Oclusión de la DA activada a distancia mediante un catéter de balón en ratones que respiran espontáneamente

Resumen

Este artículo presenta una técnica única de tórax cerrado para inducir la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión (IRI) en ratones. El método presentado permite a los ratones respirar espontáneamente mientras inducen isquemia miocárdica a distancia. Esto proporciona acceso al animal para estudiar los procesos dinámicos de isquemia y reperfusión in situ y en tiempo real a través de imágenes no invasivas.

Resumen

El infarto agudo de miocardio (IAM) es una afección cardiovascular prevalente y de alta mortalidad. A pesar de los avances en las estrategias de revascularización para el IAM, con frecuencia conduce a una lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRI), que amplifica el daño cardíaco. Los modelos murinos sirven como herramientas vitales para investigar tanto la lesión aguda como la remodelación crónica del miocardio in vivo. Este estudio presenta una técnica única de tórax cerrado para inducir a distancia la IRI miocárdica en ratones, lo que permite la investigación de la fase muy temprana de la oclusión y la reperfusión utilizando imágenes in vivo como la resonancia magnética o la PET. El protocolo utiliza un método de oclusión remota, lo que permite un control preciso sobre el inicio de la isquemia después del cierre del tórax. Reduce el trauma quirúrgico, permite la respiración espontánea y mejora la consistencia experimental. Lo que distingue a esta técnica es su potencial para la obtención simultánea de imágenes no invasivas, como la ecografía y la resonancia magnética (RM), durante los eventos de oclusión y reperfusión. Ofrece una oportunidad única para analizar las respuestas de los tejidos casi en tiempo real, proporcionando información crítica sobre los procesos durante la isquemia y la reperfusión. Se llevaron a cabo pruebas sistemáticas exhaustivas de este enfoque innovador, midiendo los marcadores de necrosis cardíaca para el infarto, evaluando el área en riesgo mediante resonancia magnética con contraste y tiñendo los infartos en la etapa de maduración de la cicatriz. A través de estas investigaciones, se hizo hincapié en el valor de la herramienta propuesta para avanzar en los enfoques de investigación de la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica y acelerar el desarrollo de intervenciones específicas. En este trabajo se presentan los resultados preliminares que demuestran la viabilidad de combinar el innovador protocolo experimental propuesto con técnicas de imagen no invasivas. Estos resultados iniciales resaltan el beneficio de utilizar la cuna animal especialmente diseñada para inducir isquemia miocárdica de forma remota mientras se realizan simultáneamente resonancias magnéticas.

Introducción

El infarto agudo de miocardio (IAM), una enfermedad cardiovascular prevalente a nivel mundial, se asocia a altas tasas de mortalidad y morbilidad¹. A pesar de los avances tecnológicos que permitieron estrategias de revascularización tempranas y efectivas para los pacientes con IAM, los pacientes aún experimentan lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRI) después de estas intervenciones². Por lo tanto, es crucial comprender los mecanismos fundamentales y formular enfoques para mitigar la IRI. La IRI representa un estado fisiopatológico complejo que involucra una multitud de procesos biológicos intrincados. Estos abarcan la muerte celular regulada, las respuestas al estrés oxidativo, la inflamación, la cicatrización de heridas, la fibrosis y la remodelación ventricular. Los modelos animales, como los ratones, han sido de gran importancia para la investigación del IRI y se emplean ampliamente debido a su rentabilidad, su rápida reproducción y la gran cantidad de información mecanicista de los modelos transgénicos³.

Este protocolo presenta una técnica innovadora para inducir IRI de forma remota en ratones que respiran espontáneamente con el tórax cerrado, imitando más de cerca la patología humana. La oclusión remota se logró mediante la utilización de un catéter balón colocado a una distancia del miocardio para ocluir la arteria descendente anterior (DA) izquierda. Este enfoque ofrece un acceso continuo al corazón latiendo en los momentos exactos de la oclusión y la reperfusión, lo que facilita las modalidades de imágenes simultáneas, incluidas las ecografías o las imágenes por resonancia magnética (RM). Estos métodos no invasivos podrían proporcionar información crucial sobre las respuestas de los tejidos antes, durante y después de los eventos de oclusión y reperfusión.

Existen diversas técnicas quirúrgicas para inducir IRI en modelos murinos. El trauma quirúrgico derivado de la toracotomía en modelos de ligadura coronaria a tórax abierto desencadena una respuesta inmune que impacta en diversos mecanismos asociados con la isquemia y la reperfusión. La activación del sistema inmunitario innato tiene el potencial de influir en la extensión del infarto de miocardio⁴. La técnica adaptada propuesta proporciona un enfoque potencial para explorar el pre y postacondicionamiento miocárdico y posiblemente reducir el impacto de la respuesta inmune innata al trauma quirúrgico en estudios murinos de IRI al minimizar el período de tiempo de tórax abierto a un máximo de 5 minutos. Además, la técnica recientemente desarrollada también podría contribuir a reducir las secuelas proinflamatorias causadas por la lesión pulmonar inducida por el ventilador⁵. Sin embargo, los efectos combinados de este nuevo método de tórax cerrado requerirían una investigación más profunda.

La validación exhaustiva de la técnica propuesta se realizó comparándola con el método tradicional, que consiste en exponer la DA mediante disección torácica quirúrgica y oclusión inducida por ligadura durante 30 min. Se compararon los resultados de ambas técnicas, que incluyeron mediciones de troponina que reflejaban el tamaño del infarto cardíaco, evaluaciones del área en riesgo mediante resonancia magnética con realce de contraste de gadolinio, tinción histológica de cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) y la determinación del tamaño final de las cicatrices mediante tinción Sirius Red (SR). El resultado demuestra la robustez y eficacia del enfoque propuesto para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión en modelos murinos.

Protocolo

Este protocolo animal fue aprobado y está de acuerdo con las pautas y regulaciones establecidas por el Comité de Ética para la Experimentación Animal (ECD) de la Universidad Católica de Lovaina. Todas las políticas desarrolladas por el DIT local siguen la normativa de la Unión Europea relativa al bienestar de los animales de laboratorio, tal y como se declara en la Directiva 2010/63/UE. Todas las pruebas que se describen a continuación se han realizado en ratones machos C57BL/6 de 8-12 semanas de edad (peso corporal = 20-23 g). Los experimentos agudos representan animales que fueron sacrificados inmediatamente después de la cirugía. Los experimentos de supervivencia representaron un seguimiento de cuatro semanas, que incluyó la medición de troponina, la resonancia magnética y la tinción de SR.

1. Anestesia e intubación endotraqueal

1. Administrar medicación preanestésica con una mezcla de ketamina (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/mL), xilacina (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/mL) y acepromazina (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/mL) (KXA) (ver Tabla de Materiales) con diluyente salino al 0,9 % por vía intraperitoneal. Esto permite una intubación más suave y menos invasiva.
2. Coloque el ratón en una cámara de inducción (ver Tabla de Materiales) e invoque la anestesia con isoflurano al 2,5% en oxígeno puro con un caudal de 1 L/min hasta la pérdida de enderezamiento y el reflejo de pinzamiento de la punta del pie.
3. Transfiera el animal a una almohadilla térmica (±38 °C) y colóquelo en decúbito supino con la cabeza hacia el cirujano. Fije la cola y las patas delanteras con cinta adhesiva en la almohadilla. Asegúrese de que las extremidades delanteras no estén demasiado estiradas, ya que esto puede comprometer la respiración.
4. Coloque una sutura de seda 2-0 (consulte la Tabla de materiales) alrededor de los incisivos superiores y pegue la sutura en el borde de la almohadilla para tensar el ratón. Si es necesario, coloque un soporte para agujas para mantener la tensión en la sutura. Mantener al animal anestesiado con isoflurano al 2% en oxígeno al 100% con un caudal de 1 L/min utilizando un cono nasal.
5. Coloque una fuente de luz justo al rostral del esternón, retire el cono de la nariz y coloque el suministro de isoflurano en el ventilador. Intube al ratón con pinzas levantando la lengua hacia arriba y sosteniendo un laringoscopio de fabricación propia para levantar aún más la parte basal de la lengua y visualizar las cuerdas vocales.
6. Coloque un tubo traqueal de fabricación propia con un catéter de 18 g en una aguja sin filo entre las cuerdas vocales. Suba el catéter, extraiga la aguja desafilada y conecte el tubo con el ventilador del ratón (consulte la tabla de materiales).
7. Utilice un conector modificado en forma de Y (consulte la Tabla de materiales) para conectar el tubo de intubación al ventilador. La posición correcta del tubo traqueal se puede confirmar juzgando la expansión simétrica del tórax.
8. Ajuste el volumen corriente (mL) al peso corporal (BW) (g) x 7 y la tasa de ventilación a 53,5 x (BW (g)^-0,26) brazadas por minuto, y ajústelo al peso corporal de un ratón en particular si es necesario⁶ (por ejemplo, para un ratón de 25 g el volumen corriente es de 175 mL a 140 brazadas por min).
9. Reducir el isoflurano al 1% en oxígeno al 100%, ya que el animal permanecerá anestesiado debido a la premedicación. Sin embargo, evalúe regularmente la profundidad de la anestesia realizando un pellizco en los dedos de los pies. Adapte la concentración de isoflurano en función de la profundidad de la anestesia.
10. Aplique una gota de ungüento oftálmico para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.

2. Instalación de la herramienta IRI

NOTA: Retire toda la cinta adhesiva y coloque el animal en la placa base de la herramienta IRI especialmente diseñada. Los detalles sobre las propiedades de la herramienta IRI se mencionan en el Archivo Complementario 1.

1. Fije la placa base de la herramienta IRI remota especialmente diseñada en una posición lateral frente al cirujano. Fija la cola y las patas con cinta adhesiva. Fije la cabeza con la sutura de seda 2-0 alrededor de los incisivos superiores para evitar movimientos accidentales (Figura 1).
2. Inserte la sonda térmica rectal (consulte la tabla de materiales) para controlar la temperatura corporal y utilice una lámpara de calentamiento infrarroja sobre el animal para mantener la temperatura alrededor de 37 °C. Preste atención a la distancia suficiente entre el animal y la lámpara para evitar el sobrecalentamiento.
3. Coloque los electrodos de aguja de ECG en las cuatro patas para observar y registrar la frecuencia cardíaca y la forma de onda del ECG. Fije la sonda rectal y los electrodos de ECG a la plataforma con cinta adhesiva.
4. Aplique la crema depilatoria en el lado izquierdo del tórax para eliminar el vello y crear un campo quirúrgico claro.
   NOTA: Limite el tiempo de aplicación y preste atención a la eliminación completa de la crema para evitar quemaduras químicas.

3. Toracotomía

1. Realice la preparación aséptica de la piel con la solución de Betadine, luego coloque un paño quirúrgico en el tórax izquierdo para garantizar un ambiente estéril. Utilice equipo esterilizado para realizar el procedimiento. Realice una incisión vertical en la piel en la porción media del músculo pectoral de aproximadamente 1 cm de largo y 2 mm del borde esternal izquierdo.
2. Escupe el músculo pectoral para exponer las costillas por debajo. Evite lesiones accidentales a la embarcación. Si se produce sangrado, use aplicadores de algodón para detener el sangrado.
3. Visualice las costillas e identifique los espacios intercostales observando el pulmón inflado a través de la pared torácica delgada y semitransparente. Abrir la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas haciendo una incisión de 6-8 mm en el tercer espacio intercostal. Asegúrese de que la incisión esté a un mínimo de 2 mm del borde esternal donde se encuentra la arteria torácica interna.
4. Inserte un pequeño espéculo de ojo de rata (ver Tabla de Materiales) en el espacio intercostal. Esto funcionará como un retractor de costillas (Figura 1A).
5. Levante suavemente el pericardio con pinzas curvas y sepárelo.
6. Coloque un pequeño trozo de algodón encima del pulmón y empuje suavemente hacia abajo.

4. Preparación de LAD

1. La DA aparece de color rojo brillante y se extiende desde la aorta por debajo de la aurícula izquierda hacia el ápice. La posición ideal para la ligadura es aproximadamente 2 mm más baja que la punta de la aurícula izquierda. Utilice el tronco pulmonar como marcador para ayudar a identificar la aurícula izquierda y optimizar la visualización de la DA mediante la afluencia de luz (Figura 2).
2. Use una aguja cónica para pasar una sutura de polipropileno 7-0 alrededor del LAD. No coloque la aguja demasiado profunda, ya que puede entrar en el ventrículo izquierdo, ni demasiado superficial, ya que puede dañar la DA.
3. Retire el pequeño trozo de algodón y compruebe si el pulmón izquierdo sigue ventilado.
4. Retire el retractor de costillas.
5. Asegúrese de que la sutura tenga una longitud mínima de 15 cm en ambos extremos. Corta la aguja.
6. Coloque un trozo de tubo de PE-50 de 1 mm sobre un trozo de tubo de PE-10 de 15 mm (consulte la tabla de materiales). Guíe ambos extremos de la sutura a través del tubo de PE-10 y desplace el tubo de PE con su extremo más grueso contra el corazón.

5. Cierre torácico y extubación

1. Aplique un poco de gel de ácido fusídico en el espacio intercostal abierto y permita suavemente que el aire intratorácico restante escape obstruyendo brevemente el flujo de salida del ventilador. Se puede agregar gel de ácido fusídico adicional a la parte externa del tubo de PE para evitar la entrada de aire en el tórax.
2. Cierre el músculo pectoral con una puntada X de polipropileno 5-0 por encima y por debajo del nivel del tubo de PE y asegúrese de que la parte engrosada del tubo de PE esté por debajo del nivel del músculo.
3. Cierre la piel con dos puntos de polipropileno 5-0 X por encima y dos por debajo del tubo de PE (Figura 1B y Figura 3).
4. Con el pecho cerrado, el animal puede volver a respirar espontáneamente. Destetar al animal del ventilador reduciendo lentamente el volumen corriente y la frecuencia respiratoria. Cuando el animal comience a respirar, desconecte espontáneamente y con cuidado el tubo del ventilador, pero manténgalo en su lugar hasta que se observe un patrón de respiración estable.
5. Conecte el suministro de isoflurano con una nariz que se coloca sobre la nariz del animal y se fija en la placa base.

6. Montaje de la herramienta IR remota

1. Coloque la parte lateral vertical en la placa base insertándola en las ranuras.
2. Use un gancho fino para recuperar los dos extremos de la sutura y tire de ellos a través del orificio central en la parte lateral detrás del globo (consulte la Tabla de materiales).
3. Guíe uno de los extremos de las suturas por encima y alrededor del globo. Siga con el otro extremo de la sutura debajo y alrededor del globo. Aplique gel de ácido fusídico para una guía más suave de la sutura.
4. Guíe los extremos de la sutura a través de las ranuras en la parte superior de la parte lateral. En la parte distal de la sutura, aplique un peso de 2,1 g para mantener cada extremo de la sutura en su lugar (Figura 1C y Figura 4).
   NOTA: La configuración de los pesos apropiados está sujeta a cambios y debe probarse de antemano. Consulte la Figura complementaria 1 y el Archivo complementario 1 para obtener más detalles. El diseño de la herramienta IRI remota se proporciona en la Figura complementaria 2.

7. Inducción de isquemia y reperfusión

1. Inducir isquemia inflando rápidamente el balón con la bomba de balón vascular hasta 2 bar. Bloquee la bomba. Compruebe visualmente si el globo está inflado y si se han levantado las pesas (Figura 4).
2. Confirme la isquemia observando el cambio en la traza del ECG.
3. Dejar el globo inflado durante el tiempo establecido según el protocolo específico del estudio (30 min en los experimentos presentados).
4. Detenga la oclusión simplemente desbloqueando la bomba. Desinfla el globo con cuidado. Compruebe visualmente si el globo está desinflado y se han bajado los pesos.

8. Desmontaje de la herramienta IR remota

1. Corte la sutura y el tubo entre el animal y la parte lateral y retire con cuidado la parte lateral.
2. Aplique gel de ácido fusídico en el sitio de inserción del tubo en el tórax. Use pinzas curvas para empujar suavemente la piel contra el tubo y use otra pinza para extraer el tubo. Corta cualquier resto de sutura cerca de la piel.
3. Coloque una sutura adicional de polipropileno 5-0 para cerrar el sitio de salida del tubo y minimizar el riesgo de entrada de aire en el tórax.

9. Fin de la narcosis y recuperación

1. Detenga el suministro de isoflurano y permita que el animal se despierte en un ambiente silencioso, cálido y rico en oxígeno.
2. Confirme que el ratón no tiene ninguna dificultad respiratoria observándolo hasta que se recupere por completo. Proporcionar 0,3 mL de solución salina estéril (a temperatura corporal) mediante inyección intraperitoneal para prevenir la deshidratación.
3. Para la analgesia postoperatoria, administrar un analgésico opioide (buprenorfina, 0,1 mg/kg) por vía subcutánea antes de que el animal pueda ambular. Revise a los ratones cada 4-6 horas durante las siguientes 24-48 horas cuando se administre buprenorfina para asegurarse de que los ratones están respondiendo a los analgésicos y para determinar si se necesitan analgésicos adicionales. El apoyo adicional debe incluir un gel o puré de dieta de cuidados de apoyo estándar recomendado que se coloque en el piso de la jaula después de la operación.

Resultados

La validación de la capacidad de inducir isquemia se ha realizado mediante cuatro pruebas: tinción con cloruro de trifenilo tetrazolio (TTC) y Sirius Red (SR), medición de troponina I cardíaca y resonancia magnética con realce tardío de gadolinio (LGE). La significación estadística se evaluó mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney, considerando el tamaño limitado de la muestra. Se atribuyó significación estadística a p < 0,05.

Los experimentos agudos (tinción con TTC, n = 15) no tuvieron fallas técnicas y se incluyeron todos los animales. Estos experimentos agudos incluyeron experimentos de seguimiento inmediato (troponina cardíaca I, RESONANCIA MAGNÉTICA LGE, TINCIÓN CON ROJO DE SIRIUS, N = 12) y tuvieron una tasa de supervivencia del 85% y del 80% para las técnicas de oclusión remota y estándar, respectivamente, durante un período de 4 semanas.

Tinción con cloruro de trifenilo tetrazolio
La tinción con TTC (cloruro de trifenil tetrazolio) en un modelo murino de lesión por isquemia-reperfusión en el corazón mide macroscópicamente el fenómeno de la viabilidad miocárdica al mostrar la pérdida de función de la enzima deshidrogenasa. Este método de tinción ayuda a distinguir entre las áreas del corazón que aún son viables (vivas) y las que se han vuelto inviables debido a la isquemia. El miocardio viable se tiñe de rojo con TTC, mientras que el área isquémica permanece pálida o sin teñir porque la enzima deshidrogenasa ya no es funcional. Esto proporciona información crítica sobre la extensión del daño tisular temprano después del inicio de la isquemia. La tinción se realizó para los grupos de IRI estándar (n = 7) y IRI remoto (n = 8) inmediatamente después de 30 min de isquemia. La Figura 5 muestra cortes teñidos representativos para un animal, con cortes de tejido que atraviesan desde la base hacia el ápice. Los resultados de la tinción TTC se presentan en la Figura 6 y no muestran diferencias significativas entre las dos técnicas de IRI. La tinción TTC se realizó según lo descrito por Fishbein et ^al.7.

Resonancia magnética tardía con realce de gadolinio
Para medir de forma no invasiva la extensión del área isquémica, se empleó una RM con LGE 24 h después de la oclusión para los grupos de IRI estándar (n = 5) y IRI remota (n = 5). Los detalles de la adquisición se proporcionan en el Archivo Complementario 1. El área de riesgo se mide como el % de tejido del ventrículo izquierdo en los tres cortes más apicales que supera los criterios umbral detallados en el Archivo Complementario 1. La representación gráfica de la Figura 7 demuestra que no se observaron diferencias significativas entre la técnica de oclusión remota recientemente propuesta y el método convencional de "tórax abierto" al evaluar las mediciones del área en riesgo.

Tinción de Sirius Red
El infarto de miocardio, una consecuencia de la isquemia miocárdica, presenta un problema grave para las personas que experimentan isquemia porque resulta en una reducción de la masa contráctil del corazón, lo que afecta su capacidad para bombear sangre de manera eficiente. La Figura 8 explica con más detalle los hallazgos mediante el uso de la tinción Sirius Red 4 semanas después de la oclusión para confirmar la ubicación de la formación de la cicatriz en función del área en riesgo representada por la RM de LGE y medir la extensión del tejido cicatricial. La tinción se realizó para los grupos de IRI estándar (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Las áreas de color rojo brillante marcan el núcleo necrótico del infarto, mientras que las partes de color naranja marcan el tejido viable. Finalmente, la Figura 9 reporta los tamaños finales de las cicatrices medidos usando la tinción Sirius Red en ambas técnicas. El tamaño de la cicatriz se calcula dividiendo el área del infarto teñido por el área total de la pared libre del ventrículo izquierdo en la losa de la sección de tejido apical con un espesor de 2,4 mm. La tinción con Sirius Red se realizó de acuerdo con Rittié⁸.

Troponina I cardíaca
Además de las técnicas de imagen y tinción, el estudio también evaluó el daño cardíaco utilizando la troponina I cardíaca como marcador. Las muestras de sangre se recogieron a las 24 h después de la cirugía para los grupos de IRI estándar (n = 8) y IRI remoto (n = 8). En la figura 10 se muestra el valor de troponina I cardíaca, sin mostrar diferencias significativas al comparar la nueva técnica de oclusión remota con la técnica estándar de IRI.

Como demostración de la viabilidad del concepto propuesto, también se proporcionan resultados preliminares de la inducción de isquemia desde una ubicación remota con imágenes no invasivas simultáneas. Esto se logró utilizando la herramienta de oclusión remota hecha a medida, que se colocó dentro de la cuna del animal de resonancia magnética y se colocó en el centro del escáner de resonancia magnética. Los resultados mostrados en la Figura 11 muestran diferencias en el contraste de la imagen (niveles de brillo) entre las regiones infartadas y no infartadas. En la Figura 12B se presenta el trazado del ECG que muestra la elevación típica del ST como marcador que confirma la oclusión exitosa de la DA mientras el animal está posicionado dentro del escáner de RMN, mientras que en la Figura 12A se muestra el trazado del ECG antes de la oclusión.

Este enfoque integral proporciona una comprensión detallada de los efectos de la técnica de oclusión remota recientemente propuesta sobre la isquemia, la necrosis y el daño cardíaco en el modelo experimental en comparación con el método convencional de "tórax abierto".

Figura 1: Imágenes representativas que demuestran la preparación del animal según lo descrito en el protocolo. (A) Toracotomía con inserción de retractor de costilla. (B) Cierre del tórax con un tubo de PE-10 que sale del tórax y guía la sutura alrededor de la DA. (C) Posicionamiento del animal dentro de la herramienta IRI remota ensamblada. Obsérvense las dos pesas de 2,1 g que sujetan cada extremo de la sutura y descansan junto a la parte lateral de la base IRI remota. La parte lateral se coloca y se mantiene en su lugar mediante los recortes en la placa base de la herramienta. El catéter vascular con balón se desinfla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización ex vivo de la LAD (flecha blanca) y la aurícula izquierda (flecha negra) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Vista esquemática de arriba hacia abajo de la configuración experimental, que ilustra la posición de la herramienta utilizada para la oclusión remota. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Esquema que ilustra el uso de la herramienta para la oclusión remota desde una vista lateral. (A) Desde el inicio de la cirugía, el animal se coloca en la parte inferior. Después de cerrar el cofre, la parte lateral se instala en su lugar. En este punto, el balón todavía está desinflado y las pesas descansan sobre la parte inferior. (B) Inflar el catéter con balón levantará las pesas (marcadas con flechas) y causará la oclusión de la DA con la consiguiente isquemia del miocardio. La oclusión exitosa se observa en los cambios en la traza del ECG. Desinflar el globo restaurará el flujo sanguíneo a través del LAD. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes representativas de cortes de corazón de ratón teñidos con cloruro de trifenil tetrazolio (TTC). Las rebanadas atraviesan desde la base hasta el vértice de izquierda a derecha, comenzando en la fila superior. (A) IRI estándar. (B) IRI remoto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Resultados de la tinción TTC. La tinción TTC se realizó 24 h después de la oclusión para medir el tamaño del infarto. Los puntos de datos se presentan como medias con SEM de los grupos IRI estándar (n = 7) e IRI remoto (n = 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Resonancia magnética tardía con realce de gadolinio. Área en riesgo a las 24 h después de la oclusión, como se delinea en la mayoría de los tres cortes apicales (sin incluir el ápice en sí) obtenidos con LGE MRI. Los puntos de datos se presentan como medias con SEM de los grupos IRI estándar (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Validación del dispositivo de oclusión remota por resonancia magnética tras el procedimiento de isquemia/reperfusión. Comparación representativa entre el área en riesgo delineada en las imágenes de RM del LGE a 1 día después de la oclusión y el tejido cicatricial definitivo teñido con Sirius Red a las 4 semanas después de la oclusión. (A-B) Cortes de eje corto de un animal con oclusión remota y de banco, respectivamente. La flecha marca el área delimitada en riesgo. (C-D) Los cortes histológicos teñidos con Sirius Red de los mismos animales respectivos confirman que la formación final de la cicatriz coincide con la delimitación del área en riesgo con resonancia magnética a las 24 h después de la oclusión. VI = ventrículo izquierdo. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Resultados de la tinción de Sirius Red. La tinción con Sirius Red se realizó 4 semanas después de la oclusión para medir el grado de formación de la cicatriz. Los puntos de datos se presentan como medias con SEM de los grupos IRI estándar (n = 5) e IRI remoto (n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Cuantificación de la concentración cardíaca de troponina I en suero de ratón obtenida a las 24 horas después de la oclusión. Los puntos de datos de cTnI se presentan como medias con SEM de los grupos IRI estándar (n = 8) e IRI remoto (n = 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Se muestran los resultados preliminares obtenidos mediante la utilización de la herramienta de oclusión remota propuesta en combinación con la adquisición simultánea de resonancia magnética. Se presenta el mismo corte ventricular medio en la orientación del eje corto de un animal antes, en el momento y poco después de la oclusión. A la izquierda, el corte representativo de la imagen muestra los bordes miocárdicos al comienzo del experimento (antes de activar la IRI). En el medio, se muestra el mismo corte de eje corto después de 30 minutos de isquemia inducida a distancia. Se utilizó cloruro de manganeso (MnCl) como agente de contraste para resaltar la región infartada (marcada en amarillo). El brillo se ajustó y saturó manualmente para resaltar las diferentes regiones del tejido. Nótese la diferencia de brillo entre la pared libre septal y la lateral (marcada en amarillo). A la derecha, utilizando los mismos ajustes de brillo que antes, se muestra el mismo corte de eje corto a los 20 minutos después de la oclusión (etapa de reperfusión). La flecha indica la región con mayor brillo en comparación con el tiempo de oclusión, estipulando la absorción del agente de contraste en la etapa de reperfusión y la contracción de la región hipointensa inicial tal como se delineó en el momento de la oclusión. VI = ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Trazo de ECG capturado mediante el sistema de monitorización de RM para confirmar el inicio de la isquemia. (A) Trazo de ECG normal capturado antes de la oclusión remota. (B) Trazo de ECG capturado justo después del inflado del balón en el mismo animal. La flecha señala la elevación en el segmento ST, típicamente considerado un marcador de inicio exitoso de la isquemia. También se observa un aumento de la frecuencia cardíaca y respiratoria, además de una disminución de la amplitud de la señal. El animal se coloca en el centro del escáner de resonancia magnética en las etapas de oclusión y reperfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Configuración de pesos. Gráfico de todos los pesos en función del desplazamiento del dinamómetro utilizando el sistema remoto de globo (azul) vs. el sistema de poleas original (naranja). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Diseño de herramientas IRI remotas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 1: Detalle de las propiedades de la herramienta IRI y de las técnicas de adquisición y análisis de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La novedosa técnica de oclusión remota introducida en este estudio ofrece una plataforma única para avanzar en la investigación en el campo del modelado de lesiones por isquemia-reperfusión al evitar la necesidad de manipulación directa del vaso durante la cirugía inicial y permitir la obtención simultánea de imágenes multimodales del miocardio reperfundido temprano. La caracterización exhaustiva, que incluye mediciones de troponina-I, resonancia magnética con contraste LGE, TTC y tinción SR, muestra que la técnica propuesta es equivalente al estándar de oro actual (es decir, ligadura de DA a tórax abierto)⁹.

La técnica propuesta tiene múltiples ventajas sobre el enfoque tradicional de ligadura de DA "abierta". Principalmente, reduce el tiempo de un tórax abierto durante la cirugía a solo 15 minutos, en comparación con el tiempo de oclusión (30-60 minutos) más el tiempo quirúrgico (15 minutos) requerido en el enfoque tradicional. Esta cirugía a corazón abierto minimizada puede mitigar el daño tisular y la inflamación, pero necesitaría más investigación. Además, el cierre precoz de la toracotomía permite el destete del ventilador, lo que permite la respiración espontánea bajo isoflurano durante los experimentos de isquemia-reperfusión. Esto tiene el potencial de disminuir la lesión pulmonar inducida por el ventilador y la inflamación asociada, al tiempo que permite una respuesta fisiológicamente más precisa a la isquemia miocárdica y la reperfusión¹⁰.

Además, la técnica de oclusión remota ofrece un mayor control sobre el momento exacto de la inducción de la isquemia. Como prueba de concepto, se demostró la factibilidad y los resultados preliminares de inducir y controlar la isquemia miocárdica a distancia, mientras el animal se colocaba en el centro del escáner de resonancia magnética. La capacidad de iniciar con precisión la isquemia después del cierre del tórax permite a los investigadores cronometrar las intervenciones terapéuticas o las investigaciones adicionales y sincronizar la agresión isquémica entre los sujetos experimentales. Este mayor control puede conducir a una inducción más precisa y consistente de la IRI, que es fundamental para los estudios mecanicistas y terapéuticos. Sin embargo, la extensión marginal de la inhalación de isoflurano durante la configuración de la resonancia magnética cardíaca podría representar una limitación para este estudio. Es decir, la exposición prolongada al isoflurano podría tener efectos cardioprotectores adicionales, como se ha demostrado en estudios murinos, y requeriría más investigación para el modelo propuesto¹¹.

La variación en el grado de la lesión inducida es un desafío común en los modelos IRI, que a menudo surge de diferencias en la ejecución quirúrgica o en la anatomía variable¹². Es importante destacar que la formación adecuada del cirujano tendrá un impacto en las tasas de mortalidad en este modelo, más allá de otras variables reconocidas, como la ubicación de la DA, la duración experimental, las cepas de ratones y los antecedentes genéticos¹³. La elección de agentes anestésicos y analgésicos también puede influir en los resultados. Por experiencia, este modelo exhibe una tasa de mortalidad general cercana al 15%. La implementación de un manejo riguroso del dolor y un monitoreo vigilante de los animales puede reducir aún más la mortalidad.

Una de las direcciones convincentes indicadas por este trabajo es la aplicación potencial de la técnica de oclusión remota en la evaluación de intervenciones terapéuticas en las primeras fases de oclusión o reperfusión.

En conclusión, la técnica de oclusión remota representa un avance prometedor en el modelado de IRI, que podría refinar los estudios mecanicistas y acelerar las terapias dirigidas. Su capacidad para reducir el trauma quirúrgico, mejorar el control sobre el momento de la isquemia y mejorar la consistencia experimental subraya su importancia. Al explorar más a fondo la adaptabilidad de la técnica, los investigadores pueden desbloquear todo su potencial y contribuir a una comprensión más precisa de las primeras fases de la inducción de la isquemia, la reperfusión y la lesión por isquemia-reperfusión que la acompaña. Además, ahora se puede observar el efecto de diferentes estrategias de tratamiento durante estas etapas iniciales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-0 sutura de seda	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 sutura de polipropileno	Ethicon	8710H
7-0 sutura de polipropileno	Ethicon	8206H
ACCLARENT Dispositivo de inflado con balón	Johnson& Johnson MedTech	BID30
Acepromazina	Kela
BD Vialon 18 g	BD	381347
BD Vialon 20 g	BD	381334
Betadine Solution	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprenorfina (inyectable Buprenex)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carpa Zoom Styl Knijplood 2.1 g (pesos de pesca de plomo)	Visdeal.nl
Pinzas Dumont #3	Herramientas de Ciencia Fina	11231-30
Dumont #5 Pinzas	Herramientas de Ciencia Fina	11251-30
Tijeras Finas Herramientas de	Ciencia Fina	14040-10
Gel de Fucidina	Leo Pharma
Isoflurano	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Espéculo de ojo de rata/rata	World Precision Instruments	501897
Espéculo de ojo de rata/rata KD	World Precision Instruments	501897
Ketamina	Dechra Fuente de
luz	Zeiss	KL 1500 LCD
Sistema de resonancia magnética	Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0.9%	Baxter
Lámpara de calor infrarroja nocturna	Zoo Med Laboratories, Inc.	RS-75
ParaVision	Bruker BioSpin	versión 6.0.1
tubo de polietileno PE-10	SAI Tecnologías de infusión	PE-10
tubo de polietileno PE-50	SAI Tecnologías de infusión	PE-50
herramienta IRI remota (PMMA)	casero
Monitor quirúrgico para roedores	Instrumentos
Segmento v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Secuencia de eco de gradiente autocompuertada	Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Portaagujas alargado delgado	Fine Science Tools	12005-15
Cámara de inducción para ratón/rata Sure-Seal	World Precision Instruments	EZ-178
Conectores de tubos, polietileno, forma de Y	Westlab	072025-0001
Catéter de dilatación Ultraverse 035 PTA: 5 mm x 40 mm, balón RBP de 17 ATM en catéter de 130 cm de largo	Bard Peripheral Vascular, Inc.
Veet (crema depilatoria)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilador, MiniVent Modelo 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xilacina	Bayer

Software Indus00801741092671