioFisher scientific11779408Para proteger las placas de la luz Kit de
ensayo BCAThermo23225
Centrífuga de sobremesa ( con rotor de 96 placas)Eppendorf5804
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884
Glutatión (GSH)Merck (Sigma-Aldrich)G6013
Disulfuro de glutatión (GSSG)Merck (Sigma-Aldrich)G4501
GlicerolMerck (Sigma-Aldrich)G5516
HCl, 37% Merck (Sigma-Aldrich)258148Diluido a 1 mM para stock de GSH, ajuste de pH también
línea celular HepG2 (Hepatocarcinoma)ATCCHB-8065
IGEPAL  CA-630 Merck (Sigma-Aldrich)18896Utilice IGEPAL CA-630 o NP-40 para la solución, no ambos
tampón de lisis IP Fisher Scientific11825135
línea celular J774 (monocitos, macrófagos)ATCCTIB-67
KClMerck (Sigma-Aldrich)P3911
KH2PO4 Merck (Sigma-Aldrich)P0662
Micropipeta (20-200µ L)Micropipeta SLSB2B06482
(2-20 y micro; L)SLSB2B06478
Agitador de microplacasVWR444-0041
Na2HPO4Merck (Sigma-Aldrich)S9763
NaClMerck (Sigma-Aldrich)S9888
NaOH, 10MMerck (Sigma-Aldrich)72068Solo para el ajuste
del pH N-etilmaleimida (NEM)& nbsp;Merck (Sigma-Aldrich)E3876
NP-40Merck (Sigma-Aldrich)492016Utilice IGEPAL CA-630 o NP-40 para la solución, no ambos. NP-40 alternativa sugerida
Orto-ftaldialdehído (OPA)Merck (Sigma-Aldrich)P1378
PBS 0.1MMerck (Sigma-Aldrich)P2272PBS puede adquirirse prefabricado o fabricado internamente, ver notas
Lector de placas (con capacidad de fluorescencia)TecanSPARK
Barra de agitación (opcional-Para tampón de lisis)Fisher scientific16265731
Kit de bioensayo Toxilight (ensayo AK)LonzaLT17-217
Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 0,5M  en H2OAlfa AesarH51864También se puede comprar cristalizado y suspendido
TRIS-HClMerck (Sigma-Aldrich)93363
X100 cóctel de fosfatasa y proteasa Fisher Scientific 10025743
aforado Fisher scientific aforado Fisher scientific placas

Referencias

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