Aquí, presentamos un protocolo para obtener el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante la introducción de sitios de restricción adecuados en el extremo 3' de los insertos. Podemos linealizar el vector y unir fragmentos de ADN al vector uno por uno mediante la tecnología de recombinación homóloga.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La construcción de vectores de expresión génica es un componente importante del trabajo de laboratorio en biología experimental. Con avances técnicos como el ensamblaje de Gibson, la construcción vectorial se vuelve relativamente simple y eficiente. Sin embargo, cuando el genoma completo del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) no puede amplificarse fácilmente mediante una sola reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc, o es difícil adquirir un vector de expresión génica de longitud completa mediante la recombinación homóloga de múltiples inserciones in vitro, la técnica actual de ensamblaje de Gibson no logra este objetivo.
En consecuencia, nos propusimos dividir el genoma del PRRSV en varios fragmentos e introducir sitios de restricción apropiados en el cebador inverso para obtener fragmentos amplificados por PCR. Después de unir el fragmento de ADN anterior en el vector mediante tecnología de recombinación homóloga, el nuevo vector adquirió el sitio de escisión de la enzima de restricción. Por lo tanto, podemos linealizar el vector utilizando el sitio de escisión de la enzima recién agregado e introducir el siguiente fragmento de ADN aguas abajo del fragmento de ADN aguas arriba.
Se eliminará el sitio de escisión de la enzima de restricción introducido en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas arriba, y se introducirá un nuevo sitio de escisión en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas abajo. De esta forma, podemos unir fragmentos de ADN al vector uno a uno. Este método es aplicable para construir con éxito el vector de expresión PRRSV y es un método eficaz para ensamblar un gran número de fragmentos en el vector de expresión.
Introducción
Como técnica esencial para construir herramientas experimentales basadas en ADN para su expresión en células procariotas y eucariotas, la clonación molecular es un componente muy importante de la biología experimental. La clonación molecular implica cuatro procesos: la adquisición del ADN del inserto, la ligadura del inserto en el vector apropiado, la transformación del vector recombinante en Escherichia coli (E. coli) y la identificación de los clones positivos1. Hasta ahora, se han adoptado múltiples métodos para unir moléculas de ADN mediante el uso de enzimas de restricción 2,3
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de la plantilla del gen PRRSV
- Descongele el stock de virus en 1 mL de reactivo de extracción de ARN (consulte la tabla de materiales).
- Añadir 0,2 mL de cloroformo y mezclar bien. Incubar durante 3 min.
- Centrifugar la mezcla durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
NOTA: La mezcla se divide en tres fases, a saber, una fase acuosa incolora, una interfase y una fase de fenol-cloroformo rojo. - Pipetear la fase acuosa incolora y transferirla a un nuevo tubo.
- Mezclar bien la fase acuosa con 0,5 mL de isopropanol e incubar durante 10 min a 4 °C.
- Centrifugar dura....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En este artículo, presentamos un sistema de recombinación in vitro para ensamblar y reparar moléculas de ADN superpuestas utilizando el cebador inverso a través de sitios de restricción introducidos continuamente (Figura 1B). Este sistema es un procedimiento simple y eficiente que comprende la preparación del vector lineal y los fragmentos de inserto que contienen voladizos introducidos por PCR con cebadores que tienen secuencias de extensión 5' y sitios de restricción apropiados; u.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La técnica de ensamblaje de Gibson es un método de clonación molecular basado en la recombinación in vitro para el ensamblaje de fragmentos de ADN8. Este método permite el ensamblaje de múltiples fragmentos de ADN en un plásmido circular en una reacción isotérmica de un solo tubo. Sin embargo, uno de los obstáculos para la técnica de ensamblaje de Gibson es la adquisición de fragmentos largos de ADNc. Los fragmentos largos son difíciles de amplificar con precisión por muchas razones. Por .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el apoyo financiero de los fondos de iniciación de investigación doctoral proporcionados por la Universidad Normal Occidental de China (No. 20E059).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 kb más Escalera de ADN | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
| 2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
| Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
| Microcentrífuga de sobremesa | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
| Banco limpio | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
| Equipo de electroforesis de ADN | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
| Tampón de carga de ADN (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
| E. Z. N. A. Kit de extracción de gel | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
| E.Z.N.A. Mini kit de ADN plasmídico I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
| Cultivador de temperatura estacionaria con electrocalentamiento | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
| ExonArt Kit de clonación y ensamblaje sin costuras | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
| ExonScript RT SuperMix con dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
| FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
| FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
| FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
| FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
| Goldview Tinción de gel de ácido nucleico | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
| de fabricación de hielo | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
| Invitrogen Platino SuperFi II ADN polimerasa | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
| Placa de agar LB (Kanamicina) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
| LB medio líquido estéril (Kanamicina) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
| Micropipetas | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
| Horno de microondas | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
| Agitadores orbitales | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
| Virus PRRSV | Universidad Agrícola de Sichuan | — | |
| SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | Para diseñar cebadores |
| T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
| TAE | buffer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
| Reactivo TRIzol | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | Reactivo de extracción de ARN | 15596026 |
Referencias
- Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5(2008).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
